방법 논문

대안으로 설하 면역 요법은 급성 호흡기 감염에 대한 보호를 유도하기 위해

18.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52036

⸱

2014년 8월 30일

 ,  ,  , 
1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

이 논문에서

요약

본 연구는 폐의 선천성 면역 반응을 촉진하고 마우스의 급성 폐렴구균성 폐렴을 예방하기 위해 설하 면역요법을 사용하는 것의 편리함을 보여줍니다.

초록

설하 경로는 작은 분자를 혈류로 전달하고 다른 부위에서 면역 반응을 조절하는 데 널리 사용되었습니다. 그것은 전신 및 점막 부위, 즉 폐와 비뇨 생식기에서 체액성 및 세포 반응을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났습니다. 설하 백신 접종은 하부 및 상부 호흡기에서 감염에 대한 보호를 촉진할 수 있습니다. 또한 알레르기 항원에 대한 내성을 촉진하고 천식 증상을 개선할 수 있습니다. 설하 면역요법(SLIT)에 의한 폐의 면역 반응 조절은 잠재적으로 유해한 분자를 기도로 직접 전달할 필요가 없기 때문에 비강 내 경로를 통한 제형의 직접 투여보다 안전합니다. 비강 내 분만과 대조적으로, 뇌 독성 또는 안면 마비와 같은 부작용은 SLIT에 의해 촉진되지 않습니다. SLIT의 기저에 있는 면역 메커니즘은 여전히 파악하기 어려우며 급성 폐 감염 치료를 위한 용도는 아직 연구되지 않았습니다. 따라서 SLIT의 잠재적 이점을 더 탐구하기 위해 적절한 SLIT의 동물 모델 개발이 필요합니다.

이 연구는 급성 폐렴구균성 폐렴으로부터 보호할 수 있는 능력을 평가하기 위해 마우스에서 치료제의 설하 투여를 수행하는 방법을 보여줍니다. 설하 접종 중 마우스 취급의 기술적 측면, 설하 점막의 정확한 식별, 림프절 배출 및 조직, 기관지 폐포 세척 및 폐의 격리가 설명되어 있습니다. FACS 분석을 위한 단일 세포 현탁액 준비를 위한 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다. 면역 반응 분석을 위한 다른 다운스트림 응용 분야에 대해 논의합니다. 연쇄상 구균 폐렴 접종 준비 및 마우스의 비강 내 챌린지의 기술적 측면도 설명됩니다.

SLIT는 폐의 면역 반응을 조절하기 위해 후보 분자를 스크리닝할 수 있는 간단한 기술입니다. SLIT의 성공에 영향을 미치는 매개변수는 분자 크기, 분해에 대한 민감성 및 고농축 제형의 안정성과 관련이 있습니다.

서론

이 연구의 전반적인 목표는 급성 호흡기 감염(ARI) 치료를 위한 설하 면역요법의 이점을 설명하고 다른 투여 경로, 즉 비강 내 투여 경로와 비교하여 이 전달 경로의 장점을 제시하는 것입니다.

ARI는 특히 5세 미만의 어린이에게 매년 수백만 명의 사망을 초래합니다. 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 영유아 및 노인에서 세균성 폐렴의 주요 병인항제 중 하나로 남아 있다1,2. 현재 사용 가능한 주요 치료법은 항생제 사용에 의존하지만 내성 균주가 지속적으로 발생하고 있습니다3,4.

SLIT는 전신 및 점막 수준, 특히 호흡기에서 광범위한 반응을 유도합니다5. 인플루엔자 감염에 대한 효과가 입증되어 체액성 및 세포 반응 생성으로 장기적인 보호를 촉진합니다6,7. 또한, 설하 경로를 통해 전달되는 세균 용해물을 이용한 예방적 치료는 노인의 만성 폐쇄성 기관지염의 악화를 감소시키고8 소아의 재발성 호흡기 감염을 예방하는 것으로 나타났다9. SLIT는 알레르기 및 천식 치료에 널리 사용되었습니다. 임상 연구에서는 호흡기의 면역 반응을 조절하는 효능뿐만 아니라 안전성도 입증되었다10. SLIT에 대한 제약 회사와 연구자들의 관심이 높아지고 있음에도 불구하고, 화합물의 설하 전달 후 점막 면역 반응 유도와 관련된 메커니즘은 여전히 모호합니다. 최근에는 알레르기 항원 탈감작과 관련된 내성을 촉진하는 메커니즘에 관심이 집중되고 있습니다. 수지상 세포 및 대식 세포와 같은 설하 점막에 상주하는 세포와 모집된 세포가 SLIT11-13 이후에 내성을 촉진할 수 있다고 제안되었습니다. 구강 점막의 수지상 세포는 IFN-감마 및 IL-10을 촉진하여 T 보조 세포(11)를 생성할 수 있을 뿐만 아니라 원위 생식기 점막으로 재순환하여 CD8+ T 세포(14)를 촉진할 수 있습니다. 그러나 SLIT가 선천성 세포에 미치는 영향이나 급성 호흡기 감염 시 병원체 제거를 개선하는 능력에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

폐 내 폐렴구균 감염의 자연적 통제는 국소 선천성 방어의 효율적이고 신속한 활성화에 크게 좌우됩니다. 우리는 이전에 TLR5 및 NLRC4 작용제인 편모(FliC)를 비강 내 1회 투여하여 폐의 선천성 면역을 강화하면 폐렴구균 혈청형 1의 임상 분리물을 치사량으로 투여한 쥐의 75-100%를 보호할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 보호는 GR1+ 세포(다형성핵 호중구, PMN으로 추정)의 국소 동원에 의존하며 항체, B 세포 또는 T 세포에 의존하지 않는 것으로 나타났습니다15.

편모는 박테리아 편모의 구조적 구성 요소입니다. 단량체 형태에서는 두 개의 병원체 인식 수용체(PRR), 즉 세포외 FliC16을 감지하는 TLR5와 세포 내 편모를 감지하는 NLRC4/NAIP5 인플라마솜17,18에 의해 인식됩니다. PRR에 의해 FliC가 감지되면 중요한 염증 반응이 유발됩니다. 우리와 다른 사람들은 Salmonella enterica serovar Typhimurium에서 정제된 FliC를 폐에 주입하면 폐의 상피에 의해 인식될 때 특히 chemokine 및 cytokine의 신속한 생산을 유도하여 주로 PMN15,19-21과 같은 기도로 면역 세포의 동원을 조율한다는 것을 입증했습니다. 일시적이기는 하지만, FliC의 비강 전달 후 기도로 발생하는 상당한 호중구 침투는 인간을 위한 임상 요법으로 옮겨갈 경우 우려가 될 수 있습니다. 과도한 염증은 폐 기능에 해로울 수 있습니다. 더욱이, 면역자극 분자의 비강 내 전달은 안면 마비 및/또는 뇌 독성을 유발할 수 있는 것으로 나타났습니다22-24.

설하 면역요법은 비강 내 면역요법에 비해 호흡기의 면역 반응을 조절하는 더 안전한 대안을 제공합니다. 비침습적이고, 통증이 없고, 단순하며, 환자 순응도가 우수하다25. 또한, 앞서 언급했듯이 제형의 직접적인 비강 내 또는 폐 내 전달과 관련된 위험 없이 호흡기 점막에서 보호 반응을 유도할 수 있습니다. 설하 경로는 폐의 면역 체계에 큰 영향을 미치지만 독성이 입증되었거나 비강 내 투여 시 큰 염증을 유발하는 것으로 입증된 분자를 전달하는 데 대안적으로 사용될 수 있습니다. 이러한 장점 외에도 설하 면역요법을 위한 제형은 비멸균 제품이 이 경로로 전달될 수 있고 내독성 쇼크가 SLIT에 대한 우려가 없기 때문에 제조 비용이 저렴합니다. 다른 한편으로는, 비강 내 또는 비경구 경로에서 사용되는 것과 비교하여 더 높은 용량의 면역 자극 화합물이 폐에서 면역 반응을 유도하는 데 필요하다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 또한 SLIT의 마우스 모델을 사용할 때 제형이 침착되는 해부학적 부위가 작기 때문에 고농축 용액이 필요합니다.

이전에 발표된 데이터를 바탕으로 편모를 모델 면역자극제로 사용하는 설하 면역요법을 사용하여 보호 모델을 개발했습니다. 우리는 편모를 1회 투여하면 혈청형 1 균주에 의한 침습성 폐렴구균성 폐렴에 대해 60%의 생존율을 유도했으며, 대조군의 모든 마우스는 5일 이내에 감염으로 사망했음을 입증했습니다. 유세포 분석 분석은 편모를 사용한 설하 치료 후 보호 동물의 기도로 더 많은 수의 PMN이 동원되는 것을 보여주었으며, 이는 이러한 세포가 설하 면역 요법에 의해 유도되는 보호 메커니즘에 관여할 수 있음을 시사합니다.

이 비디오는 설하 면역 요법을 수행하는 방법과 설하 점막에서 관련 조직을 회수하여 림프절과 폐 및 기도를 배출하여 추가 분석을 수행하는 방법을 자세히 보여줍니다. 또한 FACS 분석을 위한 세포 준비의 일반적인 기술을 설명하고 연쇄상구균 폐렴균 현탁액을 준비하는 방법과 마우스에서 비강 내 감염을 수행하여 급성 감염 모델을 설정하는 방법을 간략하게 보여줍니다.

프로토콜

우루과이 - 동물과 관련된 절차는 동물 실험에 대한 명예위원회와 의학의 학교, 대학교 드 라 리 퍼블 리카의 지침위원회의 승인을 071140-000821-12와 08,052,010 ° 프로토콜 N에 따라 수행 하였다.

치료제의 1 설하 관리

  1. 치료제를 함유하는 용액을 제조 테스트 할. 마우스 당 10 μL의 최대 볼륨을 administrate하기 위해 농도를 조정합니다.
    참고 : 살모넬라 엔테의 혈청 형에서 정제 편모를 들어 S의 첫번째 치사량에 감염된 마우스에서 보호를 유도 할 수있는 최적의 복용량을 티피 뮤 리움 폐렴 구균 혈청 형 1 E1586은 100 % 사망 원인은 10 μg / 마우스이다. 편모 솔루션은 단량체의 방출을 보장하기 위해 5 분 동안 65 ° C로 가열해야합니다. 편모 정화에 대한 자세한 내용은 참조 26를 참조하십시오.
    1. 바르그것의 분자 크기, 순도, 단백질 분해에 대한 감수성과 점막 부착 제의 사용에 따른 다른 면역 에이전트 Y 유효 농도. 각 화합물의 효과를 극대화하기 위해 테스트 할 최적의 농도를 조정합니다. 비내 경로에 의한 이전의 연구는 특정 화합물에 대해 실시 된 경우, 설하 경로에 의해 그것의 효능을 테스트하기 위해 초기 투여 량을 5 ~ 10 배 이상을 사용한다.
  2. 5.5 ㎎ / ㎏ Xylacine과 110 밀리그램 / kg 케타민을 포함하는 칵테일을 주입하여 쥐를 마취시키다과 동물이 7-10 분 동안 휴식 할 수 있습니다.
  3. 부드럽게 뒷다리의 발바닥 중 하나를 누름으로써 적절한 진통제 확인; 경우 제대로 동물이 자극에 대한 응답으로 이동하지 않습니다 마취.
  4. 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 각 마우스의 눈을 통해 수의사 연고의 얇은 층을 확산.
    주 : 시스템이 장착하면 이소 플루오 란 등의 흡입 성 마취제가 대​​신 케타민 / Xylacine 사용할 수 있습니다유도 챔버와 코 콘 치우는 사용할 수 있습니다. 동물을 anaesthetise 및 설하 노선 별 면역 자극제를 administrate하는 유도 챔버를 사용합니다. 즉시 삼키는 피하고 치료 화합물의 흡수를 허용하는 마취를 유지하는 적어도 15 분 동안 노즈콘에 동물을 연결한다.
  5. 면역 자극제 또는 차량 제어 용액을 포함하는 용액을 피펫; 엄지 손가락과 도미넌트가 아닌 손의 검지를 사용하여 마우스를 가지고 수직 위치에 고정.
  6. 약간 집게를 열고, 혀 아래에 지배적 인 손 놓고 닫힌 집게 한 쌍을 사용하여 중간 및 링 손가락을 사용하여 제자리에 고정하면 혀를 들어 올립니다.
  7. 피펫을 가지고 혀의 입과 지느러미 쪽의 바닥으로 솔루션을 관리 할 수​​ 있습니다.
  8. 집게를 제거하고 케이지에 다시 착용하기 전에 3 분에서 5 분 정도의 마우스 나머지를 할 수 있습니다. 보장하기 위해 그 정상 체온은 마취 마이크에 유지전자, 케이지 히터 시스템에 케이지를 연결합니다. 이러한 시스템을 사용할 수없는 경우, 대신 마우스는 침대 위에 서로 옆에 대응 케이지 하나에 다시 동일 처리 군에 속하는 부분들이 체온을 유지하기 위해 클린 티슈 시트로 커버.
  9. 처리에 의해 유도 된 세포 집단의 변화를 분석하기 위해 면역 화제의 점안 후 어느 시점에서 조직 샘플을 수집한다.
    참고 : 편모이 특정 프로토콜 관리에 도전하기 전에 2 시간을 실시 하였다. 치료 및 과제 각각의 특정 치료제 및 병원체 사이의 최적의 시간을 결정 테스트 할 수 있습니다.

폐렴 구균과 함께 2 세균 서스펜션의 준비 및 비강 도전

참고 : S. 폐렴 구균은 침습성 폐렴, 패혈증과 같은 생명을 위협하는 질병을 일으킬 수있는 자연적인 인간의 병원균이다뇌막염. 흡입 또는 점막과 접촉 할 때 변속기가 발생할 수 있습니다. 따라서, S. 접촉되었을 수도 있습니다 모든 샘플 폐렴은 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하여 적절한 생물학적 안전 레벨 II 시설에서 처리해야합니다. 보호 복, 폐기물 처리 및 적용 할 수있는 추가 보안 조치에 대한 유형 II 병원체의 취급에 관한 교육 기관의 표준 운영 절차를 확인합니다. 감염된 동물은 HEPA 필터가 장착 절연체에 개별적으로 환기 케이지에 보관해야합니다. 안티 폐렴 구균 백신과 항생제 치료를 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 참고 문헌 (27)와 1을 참조하십시오.

  1. 15에서 제조 알려진 세균 CFU 수의 폐렴 구균의 작업입니다 현탁액의 나누어지는 해동.
  2. 2500 XG 및 실온에서 5 분 동안 원심 분리기.
  3. 상층 액을 버리고 성 1 ㎖에 현탁하여 세균 펠렛을 씻어erile 식염수. 세균 현탁액, 희석 또는 동물의 도전을 준비 할 때 필터 팁을 사용합니다.
  4. 다시 같은 단계 2.2에서 설명한 원심 분리기.
  5. 뜨는을 취소하고 4 × 5 CFU / 50 μL의 현탁액을 얻기 위해 멸균 생리 식염수를 해당 볼륨에 펠렛을 재현 탁. 이 투여 량은 S. 최소 도즈 세균에 상당 폐렴 구균 혈청 형 이전의 연구 (15)에 따라 BALB / c 마우스에 100 % 사망 원인 1 E1586.
    주 : 생쥐의 폐렴 구균 성 폐렴의 모델을 구축 할 때, 최소 용량은 세균 사망률 100 % 균주, 및 마우스 혈청 형 균주의 각 특정 조합에 대해 결정되어야 일으키는.
  6. 텍싱 또는 아래로 5 회를 피펫 팅에 의해 세균 현탁액을 균질화.
  7. 로드 살균 필터 팁을 사용하여 세균 현탁액 50 μL 및 마취 마우스의 콧 구멍에 전체 볼륨을 주입. 마우스 upri을 잡고2 분 GHT하고이 더 많은 분 지느러미 위치 쉬십시오. 눈에 수의사 연고를 적용하고 케이지에 동물을 반환; 마취 동안 정상 체온을 유지해야합니다.
    참고 : 본 연구에서 박테리아 도전 15,28 이전에 결정된 폐로 전체 CFU의 적어도 90 %의 전달을 보장하기 위해 50 ㎕의 부피에서 수행 하였다. 사용할 수있는 동물의 작은 양 (예를 들면, 20 μL)의 고통을 최소화. 그러나 폐에 세균을 효율적으로 전달 확인해야합니다; 이것은 공격 후 폐 5 분 수확과 혈액 한천 플레이트에 시리얼 희석 도금 폐 '균질 CFU를 계산하여 수행 할 수 있습니다.
  8. 혈액 아가 플레이트 상에 직렬로 10 배 희석 도금에 의한 감염에 사용 된 세균 현탁액에 CFU의 수를 확인한다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 O / N을 품어과 알의 녹색 후광 특성을 제시 점액 식민지의 수를 계산PHA의 용혈성 세균.

3 조직 수집 및 유동 세포 계측법 (FACS) 분석을위한 시료 전처리

3.1) 조직 컬렉션

  1. 경추 탈구 또는 CO 2 챔버를 사용하여 동물을 안락사; 목까지 흉강 모든 길을 열어 목과 턱밑 영역의 복부 측면을 노출 앞 다리를 따라 절개를합니다.
  2. 미세 팁 곡선 집게로 조심스럽게 입 바닥의 등 쪽을 노출 침샘 인접 연부 조직을 잡아 당깁니다. 500 ml- 10 % 태아 소 혈청, 10,000 U / ㎖을 함유 한 용액 5 ㎖를 들어, 부드럽게 잡아 당겨 하악 및 액세서리 하악 림프절을 완전 RPMI (cRPMI를 포함하는 튜브에 배치 곡선 얇은 팁 집게를 사용하여 그 것 하류 절차에 따라 페니실린 및 10 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 용액 5 ㎖ L-글루타민 200 밀리미터) 또는 핵산 보존액나중에 수행 될 수있다.
  3. 흉강은 다이어프램의 절개를 열려면; 쥐 이빨 집게 한 쌍의 신중 흉골의 xyphoid 연골을 고정하고 사용하는 것은 진정한 갈비 흉골의 흉골 병을 만나는 지점에 도달 할 때까지 줄곧 거짓 갈비뼈에서 시작하여 양쪽 지느러미 측면에서 갈비뼈를 잘라.
  4. 집게로 흉골의 xyphoid 연골을 들고으로 흉강의 장기 노출 부드럽게 잡아 당깁니다.
  5. 완전히 첫째 갈비뼈와 쇄골을 절단하여 갈비뼈를 제거합니다. 흉선은 심장의베이스에 흉부 주변의 anteroventral 부분에있는 두 개의 엽 (叶)의 흰색 구조로 표시됩니다.
  6. 한 쌍의 집게로 클램핑함으로써 로브 중 하나를 수행하고 그것의 하부면과 심낭 사이 인대를 제거하기 위해 가위를 사용한다. 두 번째 엽을 제거하기 위해 진행합니다.
  7. 복강를 확인하고 m의 중간 축을 따라 절단하여 열uscular 벽 장기를 노출합니다. 포셉 한 쌍의 후방 대정맥과 대동맥을 잘라; 흡수 조직과 혈액의 과잉을 제거합니다.
  8. 폐포의 거주자 침투 세포 인구가 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 수행 분석합니다. 기도와 식도를 노출 목의 복부 부분에 근육을 잘라; 그들 구조의 측면과 등쪽 측면에 절개을 분리합니다.
  9. 집게로기도를 들어 올려 칼슘 / 마그네슘 2 + 플러스 1 mM의 EDTA없이 PBS 1 ㎖ 가득 얇은 팁 전송 피펫을 소개 메스 작은 절개를합니다. 방울 씩과 총 부피에게 세 번 이상 대기음; 흡은 멸균 1.5 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 얼음에 배치하고.
  10. 제 우심실로 칼슘 / 마그네슘 플러스 2 + 1 mM의 EDTA없이 PBS 5 ㎖를 주입하여 폐를 관류, 폐 실질에 존재하는 세포 집단을 분석하는마음의.
    NOTE :이 폐 '혈관에 존재 적혈구 및 면역 세포의 대부분을 제거 할 것이다. 관류가 올바르게 수행 된 경우, 폐의 색은 흰색에 분홍색에서 이동합니다.
  11. 좌심실의 기지에서 클램핑에 의해 폐에서 심장을 분리하고 섬세 완전히 제거하기 위해 가위로 혈관을 잘라. cRPMI 또는 다운 스트림 분석에 따라 핵산 보존액에서 그들을 관류 폐를 가지고 배치하는 수행합니다.
  12. 설하 점막 세포 집단의 분석을 위해, 동물의 머리를 분리하고, 단계 3.2.1의 수행하지 않은 경우 침샘 및 인접 연조직을 제거한다.
  13. 하악 관절에 도달 할 때까지 입의 양쪽에 절개를하고 핀이 해부 보드에 문제를 해결하여, 입의 혀 바닥과 함께 하부 턱을 분리합니다. 혀를 당겨; 메스를 사용하여 절개를 위치를 바혀의 자체는 설하 점막을 노출 세 번째 어금니에 도달 할 때까지 입의 바닥을 준수합니다.
  14. 완전히 혀를 제거; 0.5 mm 생검 펀치를 타고 아래 앞니 옆에 놓습니다. 부드럽게 입의 바닥까지 설하 조직과 언론의 치은 삽입에서 잘라내는 완전히 잘라왔다.
  15. 이제 혀 밑 조직의 제거를 완료 셋째 어금니에 가까운 생검 펀치를 배치 한 번 더 반복합니다. cRPMI 또는 핵산 방부제가 포함 된 깨끗한 튜브에 배치합니다.

FACS 분석을위한 3.2) 샘플 준비.

  1. 24 웰 플레이트에 각 마우스에서 분리 된 폐 '조직을 전송하고 약 2mm의 조직의 작은 조각을 획득 할 때까지 위의 깨끗한 쌍을 말하다. 유형 II 콜라게나의 30 ㎎, FBS가없는 RPMI 1 ㎖에 50 μg의 DNase-I를 포함하는 소화 매체의 잘 당 1 ML을 추가합니다. 최대 피펫 아래로 5 배 부화37 ° C와 5 %의 40 분에 대한 CO 2.
    1. 설하 조직의 세포 집단의 분석을 위해, 디스 파제의 2 단위, RPMI 1 ㎖에 30 mg의 유형 II 콜라게나, 50 μg의 DNase-I를 포함하는 하나 3.2.1 소화 매체를 대체합니다. 50 rpm에서 진탕 기에서 37 ° C에서 20 분 동안 소화 매체의 500 μL에 한 마우스에서 수집 된 조직을 품어.
  2. 배양, 피펫까지 후와 조직의 대부분이 중단 된 10 회 또는 30 초까지 때까지. 40 μm의 살균 셀 스트레이너 비록 세포 현탁액을 필터와 PBS의 5 ㎖를 5 mM의 EDTA를 첨가 씻어.
    참고 : 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 섬유 조직의 완전한 소화를 얻을 수 없습니다. 이 증가 된 세포의 죽음과 F의 전체 결과에 영향을 미치는 세포 외 단백질의 파괴의 원인이되므로 그러나, 콜라게나 제 및 / 또는 디스 파제 또는 공격적인 분쇄의 존재 이상 배양 시간은 사용하지 않는 것이 좋습니다ACS 분석.
  3. 400 XG, 5 분, 4 ° C에서 원심 분리기.
    1. BAL의 세포 집단의 분석을 위해, 4 ° C에서 400 XG, 5 분에서 세포를 원심 분리 및 3.2.4 단계로 진행합니다.
    2. 림프절 세포 집단의 분석을 위해, 멸균 페트리 접시에 70 μm의 셀 스트레이너를 배치하고 스트레이너에 cRPMI의 1 ml의 림프 함께 노드했습니다. 2 ㎖의 멸균 주사기의 돌입을 꺼내 스트레이너의 메쉬에 대한 림프절 호감 갈리고로 사용합니다. 신선한 cRPMI 1 ㎖와 셀 스트레이너를 씻어 멸균 튜브에 페트리 접시에서 세포를 전송합니다.
  4. 각 샘플의 대표 나누어를 타고 생존 세포 수를 결정하는 트리 판 블루로 염색.
  5. ML 2 × 7 세포 /의 현탁액을하고 사이토 튜브에 50 μl를 추가 PBS-5 mM의 EDTA-1 % 소 혈청 Albumin- : FACS-EDTA의 세포를 재현 탁.
  6. APPR을 포함하는 2 배의 항체 믹스를 준비합니다가능한 FACS 악기에 따른 표면 마커 및 형광 시료에 대한 항체의 조합 opriate. 세포 현탁액을 포함하는 각 튜브에 2X 항체 믹스 50 μl를 추가합니다.
    NOTE : 최적 량을 결정하기 위해 각각의 형광 색소 표지 된 항체를 적정 기준은 29 참조 상세한 프로토콜이 사용될 수있다.
  7. 어둠 속에서 얼음에 30 분을 품어.
  8. FACS-EDTA의 3 ㎖로 한 번 세탁하고 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 세포를 스핀 다운, 같은 버퍼 200 μL의 세포를 재현 탁하고 흐름 사이토에서 분석 할 수 있습니다.
    NOTE : 샘플의 큰 수를 처리하는 경우, 상술 한 FACS 분석을 위해 염색 프로토콜 대신 사이토 관의 U-바닥 96 - 웰 플레이트에서 수행 될 수있다. 그러나, 96 웰 플레이트의 세척 단계를 사용하는 경우 각 와시 사이에 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 세포를 아래로 회전이 4 번 FACS-EDTA의 최대 200 μl를 추가하고 반복하여 수행해야합니다NG 단계를 포함한다.
  9. 이 시점에서 사이토 미터 이상 (정착 후의 72H까지) 흐름 분석을위한 샘플을 고정한다.
    1. 세포를 해결하려면, FACS-항체로 표지 한 후 PBS없이 칼슘 + / Mg를 2 +, FBS가없는 1 mM의 EDTA로 세포를 씻어. 더 칼슘 + / mg의 2 + 같은 버퍼의 50 μL에서 세포를 일시 중단하지 않고 고장 성 (2X) PBS에서 새로 제조 4 % 파라 포름 알데히드 용액 50 μl를 추가합니다.
    2. 실온에서 20 분 동안 품어 FACS-EDTA에 세 번 씻는다.
    3. 4 ° C에서 200 FACS-EDTA의 μL 및 저장소에있는 세포를 재현 탁 최대 72 시간 동안 빛으로부터 보호.
      참고 : FSC-SSC는 고정에 의해 영향을받을 수있다. 탠덤 염료가 정착 에이전트의 존재 저하 될 수 있기 때문에 고정하는 경우 샘플은 제조 업체 형광 표지 항체의 호환성을 확인합니다. 샘플은 감염된 동물에서 유래하는 경우 고정이 높은 경우 analy 더 가능한 병원균이 존재할 수 없다는 것을 확인하는 것이 좋습니다microaerosols 샘플의 취득시에 발생 될 수 있기 때문에 FACS 시스템에 샘플을 노래.

(4) 총 RNA 추출, cDNA를 합성 및 실시간 PCR.

4.1) RNA 추출 및 cDNA 합성.

  1. 기계적 파괴에 의한 선택의 핵산 보존액에 조직을 균질화 (예를 들어, 회 전자 - 고정자 균질화기를 사용하여 조직 ruptor 비즈 등을 흔들면서 고속). 15 분, 4 °의 C에 대한 12,600 XG에 원심 분리기 조직 파편을 제거합니다. 깨끗한 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 선택의 방법으로 RNA를 추출합니다.
    참고 :이 분주을하고 -80 ° C에서 RNAse가없는 튜브에 보관 바로 분리 후 사용하지 않을 경우 RNA가 분해에 매우 민감하다. 반복되는 동결 융해을 피하십시오. 튜브는 항상 장갑을 취급해야합니다. 샘플을 해동 후법이지 얼음에 보관하십시오.
  3. 260 nm에서 핵산의 흡광도를 측정하고 μg / μL의 농도를 계산한다.
  4. DNase의이-I이 첨가하여 혼합 준비 (한 샘플에 대한) : 초순수의 7.6 μL, 10 배의 DNase-I 버퍼의 1 μL, 0.4의 DNase-I (증폭 등급) 재고 1 U / μL의 μL, 그리고 8.4 μl를 추가 DNase의는-I는 총 RNA 1 μg 포함 된 각각의 샘플에 섞는다.
    1. 1 μg / μl의 농도로 사용하여 RNA를 주형으로 전체 RNA 1 μl를 첨가하여 retrotranscription 반응 (RT-PCR)을 수행. 샘플이 너무 희석하고 농도가 예상보다 낮은 경우, 총 RNA 대신 물의 큰 볼륨을 추가. 페놀 흔적은 RT-PCR의 수율에 영향을 줄 수 있기 때문에 선택의 RNA 추출 프로토콜을 페놀 - 클로로포름 혼합물을 포함 특수 경우에 RNA를 추가 할 때 최종 반응 부피의 20 %를 초과하지 않는다.
  5. 4 ° C 또는 I에서 10 분 뒤에 RT에서 15 분을 품어CE. (배양 시간을 초과하지 마십시오!)
  6. 각 튜브에 EDTA 25 mM의 (분자 생물학 등급)의 1 μl를 추가하고 DNase를-I을 비활성화하기 위해 10 분 동안 65 ° C에서 배양한다.
  7. (한 반응)은 다음과 같이 retrotranscription (RT) 믹스를 준비 : 1 μL 랜덤 헥사 머 프라이머 재고 0.2 ㎎ / ㎖, 1 μL의 dNTPs를 재고 10 밀리미터, 4 ㎕의 5 배 M-MLV-RT 버퍼, 2 μL DTT 0.1 M, 1 μL RNAse가 OUT 재고 40 U / μL, 1 μL M-MLV 주식 200 U / μl를 retrotranscriptase.
  8. RT-PCR은 10 ㎕의 10 μL의 DNase-I 반응 관에 추가 혼합.
  9. 다음 프로그램에 따른 열 순환기에서 PCR 반응을 수행 :
    1X주기 : 10 분, 25 ° C; 50 분, 37 ° C; 15 분, 70 ° C
  10. 초순수 80 μL를 첨가하여 5 : 1의 cDNA를 희석. -20 ° C에서 보관하십시오.

4.2) 실시간 PCR (qPCR에).

  1. P의 Taq DNA를 함유하는 5 ㎕의 마스터 믹스 (반응 1)은 다음과 같이 qPCR의 반응 혼합물을 준비olymerase, SYBR 그린 염료, PCR 완충액의 dNTP 믹스 및 MgCl2를 (아래 4.2.2 참조); 단계 4.1.10에 나타낸 바와 같이, 순방향 프라이머 10 μM 원액 0.9 μL, 역방향 프라이머의 10 μM 원액, 1.2 μL의 초순수 0.9 μL, 및 cDNA를 템플릿 2 μL 이전 희석.
    참고 :이 섹션에서 사용되는 시약 농도와 자전거 프로토콜은 "재료 및 시약의 표"에 설명 된 시약 및기구를 구체적으로 수행 할 수 있도록 최적화 된 다른 브랜드는 사용할 수 있지만 반응 볼륨, 시약 농도와 자전거 프로토콜이 다를 수 있습니다. RT-qPCR에를 수행하기 전에 제조업체의 지침을 확인하십시오.
  2. 다음과 같이 qPCR에 악기를 설정합니다 :
    1X주기 : 15 분, 95 ° C
    40X주기 : 15 초, (이 점 획득 형광에서) 1 분, 60 ° C 다음 95 ° C.
    참고 : mRNA의 상대 정량 용 코네티컷 방법 30 referenc에 따라전자 유전자는 코네티컷 값의 정상화를 선택해야합니다. 선택의 참조 유전자가 발현이 다를 수 있으므로 특정 분석 조건에서 테스트되어야한다 ACTB, GAPDH 또는 18S는 일반적으로 참조로 선택된 유전자의 일부입니다.
  3. 임계 값을 설정하고 데이터를 분석한다.

결과

설하 면역 성공적 폐 '면역 반응을 조절하는데 사용될 수있다. 우리는 편모, TLR5 및 NLRC4 작용제의 단일 투여 량은, 케모카인의 CXCL1, CCL20 및 염수 처리 된 대조군과 비교 사이토 카인 IL-6 mRNA의 코딩의 중요한 상향 조절을 유도 할 수 있음을 보여 주었다. mRNA 수준의 유도 SLIT 후 8 시간에서 정점을 접고 20 시간 (그림 1) 이후 기저 수준으로 돌아갑니다. 슬릿 S. 폐렴으로 2 시간 전에 비강 내 감염을 수행 할 때 그러나, Cxcl1 및 IL6의 mRNA 수준은 상당히 비 처리 된 동물 (그림 2)에 비해 SLIT 후에도 24 시간을 상향 조절 남아 있었다.

FACS에 의해 BAL의 세포 집단과 폐 조직의 분석은 설하 경로로 플릭으로 처리 동물이 폐 '조직 (그림 3)에서기도에 호중구의 수를 증가하지만 한 것으로 나타났습니다.

그림 4에 나타낸 바와 같이, 편모와 SLIT 보호를 추진 급성 폐렴 구균 폐렴에 생존을 증가했다.

figure-results-1
편모와 설하 면역 요법 후 그림 폐 '전사 프로파일의 1 속도론. 8 ~ 10 주령 BALB / c 마우스는 (N = 4) 마취 설하 경로로 편모 또는 식염수를 10 μg 처리 하였다. 폐는 상이한 시점에서 수집하고, 핵산 방부제에 넣었다. 전체 RNA 추출을 수행하고, cDNA를 합성 하였다. mRNA 수준은 Tabl에 나열된 특정 프라이머를 사용하여 실시간 PCR에 의해 평가 하였다예 1 상대 정량화 정상화 ACTB mRNA 수준을 사용 ΔCT 방법에 따라 수행 하였다. 결과는 SEM ± 중간으로 생리 식염수 투여군에 비해 배 증가로 표시됩니다. 별표는 맨 - 휘트니 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05)를 나타냅니다. 이 결과는 독립적 인 실험의 대표이다.

figure-results-2
와 편모. 8 ~ 10 주령 BALB / c 마우스 (N = 4 대조군이고, n = 7 치료 그룹) 설하 면역 요법 후 폐렴 구균 성 폐렴 중 그림 2 폐 '전사 프로파일에 의해 편모 또는 식염수를 10 μg 처리 하였다 마취 설하 경로. 2 시간 후 마우스는 10의 원인이되는 최소 치사량 (MLD)와 비강 내 경로로 감염시켰다S.의 임상 분리의 0 % 사망률 4 × 5 CFU / 50 μL에 해당하는 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 폐는 공격 후 24 시간을 수집하고, RNA 추출 및 cDNA의 합성을 행 하였다까지 핵산 방부제에 저장 하였다. 실시간 PCR을 행했다 (표 1의 프라이머 목록 참조)과 상대적 정량화를위한 ​​표준화 ACTB mRNA 수준을 사용 ΔCT 방법에 따라 수행 하였다. 결과는 SEM ± 중간으로 생리 식염수 투여군에 비해 배 증가로 표시됩니다. 별표는 맨 - 휘트니 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05)를 나타냅니다.

figure-results-3
다형 핵 호중구의 그림 3과 분석 (PMN) SLIT 후 폐 '조직과기도의 모집. 여덟에10 주 BALB / c 마우스는 (N = 4) 마취하에 설하 경로에 의해 편모 또는 식염수를 10 μg으로 처리 하였다. 2 시간 후 마우스를 S.의 MLD와 비강 내 경로로 감염시켰다 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 공격 후 24 시간은, BAL을 수행하고 폐 FACS 분석을 위해 처리 하였다. PMN은 Ly6G 고 / CD11b를 고 /의 CD11c 음성 세포로 확인하고 FCS-SSC 프로필을 기반으로 하였다. 결과는 BAL 또는 폐에 총 세포 수의 대한 PMN의 백분율로 표시됩니다. 바 SEM ± 평균을 나타냅니다. 별표는 편도 만 - 휘트니 (Mann-Whitney) 테스트에 따라 계산 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05)를 나타냅니다.

figure-results-4
편모 그림 4 SLIT 급성 폐렴 구균 폐렴에 대한 쥐를 보호합니다. S.의 MLD와 비강 내 경로로 감염시켰다 폐렴 구균 혈청 형 1 E1585. 생존은 매일 평가 하였다. 카플란 - 마이어 곡선은 로그인 랭크 (벽난로 - 콕스) 검사에 따라 비교 하​​였다. 별표는 통계적으로 유의 한 차이 (p <0.05) .Results는이 독립적 인 실험의 대표 나타냅니다.

이름 서열 5'-3 ' PCR 제품 길이 (BP)
MB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68
MB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69
mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84
mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
MIL-6_F GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78
MIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63
mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72
mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC

실시간 PCR 분석을 위해 사용되는 표 1 프라이머리스트. qPCR의 분석에 사용되는 특정 프라이머 서열. 앞으로 및 마우스 ACTB에 대한 역방향 프라이머, Cccl20, Cxcl1, IL6, Tnfa 및 Cxcl1는 5'-3 '서열로 표시하고 제품의 기대 길이는 기본 쌍 (BP)에 표시됩니다.

토론

치료제의 설하 투여는 호흡 기관의 면역 반응을 조절하는 유용한 수단으로 입증되었습니다. 호흡 상태의 치료를위한 SLIT의 주요 장점은 비강 내 투여 (31)에 기초하여 치료보다 안전한 것으로, 폐 또는 콧 구멍으로 화합물의 직접 전달을 포함하지 않는다는 것이다.

설하 면역 요법이 어느 알러지 염증 및 천식 (32)의 증상을 개선하거나, 여기에 도시 된 바와 같이, 급성 폐 감염을 치료하기 위해 선천성 면역 메카니즘의 일시적 활성화를 유도하는 규제 반응의 유도를 위해, 다른 방법으로 면역 반응을 조절하는데 사용될 수있다.

이 비디오에 제시된 마우스 모델은 SLIT 치료제와 같은 다른 화합물의 스크리닝을위한 편리한 방법입니다.

이러한 동물 모델은 영향을 결정하는 유용한 수단을 구비폐 '면역 반응뿐만 아니라 다른 장기 (예., 림프절 또는 원위 점막 사이트 배수) 시험 관내 모델을 사용하여 모방 할 수있는 슬릿. 설하 면역 요법을 사용하여 얻은 결과를 설명하는 여러 논문이 있지만, 설하 투여 절차에 대한 자세한 방법은 아직 제공되지 않았습니다. 또한, 모델은 호흡기 조직에서뿐만 아니라 지역 보호를 부여하는 것을 목표 설하 백신의 평가를 위해 사용될 수있다.

첨부 된 영상에 도시 된 바와 같이, 화합물의 투여는 설하 쉽게 광범위한 훈련의 필요없이 수행 될 수있는 간단한 과정이다. 일반적으로 동물 처리에 능숙 사람은이 프로토콜의 설명에 따라 주 사용 마취제를 사용하여 10 쥐의 그룹에 슬릿을 수행하는 데 1 시간이 필요합니다. 폐렴 구균은 도전뿐만 수행되면, 추가로 90 분을 준비해야한다박테리아 서스펜션과 동물의 비강 도전을 수행합니다.

여기에 제시된 FACS 프로토콜은 폐 '세포 역학 림프절뿐만 아니라 효과를 배출, 관리의 로컬 사이트에서 SLIT의 영향을 편리하게 특성화 할 수 있습니다.

기관지 내용과 폐 실질의 별도의 분석은기도 면역 거주자 및 조직 내에서 남아있는 것과 종류의 세포 침투를 구별하는 것이 중요합니다. BAL 내용의 분석은 폐포 대 식세포 매출의 연구뿐만 아니라 다른 치료에 의해 ​​유도 된 폐포 공간, 예를 들면., 백혈구, 호산구, 단핵구 세포에 모집의 역학을 할 수 있습니다. BAL은 효소 면역 분석법 (ELISA) 또는 설하 백신 후 유도 분비되는 IgA 항체의 검출에 의해 분비되는 사이토 카인 및 케모카인의 존재를 평가하는데 사용될 수있다. 폐 '조직의 연구다른 세포 유형, 고전 수상 세포, T 세포 및 B 세포의 특성화를 허용 할 것이다.

FACS 분석을위한 BAL 샘플 및 림프절의 준비는 간단합니다. 시료 채취 후, 일반적으로 60 분 ~ 20 샘플 염색 프로토콜을 완료하는 데 필요합니다. 세포 외 기질의 분해가 요구되기 때문에 반대로, 설하 또는 폐 조직으로부터 세포의 분리는 더 많은 시간을 필요로 할 것이다. 설하 경로에 의해 전달되는 치료제의 흡수는 생체 내 이미징 시스템에서 사용하는 형광 또는 방사성 표지 된 분자의 추적에 의해 해결 될 수있다.

설하 면역 효과적으로 면역 호흡기 반응뿐만 아니라 치료 또는 호흡 상태를 방지하기 위해 사용될 수있다 전신적을 유도하는 매력적인 방법이다. SLIT 나는 후 호흡기에서 면역 반응의 활성화를 허용 대 결정 메카니즘의 해명다른 조건으로부터 호흡 가능한 치료법으로 단독으로 또는 조합하여 사용될 수있는 새로운 치료 전략의 합리적인 설계를 허용하는 결정적이야.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

정제된 편모를 친절하게 제공해 주신 릴 감염 및 면역 센터(Center for Infection and Immunity of Lille, Institute Pasteur de Lille-France)의 장-클로드 시라드(Jean-Claude Sirard) 박사님께, 폐렴구균 균주를 친절하게 제공해 주신 우루과이 보건부 국립기준연구소(National Reference Laboratory) 소장인 테레사 카무(Teresa Camou) 박사님께 감사드립니다.

저자는 전체 비디오 제작 및 에디션 기간 동안 헌신과 노고에 대해 BichoFeo Producciones-Uruguay의 Diego Acosta와 Ignacio Turel에게 감사를 표

하고 싶습니다.

이 작업은 우루과이의 ANII, 우루과이의 PEDECIBA의 기초 과학 개발 프로그램, 우루과이의 CSIC-Universidad de la República의 과학 연구 부문별 위원회의 PR_FCE_2009_1_2783 및 BE_POS_2010_1_2544 보조금의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
케타민 용액 (50 mg / ml)제약 서비스, 우루과이
실라신 용액 (2 %)Portinco SA, 우루과이
멸균 1 ml 주사기현대, 우루과이
멸균 27G 바늘현대, 우루과이
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
소 태아 혈청ATCC302020
페니실린/스트렙토마이신 용액SIGMAP4333
Ca2+/Mg2+PAAH21002
Type-I CollagenaseLife Technologies/Gibco17100017
Deoxyribonuclease I(DNAse-I)SIGMAD4513
Dispase 없음Life Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 활용 쥐 안티 마우스 IgG2b 안티 CD11bBD550993클론 M1/70
APC 활용 햄스터 안티 마우스 IgG1 안티 CD11cBD550261클론 HL3 
APC-Cy7 활용 쥐 안티 마우스 IgG2a 안티 Ly6GBD560600클론 1A8
멸균 식염수Laboratorio Farmaco 우루과이요, 우루과이
트립틱 콩 한천BD Difco, 프랑스236950
제분된 양 혈액Biokey, 우루과이
멸균 페트리 접시Greiner633180
p10 GilsonF144802
p20 피펫Eppendorf3120000097
p200 피펫GilsonF123601
p200 피펫CappC200
p200Eppendorf3120000054
p1000 피펫Eppendorf3120000062
Sterile Filter Tips p10Greiner771288
멸균 필터 팁 p200Greiner739288
멸균 필터 팁 p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
스테인리스 스틸 파인 팁 펜치 SIGMAZ168785/Z168777곡선형
및 직선 드레싱 조직 집게 집게SIGMAF4392길이 8인치
마이크로 해부 집게SIGMAF4017Straight 
마이크로 해부 펜치SIGMAF4142 곡선
메이요 가위SIGMAZ265993 
메스SAKIRA MEDICAL
멸균 생검 펀치 Ø 3mmStiefel Laboratories Ltd.직경 5mm의 2079D도 사용 가능
멸균 1.5ml 튜브Deltalab200400P
멸균 15ml 튜브Greiner188271
멸균 50ml 튜브Greiner227261
멸균 혈청학 피펫 5mlGreiner606160
멸균 혈청학 피펫 10mlGreiner607160
멸균 혈청학 피펫 25 mlGreiner760180
생물학 안전 캐비닛, 클래스 IIThermo Scientific1300 시리즈, 타입 A2
마이크로-아이솔레이터  랙RAIR  아이소시스템 76144W슈퍼  마우스  1800 알러존 
냉장 마이크로 원심분리기EppendorfLegend Micro 21R
마이크로 원심분리기HeraeusBiofuge-pico
원심분리기Thermo ScientificSorval ST40R
CO2 인큐베이터 Thermo Scientific모델  3111
멸균 박막 파스퇴르 피펫DeltalabD210022
멸균 파스퇴르 피Deltalab200007
멸균 24웰 플레이트Greiner662160
Trypan Blue Solution Life TechnologiesT10282
자동 세포 계수기 - CountessLife TechnologiesC10227 
Countess 세포 계수 챔버 슬라이드Life TechnologiesC10312
유세포 분석 튜브BD343675
유세포 분석기 - FACS Canto-IIBD
실시간 PCR 기기 - 로터 유전자 Q 또는 ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Trizol 시약Life Technologies15596-026분자 생물학 학년
DNAse-ILife Technologies18068-015분자 생물학 학년
DNAse-I 버퍼 10X생명 과학18068015분자 생물학 학년
EDTA 25 mM생명 과학18068015분자 생물학 학년
초순수생명 기술10977분자 생물학 학년
RNAse Out생명 과학100000840분자 생물학 학년
무작위 헥사머 프라이머생명 과학N8080127분자 생물학 학년
M-MLV-RT 버퍼생명 과학18057-018분자 생물학 학년
M-MLV-RT enzime생명 과학28025-021분자 생물학 학년
QuantiTect Syber Green PCR 키트Qiagen204143분자 생물학 등급
특정 프라이머 생명 기술분자 생물학 학년
펫

참고문헌

  1. Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
  2. Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
  3. Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
  4. Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
  5. Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
  6. Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
  7. Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
  8. Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
  9. Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
  10. Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
  11. Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
  12. Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
  13. Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
  14. Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
  15. Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
  16. Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
  17. Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
  18. Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
  19. Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
  20. Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
  21. Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
  22. Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
  23. Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999(2009).
  24. Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
  25. Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
  26. Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
  27. Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
  28. Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
  29. Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1(2001).
  30. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  31. Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
  32. Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).

재인쇄 및 허가

태그

Streptococcus pneumoniaeTLR
대안으로 설하 면역 요법은 급성 호흡기 감염에 대한 보호를 유도하기 위해
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.