방법 논문

형광 단백질의 발현에 창고 기 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

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DOI:

10.3791/52042

⸱

2015년 1월 12일

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1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

이 논문에서

요약

우리는 창고 기의 미 수정 난자에 여기 mRNA의 주입 후 형광 단백질의 강력하고 효율적인 표현을보고합니다. 이 기초 척색에 미세 주입 기술의 개발은,이 새로운 모델 시스템에서 기술 혁신을 광범위한 생체 내 이미징 및 유전자 특이 조작을 포함하여있는 길을 만들어 줄 것입니다.

초록

우리는 여기에서 cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum의 수정되지 않은 난모세포에 mRNA를 주입한 후 형광 단백질의 발현을 위한 강력하고 효율적인 프로토콜을 보고합니다. 우리는 양서류 코돈 사용 및 Kozak 합의 염기서열을 수용하기 위해 수정된 멤브레인 및 핵 표적 mCherry 및 eGFP에 대한 구조를 사용합니다. 사용할 주사 바늘의 종류, 수정되지 않은 난모세포에 대한 고정 프로토콜 및 전반적인 주사 설정에 대해 설명합니다. 이 기술은 형광 표지된 배아를 생성하며, 이 배아에서는 최신 생체 내 이미징 전략을 사용하여 초기 발달 중 세포 행동의 역학을 분석할 수 있습니다. 이 양서류 종에서 미세주입 기술의 개발은 유전자 과발현 및 녹다운을 포함한 유전자 특이적 조작뿐만 아니라 배아의 세포 행동에 대한 실시간 이미징 분석을 가능하게 할 것입니다. 전체적으로 이 프로토콜은 배아 발달 메커니즘, 더 중요하게는 배아 발달과 관련된 질문을 해결하기 위한 동물 모델로서 기저 척삭 양서류를 더욱 공고히 할 것입니다.

서론

개발하는 동안, 하나의 세포가 세포 분열과 이동을 모두 포함하는 매우 복잡한 공정에서 전체 유기체를 일으킨다. 나은 셀 동작의 역학의 기초 생물학적 원리를 이해하기 위해서, 발달 생물학 형광 기반 생체 이미징 기법을 사용하기 시작했다. 이러한 세포막 등 세포의 구체적인 구획, 어느 형광 염료로 처리하여 특이성 부족 및 조직 침투 (1)의 저해 방법을 표시 할 수, 또는 형광 단백질 둘을 코딩 외인성의 mRNA 배아 내로 특정 도입. 다른 기술들은 예컨대 mRNA가 같은 외인성 화합물의 효율적인 전달을 위해 사용될 수있다. 이들은 다음을 포함하지만, 미세 주입, 전기 천공, 미세 입자, 리포 펙션과 함께 충격 전달 3,4, 이에 한정되지 않는다. 이러한 모든 접근에 외인성 화합물을 도입하는 데 사용될 수 있지만배아를 현상 만 마이크로 인젝션은 각 셀 (3)에 소정 수량의 정확한 적용을 허용한다. 마이크로 인젝션 기술은 모든 주요 발달 모델 시스템을 위해 설명되었다 4 (예, 초파리, 선충 웜, 제브라 피쉬, 개구리, 마우스)뿐만 아니라 발전기구의 발전을 이해 목표 비교 연구에 사용되는 등 일부 다른 모형 (4)에 관해서 (예를 들어, 말미잘, 환형 동물 벌레, 성게, 멍게의 tunicates, 두삭 동물의 amphioxus).

함께 tunicates과 척색 문을 설정 척추 동물로, 특히 적합 모델입니다 Cephalochordates는 척색 동물의 진화와 무척추 동물의 조상 5-8에서 척추 동물의 다양 화를 연구한다. 두삭 동물의 혈통은 초기 척색 진화하는 동안 분기; 세 장군으로 세분화되어 현존하는 cephalochordates (밀기울chiostoma, Asymmetron 및 Epigonichthys가), 척추 동물과 유사 모두 전체 해부학과 게놈 구조 5-8의 관점에서. 지금까지 설명 된 cephalochordates의 약 30 종, 다섯 배아 발달 연구 6,9 사용할 수 있습니다 Asymmetron의 lucayanum (바하마 창고 기), Branchiostoma floridae (플로리다 amphioxus), 창고 기 (유럽 amphioxus) Branchiostoma belcheri (중국 amphioxus)과 Branchiostoma japonicum (일본 amphioxus). 이 종의 세 가지의 잘 익은 성인 (B.의 lanceolatum, B.의 belcheri 및 B. japonicum)는 주문형 짝짓기의 계절 (10, 11) 중 산란을 유도 할 수있다. 또한, 적어도 용 B. lanceolatum, 효율적인 산란은 이에 연구소 용에 대한이 특정 두삭 동물 종에 액세스 할 수 있도록, 인공 해수 (12)에 유도 할 수있다천연 해수에 액세스 할 수 없습니다 이거 야. B의 조합, lanceolatum, 이러한 미세 주입 등의 효율적인 전달 방법과 배아에 편리하고 안정적으로 액세스의, 지금까지 13 ~ 15, (B. floridae와 B belcheri 모두) amphioxus에서 개발 된 유일한 전달 기술의 개발을 가능하게합니다 계보 tracing- 및 동적 셀 동작 기반 접근 방식을 포함 속임수 기술의 새로운 제품군.

의 mRNA를 효율적으로 미세 주입을위한 프로토콜은 B의 형광 단백질을 표현 lanceolatum 배아, 따라서 개발되었다. 또한, B의 라이브 영상을위한 기본 툴킷을 제공하는 lanceolatum 배아, 벡터 시스템은 막 - 관련 단백질의 형광 핵 발현 허용하는 것이 개발되었다. 막 타겟팅의 경우, 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는)는 mCherry 및 eGFP는 인간 HRAS의 CAAX 상자와 핵 현지화했다 융합했다제브라 피쉬 히스톤 2B (H2B) 엑손 (그림 1, 보충 파일 1)을 융합하여 얻을 수 있습니다. 또한, 단백질 번역을 최적화 할 목적으로, 구조체의 서열과 코작 코돈 변형 된 사용 및 B.에 적응 lanceolatum. 종합적으로, 여기에 제시된 주입 방법 및 발현 벡터는 특히 최근의 생체 영상 기술에 기반하여 형광 분석 cephalochordates 새로운 실험 접근법의 생성을위한 기초로서 역할을한다.

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프로토콜

악기 및 시약 1. 준비

  1. 파스퇴르 피펫을 전송
    1. 다른 속도로 불꽃보다 230mm 긴 파스퇴르 피펫을 잡아 당겨 다른 팁 직경 전송 파스퇴르 피펫의 시리즈를 생성합니다. 테이퍼이기도의 부드럽고 미세한 제어를위한 가능한 한 긴 있는지 확인하십시오.
    2. 다이아몬드 스크라이브으로 수직 피펫의 길이에 따라 라인 피펫 긁힐. 두 손으로 무딘 컷을 생성하기 위해 길이로 피펫 평행을 당깁니다. 신속 불꽃 폴란드어 끝을 밀봉하지 않고 피펫.
    3. , 200 ~ 400 μm의 (직경 500 μm의 주위에) 수정란를 들어, 600 μm의 미 수정 난자에 대한 300 ~ 400 μm의 (직경 150 μm의 주위에) : 난자 / 배아의 무대와 팁의 직경은 피펫 수에 따라 달라질 부화 neurulae합니다. 입 모니터링 흡인 튜브를 사용 피펫은 한 접시에서 난자 / 배아를 전송합니다다른.
  2. 주사 바늘
    1. 의 RNase없는 조건을 보장하기 위해 장갑과 모세 혈관을 조작합니다. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, 길이 10mm의 크기와 필라멘트 모세 혈관과 붕규산 유리를 사용합니다.
    2. 모세 혈관이 자료 목록에 설명 가열 필라멘트 바늘 풀러의 종류에 가져온 경우, 다음 설정을 사용 : 열 (600), 속도 (80), 시간 (60), 압력 (200) 또는 그렇지 않으면 300 (50)를 당겨, 모양, 어떤 보장 성공적인 주사에 매우 중요, 다음 속성 그림 2에 도시 한 바와 같이 : 4-8 μm의 외부 팁 직경 2cm 테이퍼 길이.
      참고 : 바늘은 산란기 전에 뽑아 시즌 내내 사용할 수 있습니다.
  3. 5 % 페놀 레드 원액 (4 배)
    1. 각 산란기 전에 신선한 준비합니다.
    2. 0.22 μm의 여과 튜브에서 페놀 적색 분말을 25㎎ 달아.
    3. 에 DNase-과의 RNA 분해 효소가없는 물을 0.5 ML을 추가분체를 함유하는 튜브.
    4. 용액을 필터링 소독과 주사 바늘을 방해 할 수있는 결정을 제거하여 실온에서 18,000 XG에 3-5 분 동안 스핀.
    5. 4 ° C에서 보관 또는 -20 ° C에서 250 μL 씩 저장합니다.
  4. / ㎖ 폴리 라이신 솔루션 0.25 mg의
    1. 각 산란기 전에 신선한 준비합니다.
    2. 증류수 20ml에 폴리 -L- 라이신 5㎎을 녹인다. -20 ℃에서 5 ㎖ 씩.
    3. 폴리 라이신 코팅 요리에 난자의 재현과 강력한 접착력을 보장하기 위해 한 번만 즉시 해동 나누어지는을 사용합니다.
  5. mRNA의 합성
    1. 각 산란기 전에 신선한 준비합니다.
    2. (37 ° C에서 보통 2 시간 동안) 적절한 효소를 사용하여 원하는 DNA의 5 μg의 선형화. 소화의 완전성을 확인하려면 20 분 150 W에서 TBE 버퍼에 1 % 아가로 오스-TBE 겔에 소화 믹스의 볼륨에 2 %를 실행합니다.
    3. 원격 교육의 압축을 풉니 다24 : 1 페놀 (PH 8.0) : 클로로포름 : 25 음 공인 DNA 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기 18,000 XG에 10 분 수성 (위) 단계를 수집하기위한 소용돌이.
    4. (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이.
    5. 10 : 300 선형화 된 DNA : 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2) : -20 ℃에서 밤새 100 % 에탄올 100 선형화 된 DNA를 침전.
    6. 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 70 % 에탄올로 씻어.
    7. 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 건조 및 재현 탁 0.5 ㎍ / μL의 최종 농도 보자.
    8. 제조업체의 지시에 따라, 적절한 폴리머 라제 mRNA의 합성 키트를 사용하여 선형화 된 DNA 1 μg의 속기.
    9. 1 페놀 (PH 4.7) : 5의 mRNA를 추출 키트와 함께 제공된 클로로포름, 초산 암모늄 스톱 솔루션을.
    10. 20 초 동안 소용돌이, CEntrifuge XG 18,000에서 10 분 및 수성 상을 수집한다.
    11. (24) 다시 성상을 추출 : 1 클로로포름 : 이소 아밀 알코올. 20 초, 원심 분리기에서 10 분간 18,000 XG 수성 상을 수집 용 소용돌이.
    12. 밤새도록 -20 ℃에서 100 % 이소프로판올 mRNA의 침전.
    13. 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 20 분. 80 % 에탄올에 씻어.
    14. 4 ℃에서 18,000 XG에 원심 분리기 10 분. 그 다음, 재현 탁 어려울 수있는 바와 같이 더 이상보다 50-10 분 동안 실온에서 건조 된 펠렛을 보자. 적어도 2 ㎍ / μL 최종 농도 DNase-과의 RNase가없는 물에 재현 탁 사출 믹스 흉 mRNA의 최종 농도를 보장한다.
    15. 상기 전사 제품의 품질과 크기를 확인을 20 분 동안 150 W에서 TBE 버퍼의 RNase가없는 1 % 아가 로즈 겔상에서 TBE mRNA를 0.5 μL를 실행한다. 스토어 -80 ° C에서 2 μL 씩.
  6. 폴리 리신 - 코팅 요리
    참고 : 폴리 라이신 COA테드 요리를 주입하는 동안 난자를 고정하는 데 사용됩니다.
    1. 각 35mm 배양 세포 배양 접시 (총 5)의 경우, 해동 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 리신 용액 1 ㎖와 함께 배양 접시의 저면을 커버. 5 분 동안 실온에서 배양한다.
    2. 각 35mm 세포 배양 페트리 접시 (총 5)의 경우, 다른 35mm 세포 배양 페트리 접시에 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 전송합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다.
    3. 0.25 ㎎ / ㎖ 폴리 라이신 솔루션을 폐기하십시오.
    4. 2 시간 동안 실온에서 배양 접시 건조, 거꾸로 보자.
    5. 일주일 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 플라스틱 포장에 싸여 폴리 라이신 코팅 요리를 저장합니다.
  7. 아가로 오스 코팅 요리
    참고 : 그들은 문화를 주입 배아하는 데 사용됩니다. 아가로 오스는 주입 된 배아의 쿠션을 제공하고 접시의 바닥에 달라 붙는을 방지 할 수 있습니다.
    1. 인공 해수 (ASW) 37~38g / L의 통신을 사용합니다역삼 투 물에 ercial 염 + 0.25 mM의의 NaHCO3.
    2. 전자 레인지에서 가열하여 용액을 0.22 μm의 필터 ASW에서 1 % 아가로 오스의 농도로 녹여.
    3. 신속히 요리의 매우 얇은 코팅을 아가 보장하기 위해 또 다른 하나에 하나 35mm 페트리 접시에서 용액을 따뜻한 아가 붓는다.
    4. 사란에 싸여 아가로 오스 코팅 요리 1 주일에 최대 오염을 방지하기 위해 4 ° C에서 포장에 보관하십시오.
  8. 주사 바늘 사출 믹스 로딩
    1. 약 2 시간 주사를 시작하기 전에, 1-1.8의 mRNA ㎍ / μL, 15 % 글리세롤, 1.25 % 페놀 레드의 최종 농도 2 μL를 주입 RNA 분해 효소의 믹스와의 DNase없는 물을합니다.
      주 : 페놀 레드 색 주입의 주입 효율 및 배아 식별 모니터링을 허용 용액. 글리세롤 난자 내의 mRNA의 확산을 선호.
    2. 원심 분리기 4 분에 18,000 XG에펠릿 결정. 얼음에 사용할 때까지 유지합니다.
    3. 10 μL 피펫, 결정을 펠렛 화 된 튜브의 바닥을 피 주사 믹스 0.5 μl를 수집한다.
    4. 바늘의 큰 개구부에 주입 믹스 0.5 μL 드롭 피펫 팅하여 (여기서 주입 중에 하나를 바꿈) 적어도 두 개의 주사 바늘 백필.
    5. 사출 믹스의 증발을 방지하기 위해 4 ° C에서 바닥에 액체와 함께 저장 항아리에 바늘을 설치합니다. 사출 믹스 천천히 기포의 생성을 최소화하기 위해, 적어도 1 시간 동안 주사 바늘의 선단을 여행하자.
    6. mRNA의 품질이 저하 한 후, 세 개의 추가 용도의 최대 -80 ° C에서 보관 추가적인 주입 믹스 (데이타 미기재).

생물 재료, 미세 주입 및 배아 문화 2. 컬렉션

  1. 난자와 정자 수집
    참고 : Theodosiou를 참조하십시오등의 알. 산란을 유도하고 배우자 수집을위한 상세한 프로토콜에 대한 (12).
    1. 24 시간 동안 23 ° C에서 ASW에 충격 남성과 여성.
    2. 대부분의 성인은 일몰 후 1-2 시간을 산란하기 때문에 일몰 전에 한 두 시간은 19 ° C에서 ASW에서 개별 컵에 성인을 전송합니다.
    3. 필터링 ASW에서 35mm 배양 접시를 씻어 그들에게 접시의 바닥에 달라 붙는 난자를 방지하기 위해 건조 거꾸로 보자.
    4. 산란시, 즉시 1,000 μL 피펫으로 정자와 난자를 수집합니다.
      1. 정자를 유지하고 접촉 생식 세포가 건강에 해로운 때문에 난자가 성인 amphioxus 분리 (데이터가 표시되지 않음).
      2. 또한, 정자와 난자를 모두 방출 움직임에 이르게, 성인 깜짝 놀랄 방지, 따라서 희석. 가능한 한 긴 활성 정자를 유지하고, 수정 속도를 최적화 가능한 집중으로 정자를 수집 할 수 있습니다.
    5. 유지1.5 ML 튜브에 얼음에 정자.
    6. 사전 세척 35mm 페트리 접시에 여과 ASW에서 난자를 전송합니다.
    7. 전송 100 ~ 500는 주사를 수행하기 위해 다른 35mm 페트리 접시에 이전 뽑아 300 ~ 400 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 난자.
    8. 정자와 난자의 품질이나 다른 실험 대조군으로 클러치의 나머지 기름지게.
  2. 난자 주입
    1. 수평면에 50 ° 각도로 미세 조작기에 주사 바늘을 설치한다.
      참고 : 50 °의 각도가 난자에 바늘의 상대 위치의 적절한 모니터링을 허용하지 않습니다 동안보다 50 °의 각도가 접시에 주위의 난자를 밀어 것입니다.
    2. 25X 접안 형광 해부에서 여과 ASW를 함유하는 폴리 리신 - 코팅 접시 300-400 μm의 전송 파스퇴르 피펫 30 난자 옮긴다.
    3. 수행 할 선을 따라 난자를 입금주문 방법 및 아웃 주사는 비 주입 난 모세포에서 분사 구별하기. 배아 현상을 변형시키는 경향이 폴리 리신, 난 모세포의 노출 시간을 최소화하기 위해 작은 수 (30 난자) 주사 (데이타 미기재).
    4. 가능한 반투명으로 난자를 렌더링하는 암 필드 조명을 사용합니다.
    5. 미세 조작기의 조동 노브, 난자 가까이에 주사 바늘을 가지고.
    6. 미세 핀셋으로 선단이 만곡되기 시작 레벨에서 바늘을 오픈. 인젝터 펄스으로, 그 붉은 주입 혼합 실제로 바늘의 유출되어 있는지 확인합니다.
    7. 200X 배율과 미세 조작기의 미세한 움직임 노브로, 부드럽게 난자의 핵심 내부의 주사 바늘을 이동합니다.
      참고 : 너무 피상적으로 삽입 한 경우, 주입 된 용액이 난자 내부에 남아되지 않습니다. 너무 멀리 삽입 한 경우, 난자가 파괴됩니다.
    8. 120 밀리 초 durat의 1-3 펄스 주입이온과 1 ~ 10 psi의 압력. 바늘이 충분히 좋은 경우, 일정한 압력에서 연속적인 흐름으로 주입. 사출 볼륨이 하나의 난자의 부피의 1/3에 1/5에 해당하는지 확인합니다.
    9. 주입 후, 난자의 누출을 방지하기 위해 신속하게 바늘을 빼냅니다.
    10. 주입 된 용액이 난자 내에서 유지하고 몇 초 후, 주입 된 용액이 난자에 걸쳐 퍼져 있는지 확인합니다.
    11. 라인의 다음 난자에 이동합니다.
    12. 주입 된 배아 스캔 할 때 배경 형광을 추정하기 위해 음성 대조군 각 시리즈의 일부 uninjected 배아를 유지합니다.
  3. 주입 배아 및 배아 문화의 시비는, 선택
    1. 즉시 시리즈가 주입 된 바와 같이 난자를 기름지게. 난자의 질이 시간에 감소로, 주입, 12 산란 후 1 시간 내에 난자를 비옥.
    2. 정자 농도에 따라 난자에 정자의 1-5 방울을 추가하고접시를 소용돌이 친다.
      참고 : 수정 봉투는 약 1 분 후 배아에 명확하게해야한다.
    3. 난자의 또 다른 시리즈를 주입하는 동안, 배아는 폴리 라이신 코팅 접시에서 분리 할 수​​ 있습니다.
    4. 아가로 오스 코팅 페트리 접시에 600 μm의 전송 파스퇴르 피펫으로 배아를 전송합니다. 모든 가능한 2 셀 단계 전에 경우, 가능한 한 빨리 폴리 라이신 코팅 접시에서 배아를 제거합니다.
      참고 : 폴리 라이신에 장시간 노출 될 경우, 배아는 접시의 바닥에 닿는면에 평평하게 밀집 blastulae, 될 경향이있다.
    5. 2 셀 4 셀 단계에서, DSR 필터와 형광 해부 범위로 선택 성공적으로 주입 배아, 즉, 페놀 레드 파생 적색 형광 신호를 전시하는 일반적인 형태와 그.
    6. 원하는 스테이지까지 19 ° C에서 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에서 필터링 ASW에서 문화 배아를 유지생체 내 이미징.

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결과

위에서 설명한 프로토콜 B. 마이크로 인젝션 용의 기초를 제공한다 lanceolatum 난자 따라서 B. 개발에 도입 mRNA를 lanceolatum 배아는 생체 내 이미징 형광 단백질을 코딩. 기술은 확실히 견고하고 신뢰할 수 있지만,이 프로토콜을 이용하여 성공적으로 주사 속도 변수 (표 1) 남아있다. 이 흥미로운 사실​​을 매우 그럴듯한 설명은 난자 클러치의 극단적 인 변화입니다 : 사출 압력을받을 때 다른 달걀 배치가 참으로 매우 다르게 작동 않습니다. 다른 사람들은 매우 단단하고 주입시 라운드 유지하면서 일부 난자, 오히​​려 탄성이며 접시의 바닥에 평평하게하는 경향이있다. 다른 단순히를 Lyse (데이터 미기재)하면서 또한 일부 난자 배치는 주입시 그들의 융모막 막을 팽창하는 경향이있다. 명백한 상관 관계가 주입 및 배아에 난자 행동 사이을 구축 할 수 없습니다수정 후 개발. 그것은 미세 주입에 가장 적합 난자의 범주를 예...

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토론

이 글에서, B.의 주입을 위해, 처음으로, 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 제시 lanceolatum 난자, 이는 후 B. floridae 13, 14 및 B belcheri 15는, 이와 같은 기술이 기재되어있는 제 amphioxus 종이다. 중요한 프로토콜은 B. 형광 단백질의 생산에 적합한 벡터 시스템의 설명을 포함 여기에 설명 시험 관내 생산 된 mRNA의 주입으로부터 lanceolatum (후술). 함께, 이러한 새로운 도구 amphioxus의 초기 개발 및 분열과 낭 배기와 배아의 초기 형태 형성 이벤트를 기초 동적 세포 행동의 분석의 생체 내 이미징 할 수 있습니다.

일반적으로, 마이크로 인젝션 기술은 특정 화합물의 사전 정의 된 양의, 표적 세포 내로 전달을 허용하는 이점을 갖는다. 이 인들과 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 축산은 "Animalerie 센트 드 지프 쉬르 이베트"에 의해 지원을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연합 (EU) FP6 부여 "Embryomics"에 의해 ANR 부여 "에 의해, 마이클 슈베르트에 ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 및 ANR-11-JSV2-002-01)에서 기금에 의해 지원되었다 ANR- 장 - 프랑수아 니콜라스와 나딘 Peyriéras에 10 BLAN-121801 데브 - 프로세스 ". 주앙 엠마누엘 카르발류는 FCT 박사 교제에 의해 자금을 조달 (SFRH / BD / 2,012분의 86,878).

여기에 설명 된 벡터에 대한 요청은 저자에게 직접 해결할 수 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Consumables
35 mm 페트리 접시Falcon353001배양 처리
여과 장치 (Stericup 1 L)FisherW217190.22 μ m
Spin-X 튜브Costar81600.22 μ m
직경 1.2mm 모세관용 바늘 보관 용기WPIE212
파스퇴르 피펫230mm 길이
흡인 튜브Dutscher75056
주사 바늘용 모세혈SutterBF 120-94-10필라멘트가 있는 붕규산 유리, OD 1.20mm, ID 0.94mm, 길이 10mm
시약
저융점 아가로스SigmaA9414
페놀 레드시그마114537
글리세롤SigmaG2025
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드SigmaP9155
H2O, DNase/RNase-freeGibco10977-035
mMessage mMachine SP6 전사 키트AmbionAM1340mRNA 합성 키트
페놀 pH 8시그마P4557
24:1 클로로포름:이소아밀릭 알코올시그마C0549
5:1 페놀 pH 4.7:클로로포름시그마P1944
암초 결정 소금 (200 kg)유럽 상업용 염
NaHCO3SigmaS6014
Equipment
Fluorescent dispirting scope with 200X magnificationLeicaMZ16F25X oculars, DSR and GFP2 filters
MicromanipulatorMarzhauzerM-33
InjectorPicospritzermodel II or III
니들 풀러SutterP97가열 필라멘트 니들 풀러
미세 집게Fine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5
관

참고문헌

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