우리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 기관내 주입에 의한 쥐 폐 손상 모델을 개발했습니다. 이 모델은 폐렴 중 폐 손상을 모방하며 임상적으로 관련이 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 급성 폐 손상 및 폐렴을 연구하기 위해,이 질환의 다양한 병리학 적 특징을 모방하는 동물 모델을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 박테리아 녹농균 (P. aeruginosa의 또는 PA)의 내부 기관 주입에 의한 마우스 폐 손상 모델을 개발했다. 이 모델을 사용하여, 우리는 손상의 초기 단계에서의 폐 염증을 표시 할 수 있었다. 또한, 폐포 상피 장벽 leakiness는 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 분석하여 관찰 하였다; 및 폐포 세포 사멸로부터 제조 부상 폐 조직을 사용 TUNEL 염색하여 관찰 하였다. 손상 후 이후의 단계에서, 우리는 복구 프로세스에 필요한 세포 증식을 관찰 하였다. 부상 7 일 P.의 시작에서 해결되었습니다 aeruginosa에 주입입니다. 이 모델은 폐렴 동안 폐 염증, 손상 및 수리의 순차적 과정을 모방. 이 임상 적으로 관련된 동물 모델에서 F, 수리 메커니즘을 병리학을 공부에 적합급성 폐 손상을 따르게하고,은이 질환의 잠재적 인 치료제를 시험하기 위해 사용될 수있다.
서론
폐는 환경 병원균에 노출 염증과 손상 1-3에 취약합니다. 폐렴 또는 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS)과 같은 병적 인 상황에서는 백혈구가 발표 한 병원균뿐만 아니라 염증 요인이 폐포 세포 1-3의 부상과 죽음을 유도한다. 이것은 수리 부상 병리학 연구뿐만 아니라기구를 용이 급성 폐 손상의 동물 모델을 개발하는 것이 중요하다.
현재, 대부분의 사람들은 고농도 산소 및 블레오 마이신 유도 마우스 폐 손상 모델 4를 사용합니다. 그러나 고농도 산소의 메커니즘은 부상이 폐렴이나 급성 호흡 곤란 증후군 5시에 가장 자주 발생하는 폐 손상과 동일하지 않습니다 일으켰습니다. 블레오 마이신에 의한 급성 손상은 임상 상황에 맞는 4 드물다. 여기에서 우리는 P.의 내부 기관 주사를 사용하여 마우스 폐 손상 모델을보고 aeruginosa의 6,7. 이 모델은 임상 적이며, 모방 P폐렴 8 다음과 같은 일이 rocesses.
면역 개인의 기회, 병원 내 병원균, P.로 녹농균은 일반적으로 폐, 요로, 화상, 상처 감염 및 다른 혈액 감염 (6)이 발생합니다. 박테리아 병원성 인자 외독소를 해제 곱하고 면역 반응 (6)를 발생시킨다. P.의 내 trachael 관리 녹농균 폐렴을 유발할 박테리아 인체 노출의 상황을 반영하고 병리 최근보고 된 인플루엔자 바이러스 H1N1 유도 폐 손상 모델 (9)로부터 상이 할 가능성이있다. P. 이후 aeruginosa에 그것이 더 악성 병원균 중 일부에 비하여 취급이 비교적 안전하다 기회 병원체이다. 우리가 관찰하기 때문에 여기에서 우리는이 방법에 비해 폐의 말초 폐포 지역에 더 많은 박테리아를 도입하는 박테리아를 관리하는 내부 기관 주사를 사용입소문을 통해 카테터를 사용하는 등 다른 절차.
다른 급성 폐 손상 모델에 비해 P. 여기에 설명 녹농균 모델은 박테리아에 의해 과도한 염증에 의해 유발 된 폐 손상을 연구하는데 적합하다. P.를 사용하는 다른 동물 모델과는 달리 녹농균은 여기에 우리가 현지화 된 급성 폐 손상을 유발하는 박테리아의 내부 기관 주사를 사용, 패혈증 (10, 11)을 유도한다.
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프로토콜
동물 실험은 시카고 일리노이 대학의 동물 관리위원회와 기관 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었다.
참고 : 마스크, 보안경, 가운 또는 점프 수트, 더블 장갑 : 녹농균을 포함한 모든 절차를 포함 하나 이에 한정되지 않는다 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 방식으로 수행되어야한다. 인증 바이오 안전성 캐비닛에서 작동합니다. 표백제 또는 이산화 염소 소독제와 박테리아와 접촉 악기를 취급합니다. 전송 샘플 봉인 상자를 사용합니다.
1. P. aeruginosa의 문화와 성장
- 스토어 P. -80 ° C에서 cryovial 스크류 캡에 세균 재고로 aeruginosa의 PA103.
- 70 % 에탄올 젖은 종이 타월 상자에 랙에 유리 병을 놓고 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 실험실에 걸릴.
- 킬 양 혈액 아가 플레이트 상에 박테리아가 인큐베이터에서 15 시간 ~ 37 ° C에서 성장한다.
- BSL2 후드, 5 ㎖ PBS에서 박테리아 루프 및 재현 탁과 접시에서 세균에 상처.
- 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 재고를 보관합니다. 그러나, 역가에게 2 주마다 결정한다.
- 직렬 (1시 10분 7 1:10 (4)로부터 보통) PBS로 세균을 희석 양 혈액 아가 플레이트에 공지 된 희석액을 플레이트.
- ~ 15 시간 동안 번호판을 품어. 콜로니 카운트 박테리아 농도를 결정하기 위해 콜로니 형성 단위 (CFU)을 계산한다.
- 적절한 농도를 재현 탁 (~ 5 × 103 CFU / μL) 1.5 ml의 멸균 스크류 캡 크리오 바이알 (cryovial) 0.5 ml의 PBS에서. 크리오 바이알 (cryovial)를 밀봉 스냅 뚜껑 상자에 살균제 라덴 종이 타월에 cryovial 랙에 배치합니다.
- BSL2 동물 시설에있는 상자를 운반. 일단 거기, BSL2 캐비닛의 상자를 엽니 다.
2. P. aeruginosa에 떨어 뜨림
- 생존 수술 무균 (멸균 장갑, 멸균 악기를 수행및 무균 기술). 살균 (멸균) 수술기구에 대한 작업 표면을 제공하기 위해 무균 드레이프를 사용합니다. 각 기관 점안 절차 사이에 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 악기를 소독.
- 마취하기 전에 마우스의 무게를. , 케타민 (100 ㎎ / ㎏), 자일 라진 (xylazine) (5 ㎎ / ㎏)와 쥐를 마취 0.1 - 0.2 ml의 PBS 복강 내 (IP). 발가락 핀치에 비 대응하여 마취의 효과를 결정합니다. 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- BSL2 캐비닛의 수술 보드에 마우스를 제지합니다.
- 절단 아래의 영역을 식별합니다. 이 영역을 면도하고 3 회 알코올과 포비돈 요오드 면봉을 교대로 사용하여 피부를 준비합니다.
- 이 마취 같은 기관에 액세스하기로 피부 절개 부 수술에 충분한로서 국소 마취제 (리도카인)와 절개 영역 치료.
- 목의 정중선 작은 절개 (약 5mm)를 확인하고 무딘 F를 사용orceps 부드럽게 기관에 액세스 근육을 이동합니다. 수술 절개하여 기관을 노출.
- 27 G 바늘 1 ml의 일회용 주사기로 세균 솔루션을 그립니다. 각 마우스의 경우, 적절한 농도 (105 CFU 각 마우스까지) 박테리아의 20 ~ 30 μl를 관리 할 수 있습니다.
- 기관에 바늘을 삽입합니다. 기관에 천천히 솔루션을 주입한다.
- 일반적으로 해당 솔루션을 나타내는 동물 헐떡 거림이 폐에 도달 한 것을 확인합니다.
- 무균 조건에서 멸균 봉합 (6-0 모노 필라멘트)와 상처를 닫습니다.
- 0.1 ㎎ / 수술 후 통증을 제어하기 위해 수술 후 진통제 등의 피하 주사에 의해 kg 프레 노르 핀을 사용합니다.
- 폐쇄를 절개하는 초기 마취 유도에 필요한 시간보다 15 분인지 확인합니다.
- 주입 한 후, 적절한 생물 학적 날카로운 물건 용기에 주사기와 주사 바늘 폐기하십시오.
- 이산화 염소를 기반으로 DISI와 수술 도구를 취급nfectant 15 분 동안 씻어 살균을 위해 실험실로 돌아가서 필요한 경우 다시 사용합니다.
- 단독으로 따뜻한 환경에서 깨끗한 케이지의 집은 마우스.
- 이 의식을 회복하고 이동하기 시작 때까지 동물에 매 30 분을 확인; 나중에 처음 3 일 수술 후 12 시간 간격으로.
- 실험을하는 동안 동물 BSL2 시설에 마우스를 유지합니다. 밀봉 된 상자에 포함 된 유일한 조직은 동물 BSL2 시설 나뭇잎 있는지 확인합니다. 쥐가 죽어가는 행동 중 하나를 표현하는 경우 연구에 어떤 시점에서 (호흡 곤란, 혼수, 부드러운 자극에 대한 응답으로 ambulate 실패로 정의), 자궁 경부 전위 다음에 병에 소스에서 CO 2 흡입 쥐를 안락사.
- 마취에서 일어난 과다 출혈에 의한 실험 주제를 안락사.
- 안락사 쥐에서 폐 조직을 수집합니다. BSL2 후드에서이 절차를 수행하십시오. 필요한 경우, 라 세미 배치 밀봉 된 튜브를 사용하여 샘플을 전송할추가 프로세스에 대한 스냅 뚜껑 상자에 살균제 라덴 종이 타월에 케이.
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결과
72 시간 게시물 P. - 24 일부터 시작 녹농균 주입, 세포 수 증가는 (도 1a-D) 폐 섹션에서 관찰되었다. 폐는 96 시간 포스트 부상 (그림 1E)를 복구하기 시작했다. 칠일에 P.를 게시 녹농균, 정상 폐포 형태는 크게 (그림 1 층) 복원되었습니다. 터널 염색하여 폐 섹션은 24 시간 후 P.에서 준비 녹농균은 폐포 세포 (도 1G-I)에서 세포 사멸을 보였다. 이 손상 모델에서 복구 프로세스를 연구하기 위해, BrdU의 포스트는 P. 삼일에서 생쥐에 주입 녹농균. 폐는 5 시간 후 BrdU의 주입에 격리와 BrdU의 항체 염색법에 대한 처리되었습니다. 도 1J 및 K에 도시 된 바와 같이, 상당히 72 시...
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토론
우리가 여기에서 설명하는 슈도모나스 마우스 폐 손상 모델은 급성 폐 손상이나 폐렴에 따라 발생하는 염증, 폐 손상, 수리 및 해상도의 전 과정을 모방. 그것은 임상 적으로 비교적 안전하고 취급이 용이 점에서 여러 가지 다른 부상 모델에 비해 독특한 장점을 가지고있다.
절차의 중요한 단계는 박테리아 용액의 주입이 매우 느리게 할 필요가 있다는 것이다. 주사가 너무 빠르다면, 마우스는 초크 의해 죽을 가능성이 높다. 성공적으로 주입 한 후, 마우스는 일반적으로 입자가 폐에 들어가 박테리아를 도움이 될 것입니다 몇 가지 깊은 숨 쉬고 헐떡 거림을 보여줍니다.
우리가 사용 된 균주는 PA103 6했다. 이 모델의 중요한 점 중 하나는 P.의 역가 녹농균이 엄격하게 제어 될 필요가있다. P.의 배치 다른 소스에서 녹농균은 다른 염증의 정도와 손상도 보...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 HL105947-01(YL), HL07829-16(AM), HL090152(AM)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마취제: 케타민, 자일라진, 리도카인, 부프레노르핀 | 제약 등급 | ||
| 27 G 바늘 | Fisher | 1482648 | |
| 주사기 | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| 가위 | 파인 사이언스 도구 | ||
| 펜치 | 파인 사이언스 도구 | ||
| 봉합사 | Fisher | 19-037-526 | |
| 아이 게이지, 장갑, 가운 | |||
| 바이오세이프티 캐비닛 | |||
| 염소 산화물 기반 소독제 | 클리독스 | ||
| 양 혈액 아가르 플레이트 | Medex 공급 | HL-1160 |
참고문헌
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