근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

요약

이 프로토콜은 근이영양증 환자로부터 소변 유래 세포를 분리하기 위한 상세한 절차를 수반하며, 센다이 바이러스 형질전환(Sendai virus transduction)을 통한 효율적이고 신속한 재프로그래밍

을 수반합니다.

초록

이영 심근 병증은 근육 이영양증 제대로 이해 결과이다. 근이영양증 환자에서 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하면 체외 질병 모델 시스템을위한 귀중한 셀룰러 소스 및 약물 검사 연구에 사용할 수 있습니다. 환자 뇨 - 유래 세포는 ¹ 이영양증 ^심근증을 모델링하기 위해 유도 된 다 능성 줄기 세포로의 성공적인 리 프로그래밍에 사용되어왔다. 벡터 시스템을 통합의 안전성 문제를 해결하는, 우리는 야마나카의 전달은 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포에 인자 비 통합 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 완전히 2-3주 내에서 클론을 재 프로그램 생성합니다. 만능 세포 통로 (13)에 의해 벡터 무료입니다. 이 이영 iPSCs는 심근 세포로 분화 및 질병 메커니즘 또는 약물 검사에 대한 공부를 사용할 수있다.

서론

심근증은 뒤 시엔 느와 베커 근이영양증 (MD) 환자에서 두 번째로 높은 사망 원인이다. X-연결 디스트로핀 유전자의 돌연변이가 하나 발생하더라도 3,500 남성 출산, 약간은 진보적 인 심장 근육 손상을 유도하는 분자 및 세포 이벤트에 대한 알려져있다. 근이영양증 환자 유래의 인간 유도 다 능성 줄기 세포는 기저 질환 메커니즘을 연구 약물 ^{1,2- 스크리닝에} 사용하는 신규 한 도구로 나왔다.

피부 조직 검사 또는 혈액 샘플의 예상되는 불편 함은 연구 참여에 대한 동의를하는 젊은 환자 및 / 또는 보호자를 설득 할 수 있습니다. 소변 샘플은 리 프로그래밍을 수정할 수있는 방법이다 체세포 비 침습적 원천이다. 우리는 최근 근이영양증 환자로부터 수집 된 소변 세포를 배양 할 수 있다는 것을 도시하고 효율적 야마나카 인자를 사용하여 레트로 바이러스 형질 도입 iPSCs (내로 재 프로그램 한OCT3 / 4, SOX2, Klf4 및 c-Myc와; OSKM) ^1. 레트로 바이러스 유전자 전달의 단점은 숙주 염색체로 유전자의 재 프로그래밍 랜덤 통합이다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 소변 세포 리 프로그래밍에 대한 비 통합 센다이 바이러스를 사용 하였다.

이 프로토콜은 추가 연구를위한 심근 세포 또는 다른 종류의 세포로 분화 할 수 근이영양증 환자의 격리 소변 세포의 센다이 바이러스의 재 프로그래밍에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 특정 환자 다른 질환을 위해 더 적응 될 수있다.

프로토콜

참고 : 환자 및 / 또는 보호자는 연구를 승인 심사위원회 (Institutional Review Board)에 참여하는 동의를 제공해야합니다.

1. 버퍼 및 미디어 준비

1. 세척 버퍼 : 세척 버퍼 100 ㎖를 준비 인산염 완충 식염수 (PBS)의 99 ml의 100 배 펜 / 연쇄상 구균 솔루션 (스트렙토 마이신의 100 U / ml의 페니실린이 + 100 μg의 / ㎖) 1 ㎖를 추가합니다.
2. 소변 전구 세포 (UPC) 중간 : UPC 미디어를 준비 케 라티노 세럼 무료 (KSF) 중간 + 전구 세포 매체의 동일한 볼륨을 혼합합니다.
   1. KSF 중간 : 표피 성장 인자의 5 ng를 / ㎖ (EGF), 소 뇌하수체 추출물의 50 ng를 / ㎖ (BPE), 콜레라 독소의 30 ng를 / ㎖, 펜 / 연쇄상 구균 용액 (100 U를 추가, 각질 세포 미디어를 준비 / ml의 페니실린 500 ml의 KSF 매체, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신).
   2. 전구 세포 매체 : FBS, 0.4 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 0.1 햄 F12 미디어의 1/4과 DMEM의 4 분의 3에 추가하고 10 % 보완nM의 콜레라 독소, 5 NG / ml의 인슐린, 1.8 × 10 ^-4 M 아데닌, / ㎖ 트랜스페린, 2 × 10 ^-9 M의 triiodo의 로닌, 10 NG / ml의 EGF, 펜 / 패 혈성 솔루션 5 μg의.
3. 배아 줄기 중간 : 20 % KO-세럼 교체 (K-SR), 1X MEM 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 100 μM의 β 머 캅토 에탄올, 20 NG / ㎖의 bFGF 및 펜 / 패 혈성 추가 400 ㎖의 DMEM / F12 배지.

2. 소변 샘플 컬렉션

1. 소변 적절한 양의 (~ 30 ~ 40 ml)을 수집 할 수 있도록 소변 컬렉션에 30 분 전에 음료수를 마시지하는 환자를 지시합니다.
2. 환자 및 / 또는 보호자 다음 항목이 포함 된 소변 수집 키트를 제공한다 : (1) 멸균 또는 클린 캐치 소변 샘플을 구하는 방법에 대한 작성 지침, (2) 습기 항균 toilettes, (3) 100 ml의 멸균 표본 수집 컵. 샘플을 수집하는 환자를 지시합니다.
3. 즉시 얼음에 소변 샘플을 배치하고 LABORA로 전송쿨러 토리. 즉시 세포 분리를위한 소변을 처리합니다. 지연이 불가피한 경우, 세포 생존 능력의 손실을 최소화하면서 최대 4 시간 동안 얼음에 표본을 저장합니다.

3. 분리 및 소변 세포의 확장

참고 : BSL2 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.

1. 멸균 피펫을 사용하여, 전송 소변 샘플은 50 ml의 원심 분리 튜브 멸균한다. RT에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리한다.
2. 튜브에 1 ㎖를 떠나 뜨는을 기음; 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오.
3. 재현 탁은 세척 완충액 7 ㎖ 중에 다중 튜브의 펠렛을 결합하고 RT에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리를 반복하고.
4. 조심스럽게 세포 펠렛 및 상등액 ~ 0.2 ~ 0.5 ml를 떠나, 뜨는을 대기음. 소변 전구 세포 (UPC) 매체의 2-3 용액에 재현 탁과 유엔의 4-6 우물에 정지를 전송코팅 된 24 웰 플레이트.
5. 72 시간 후, 잘 당 신선한 UPC 매체의 0.5 ml의 문화를 보완하고 2 ~ 3 일 후에 매체 변경합니다. 판에 부착하지 않는 적혈구 및 편평 상피 세포 매체 변화에 제거됩니다.
6. 4-6일 후 문화를 모니터링합니다.
   참고 : 작은 2-4 세포 식민지가 나타 시작합니다. 세포는 둥근 또는 유형 I 또는 신장 상피 (RE) 세포를 각각 ³ 종류 II를 대표하는 연장됩니다.
7. 세포가 표시되면, 그들은 빠른 확장 단계를 거쳐야하기 때문에 2-3 일마다 매체를 변경합니다.
8. 세포가 80-90 %, 도금 후 약 9-15일에 도달하면, 추가 확장 24 웰 플레이트의 2-4 우물에 세포 (15,000-18,000 세포 / cm ²⁾ 해리와 통로. 세포 통로 1 (P1)로이를 표시합니다.
9. 유세포 분석을 통해 혈통 사양 소변 세포를 특성화, immunohistochem적인 염색 또는 역전사 효소 - 중합 효소 연쇄 반응을 통한 (RT-PCR).
10. 장기 cryostorage에 대한 (DMEM 10 % 혈청과 10 % DMSO로 보충) 절연 소변 세포 (섹션 4)를 다시 프로그램 또는 중간 동결에 그들을 동결.

센다이 바이러스를 사용하여 4. 소변 세포 재 프로그래밍

참고 : 트랜 에이전트를 조작하는 동안 적절한 취급과 PPE (개인 보호 장비)를 사용하는 것이 좋습니다. BSL2 생물 안전 캐비닛에서 무균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. 에이전트 및 / 또는 형질 감염된 세포를 형질의 적절한 폐기는 환경과 건강 위험의 위험을 방지하는 것이 좋습니다. 아래에 설명 된대로 소변 세포 재 프로그래밍은 제조업체의 공급에 의존하는 프로토콜의 수정 센다이 리 프로그래밍 키트를 사용합니다.

1. 센다이 바이러스를 사용하여 고효율의 리 프로그래밍을 보장하기 위해 사용되어 신속한 뇨 세포 1-5 통로해동 분할. 세포가 잘 복제하거나 노화가되지 않는 경우가 효율적으로 재 프로그래밍되지 않으므로 취소하십시오.
2. 시드 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 60,000 세포. 마크 일 -2이. 셀 시드 농도를 조정 (5 × ^10월 4일에서 9일까지 × 10 ⁴ 세포 아니라 당) 일 0으로 80-90 %에 도달하기 위해 필요에 따라.
3. 0 일째 (셀 도금 후 48 시간)에서, 네 OSKM 요소 각각을 함유 센다이 리 프로그래밍 벡터 (SEV)을 제조. 미리 예열 UPC 매체의 1 ml의 벡터의 각을 추가합니다. 프로그램을 다시 소변 세포에 충분한 1.5의 MOI (5-7.5 × 10 ⁵ CIU)를 사용합니다. 매체를 대기음 천천히 소변 세포의 잘 하나에 1 ml의 UPC + SEV를 추가합니다. 전달 음성 대조군으로 두 번째 잘 사용합니다.
4. 1 일에, 신선한 UPC 매체와 UPC + SEV 매체를 교체합니다. 일부 세포의 죽음으로 인해 바이러스의 세포 독성에 24 시간 후에 볼 수 있습니다.
5. 재 프로그램 클론의 효율성에 따라전자 형성하고 컴팩트 한 형태는 하루 6 또는 7까지 매일 매체를 계속 변경.
6. 이전에 형질 세포 (5 일 또는 6), 미토 마이신 C (3 시간 10 ㎍ / ㎖)을 0.1에 5 × ¹⁰⁴ 세포 / cm ^2의 밀도에서 처리-MEFs에 도금하여 MEF 피더 플레이트를 준비 해리에 어느 날 % 젤라틴은 100mm ² 배양 접시를 코팅.
7. 다음 날 (6 또는 7 일), 0.25 % 트립신으로 세포를 해리 UPC 매체 플레이트 5 × ¹⁰⁴ 세포에 재현 탁 - 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ^100mm이 MEF 피더 플레이트.
8. 다음 날, 배아 줄기 매체로 전환 한 매체 매일을 변경합니다. 형질 전환 된 세포를 모니터링 현미경으로 세포를 관찰한다.
   참고 : 세포 특성 조약돌 형태와 세포질 비율이 더 높은 핵을 가진 (12-18일 게시물 전달)와 클론 집계를 형성한다.
9. 2~3주 내에서 전달 후, 식민지를 선택하고 클론에 대한 새로운 접시로 전송알 확장.
10. 37 ℃에서 1 시간 동안 TRA-1-81 항체로 세포를 배양하여 IPSC 클론을 선택하기위한 생균 염색을 수행 ° C에서 CO는 CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 시간 동안 특정 형광 염료와 접합 된 이차 항체 염색에 의해 대향 _{인큐베이터} 하였다.
11. 에 26 G 1.5 인치 바늘을 사용하여 작은 동일한 크기의 조각으로 큰 TRA-1-81 긍정적 인 IPSC 클론 (복제 당 4-6 개) 크로스 - 부화.
12. 선택 및 전송 매트 리겔의 각 웰 (10 ㎍ / cm ^2)으로 여러 클론에서 10 ~ 20 크로스 해치 조각 배아 줄기 매체 24 웰 플레이트를 코팅 처리하는 멸균 피펫 팁을 사용합니다.
    참고 : 하나의 우물에 개별적으로 도금 단일 클론에서 조각 확장 또는 능성을 유지하지 않습니다.
13. 재 프로그래밍 클론 마트 리젤의 표면에 부착 한 후 IPSC 매체에 배아 줄기에서 24 ~ 48 시간을 변경합니다.
14. 마트 리겔 코팅 플레이트, 수동 scra 유지 보수시PE-오프 완전히 재 프로그래밍과 만능 이영 IPSC (MD-IPSC) 클론 풍부하게 피펫 팁을 사용하는 차별화 된 세포 또는 오염 MEF 피더 세포를.
15. 개별 클론 ~ 100 ㎛의 크기에 도달 한 후, 3 분 동안 0.48 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 용액으로 해리 및 IPSC 배지에 현탁 MD-iPSCs 작은 세포 집합체를 도금함으로써 클론 확장 (5 μM Y27632, RHO 키나제 보충 억제제 ) 신선한 마트 리겔 (10 ㎍ / cm ²⁾ 12 웰 플레이트를 코팅. 매일 IPSC 매체를 변경합니다.
16. 각 클론의 완전한 리 프로그래밍은 OSKM 유전자 및 다 능성 마커 (OCT3 / 4, TRA-1-81)의 면역 조직 화학 염색을 모두 유전자 발현 분석에 의해 결정될 수있다. 만능 전위의 엄격한 평가가 완전히 재 프로그램 IPSC 라인 세 배엽으로 분화 할 수 확인하기 위해 채용되어야한다. 이 배아 체 (EB) 형성과 분화 분석 또는 운에 의해 중 수행 할 수 있습니다atoma 형성 분석법.

결과

(각각 97.37 %, 97.09 %, 97.3 %; 그림 1A 및 1B) 인간의 소변에서 분리 된 대부분의 전구 세포는 CD44, CD73, 및 CD146 등 uroepithelial 전구 및 혈관 주위 세포 마커에 대한 긍정적이다. 이 세포는 또한 알파 - 평활근 액틴과 멘틴 (그림 1B)와 같은 다른 중간 엽 마커를 표명했다. RT-PCR 분석 아세포-7의 약한 표현이 점에서 문화 세포의 혼합 인구의 증거를 제공합니다 (CK-7) 및 Uroplakin (UP) -ia 및 -IIIa, uroepithelial 혈통의 마커 (그림 1C).

재 프로그래밍 단계는도 2a에 개략적으로 나타내었다. 대표적인 이미지는 프로토콜 (도 2B)에 걸쳐 상이한 시점 동안 세포의 형태를 보여준다. 소변 세포는 연...

토론

iPSCs를 사용하여 심혈관 질환을 모델링하는 것은 유전 적 기여 ^4-6를 이해하는 일반적인 방법이되고있다. 환자 세포로부터 샘플을 얻는 몇몇 예상치 못한 문제, 특히 어린 아이들, 이러한 소변 수집 같이 비 침습적 접근하는 옵션을 제공함으로써 회피 할 수있다. 이 젊은 환자 집단에서, 재 프로그래밍을위한 충분한 세포 소변을 수득하기에 충분한 양의 소변을 수집하는 것이 곤란하다. 유체에게 소변 수집하기 전에 30 분을 마시는 젊은 환자 코칭 소변 세포 분리의 성공을 향상시킨다. 그러나, 반복 소변 컬렉션이 인구에 필요할 수 있습니다. 우리는 합하고 근이영양증 환자에서 UCS의 분리 및 배양을 최적화하기 위해 두 개의 서로 다른 프로토콜을 ^3,7-을 적응.

유도 된 다 능성 줄기 세포는 근육 이영양증의 patien로부터 피부 섬유 아세포 또는 소변 중 세포에서 생성 된TS ^1,2. 그러나 두 리 프로그래밍 프로토콜은 체...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Materials
4 Oz. 뚜껑이 있는 표본 컵	STL 의료 공급	M9AMSAS340	소변 샘플 수집용
15 ml BD-Falcon 튜브	Fisher Scientific	352097
50 ml BD-Falcon 튜브	Fisher Scientific	352098
라운드 글라스 커버슬립	Fisher Scientific	12-545-81
CytoTune-iPS Sendai 재프로그래밍 키트	Life Technologies	A1378-001
PBS, pH 7.4	Life Technologies	10010-023
Pen-Strep w/o Glutamine	Life Technologies	15140-122	웜 인 37 ° C 사용 전 수조
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 ° C 사용 전 수욕
B-27 보충제 w/인슐린 (50x)	Life Technologies	17504-044	37°C에서 따뜻하게 하세요; 사용 전 C 수욕
B-27 보충제 인슐린 없음 (50개)	Life Technologies	0050129SA	37°C에서 따뜻하게 하세요. C 사용 전 수조
DMEM/F12 (1:1)	Life Technologies	11330-032	37°C에서 따뜻하게 합니다. C 사용 전 수조
Versene, 1:5,000	Life Technologies	15040066	37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
bFGF (10 &마이크로; g)	Life Technologies	13256-029	Warm in 37 ° C 사용 전 수욕
셀 카운터 카트리지	Life Technologies	C10228
녹아웃 세럼 (500  ml 병)	Life Technologies	10828-028	Warm in 37 ° C 사용 전 수조
회수 세포 배양 냉동 매체	생명 기술	12648-010
각질 세포-SFM (1x), 액체	생명 기술	17005-042	따뜻한 37 ° 사용 전 C 수조
DMEM, High Glucose, Glutamax	Life Technologies	10566-016	37°C에서 따뜻하게 해; 사용 전 C 수욕
Ham's F-12 영양 혼합물	Life Technologies	11765-054	Warm in 37 ° C 수조 사용 전
EGF 재조합 인간 단백질, 액체 형태	생명 과학 PHG0311L		37 °에서 따뜻하게; 사용 전 C 수욕
인슐린, 인간 재조합, 아연 Soln	Life Technologies	12585-014	37 °에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
TeSR-E8	Stem Cell Technologies	5940	Warm in 37 ° C 사용 전 수조
ROCK 억제제 (Y-27632)	Selleck	S1049	37 °에서 따뜻한; 사용 전 C 수조
Matrigel	BD Biosciences	354277	hESC 인증 매트릭스, LVED Free
RNeasy 미니 키트	Qiagen	74104
iScript cDNA 합성 키트	Bio-Rad	170-8890
DreamTaq Green PCR 마스터 믹스 (2x)	Thermo-Scientific	K1081
FBS 인증	Sigma Aldrich	F6178	Warm in 37 ° C 사용 전 수조
아데닌 바이오 시약	시그마 알드리치	A2786-5G	37 °에서 따뜻한; C 수조 사용 전
콜레라 독소 Vibrio cholerae	Sigma Aldrich	C8052-.5MG 37	C에서 따뜻하게 사용 전 C 수조
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0888-1G	37°C 웜 C 물 목욕 사용 전
홀로 트랜스페린 인간	시그마 Aldrich	T0665-50MG	따뜻한 37 ° C 사용 전 수조
3,3',5-Triiodo-L-thyronine 나트륨 염	Sigma Aldrich	T6397-100MG	37°C에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조
DAPI	Santa Cruz Biotechnology	SC-3598
플루오로마운트 Aquous 장착 매체	Sigma Aldrich	F4680
16% 파라포름알데히드	Alfa-Aesar	43368
Antibodies
Mouse anti CD44 - FITC로 표시되어 있음	BD Biosciences	560977
마우스 안티 CD146 - PE	BD Biosciences	561013
마우스 안티 CD73 - PE	BD Biosciences	561014
마우스 안티 -&알파 라벨링;-평활근 액틴	시그마 Aldrich	A2547
마우스 안티 Vimentin	Abcam	ab8978-100
마우스 안티 - TRA-1-81	Life Technologies	411100
토끼 안티 Oct 3/4	Santa Cruz Biotechnology	SC-9081
마우스 안티 디스트로핀	Leica Biosystems	NCL-DYSB