방법 논문

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

DOI:

10.3791/52058

⸱

2015년 1월 2일

 ,  , 
1Abteilung Mikrobiologie, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Osnabrück

이 논문에서

요약

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이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

초록

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바람직한 화학, 광학 및 기계적 특성을 가진 형광 나노 입자 (NPS는) 세포 내 소기관에 레이블 유망한 도구입니다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 엔도 리소좀 시스템 라벨과 세포 내 병원체 살모넬라 엔테 의해 호스트 세포질 통로의 조작을 모니터링하기 위해 골드 - 로다 BSA NPS를 이용하는 방법을 소개한다. NPS는 용이 늦은 엔도 솜 / 리소좀으로 HeLa 세포에 의해 내부화 된 및 집중 하였다. 살모넬라 감염 Salmonella- 유도 막 구조체 및 소포 및 축적 된 NP의 재 배열을 유도. 우리는 공 촛점 현미경 이미지의 정량적 분석을 위해 Imaris 소프트웨어 패키지를 배포. 개체의 개수 및 비감염 세포에서 크기 분포가 매우 WT 살모넬라 엔도 리소좀 시스템의 개장 나타내는 살모넬라 -infected 세포들로부터 구별 하였다.

서론

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등의 금속 NP에, 양자점, NP는 폴리머, 실리카 NP는, 탄소 도트 포함한 형광 나노 입자 (NPS는), 지난 수십 년 동안 1,2- 상당한 주목을 받고있다. 기존의 유기 염료에 비해 형광 NPS는 이러한 강한 신호 강도 photobleaching에 저항과 높은 생체 적합성과 같은 3,4- 바람직한 화학적, 광학적 및 기계적 특성을 보여준다. 이러한 장점은 그 세포 내 감지 및 라이브 세포 이미징에 대한 선택의 방법합니다. 또한, 전자 밀도가 된 NP의 다양한 EM 5 초 미세 수준에서 광학 현미경 (LM)과 높은 해상도로 추적 라이브 셀의 조합을 할 수 있습니다 상관 현미경 분석에 대한 사용을 촉진, 전자 현미경 (EM)로 볼 수 있습니다. 예를 들어, 금 NPS는 효율적 민감한 진단 살아있는 세포뿐만 아니라 면역 표지 (6)의 분야에서 바이오 센서로서 사용 장시간왔다. 최근의tudies 다른 크기 및 형상 골드 NPS에서 세포주 많은 다양한 흡수는 일상적 엔도 좀 경로를 통해 운송, 따라서 큰 잠재력의 존재는 세포 내 소포 반송 추적 및 엔도 리소좀 시스템 라벨링 적용될 용이하게 할 수 있음을 나타내 7,8 .

살모넬라 엔테, 시겔 flexneri 및 리스테리아 균 등의 미생물 병원균, 비 식세포 숙주 세포 9 침입하는 다른 메커니즘을 개발했습니다. 내면화 한 후, 병원균, 중 세포질에 지역화 또는 막 결합 구획에 압수은, 자신의 호스트 환경과 상호 작용하고 자신의 생존 (10)를 선호하는 이들을 조절. 예를 들어, 살모넬라 엔테는 상주하며 세포 내 phagosomal 구획 감염 11시 살모넬라 함유 공포 (SCV)를 지칭 내에서 복제합니다. 성숙 SCV, 골지체으로 트래픽 세포 내 이입 경로와 지속적으로 상호 작용을 진행하고, 살모넬라 유도 된 필라멘트와 같은 광범위한 관상 구조, (SIF), 넥신 세관 정렬, 살모넬라 유도 된 분비 캐리어 막 단백질 3 (SCAMP3) 세관 등의 형성을 유도 . 12 ~ 14. 이러한 병원성 세균이 숙주 세포 경로를 조작하는 방법을 공부하는 것은 이해 감염성 질환에 필수적이다.

여기서, 금 BSA-로다 된 NP는 숙주 세포 엔도 리소좀 시스템에 라벨 유체 추적자로 사용하여, 인간의 위장관 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (살모넬라)와 병원체의 상호 작용을 연구하는 모델 박테리아로서 사용 세포 내 이입 통로를 개최. WT 살모넬라 돌연변이 균주에 감염된 비감염 세포와 세포에서의 세포 내 금 BSA-NP에 로다는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 촬영 하였다.이어서 Imaris 소프트웨어는 살모넬라 감염 엔도 좀 / 리소좀 극단적 재 배열을 유도 나타내는 NPS에서의 분포를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 설명에 이어, 유사한 실험은 내재화 된 NP의 장기 거동을 추적 및 진핵 세포의 세포 내 이입 경로에 다양 외인성 또는 내인성 인자 물질의 영향을 조사하기 위해 설계 될 수있다.

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프로토콜

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10 nm의 금 나노 입자 (골드 NP에) 15 1. 합성

  1. 솔루션을 준비 : 160 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 2 ml의 1 % 수성 금 염화을 추가합니다.
  2. 용액 B를 준비 : 32 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 8 ml의 1 % 트라이 구연산 나트륨 × 2 H 2 O 160 ㎕의 1 % 타닌산을 추가합니다.
  3. 60 ° C에 용액 A와 B를 따뜻하게하고 교반하면서 그들을 섞는다. 바로 다크 블루 색상을 관찰합니다. 약 15 분 후 붉은 색을 관찰한다. 그 후, 95 ° C까지 가열 5 분을 유지하고 RT에 대한 해결책을 냉각.
  4. 탄소 코팅 격자에 NP 현탁액의 드롭을 추가하고 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과형 전자 현미경으로 된 NP의 크기 및 형태를 확인한다.

로다 민 N-히드 록시 숙신 에스테르 (NHS)와 BSA와 레이블 골드 NP에 2. 코팅 (16)

  1. 30 분 동안 15,000 XG에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 900 μL에게 원심 분리기를 금 NPS를 추가합니다. 연산전통적, 5 월 한 번에 여러 개의 튜브를 준비합니다.
  2. 900 μL의 펠렛 살균 밀리 Q 물을 다시 중단하고 100 μL 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS를 추가, 상층 액을 버리고 30 분 동안 800 rpm으로 소용돌이에 섞는다.
  3. 초과 BSA를 제거하려면 60 분 동안 15,000 XG에서 준비를 원심 분리기.
  4. 상층 액을 제거하고, 125 μl의 PBS에서 금 BSA NPS를 다시 일시 중지, 1 M 중탄산 12.5 μl를 추가합니다.
  5. 즉시 사용하기 전에, 로다 민 NHS / DMSO의 10 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 금 BSA NP에 현탁액 1ml를 할 로다 민 NHS / DMSO 용액 30 μl를 추가합니다. 빛에 노출을 피하고, 800 rpm으로 혼합 동안 실온에서 2 시간 (또는 O / N)에 대한 반응을 품어.
  6. 48 시간 - 36의 기간 동안 5 버퍼 변경 4 ºC에서 PBS에 대한 투석을 통해 금 BSA-로다 민 NPS를 정화.
  7. , NPS를 안정화 각 1 ml의 금 BSA-로다 민 NP에에 200 ㎎ / ㎖ BSA / PBS의 10 μl를 추가합니다. 15, 무료 또는 BSA-로다 민 발표 원심 분리기를 제거하려면,60 분 동안 000 XG. 빛에 대한 노출을 피하기 위해, 4 ° C에서 OD (520), 및 저장소를 측정, 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS에 펠렛을 재현 탁.
  8. 밀리-Q 또는 더블 증류수로 NP에 10 배 희석, 탄소 코팅 격자 상에 드롭을 추가하고, 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 NP에의 크기 및 형태를 확인한다.
    주 : NP 제제에서 사용되는 모든 재료는 멸균시키고, 동작은 세포 배양 후드에서 화염 또는 옆 벤치에 행 하였다.

HeLa 세포 3. 문화

  1. 영구적 LAMP1-GFP를 발현하는 HeLa 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS)와 DMEM에서 배양하고, 5 % CO 2를 함유하는 분위기하에 37 ℃에서 성장된다.
  2. 8 잘 챔버 슬라이드 (Ibidi)에서 잘 50,000의 밀도로 세포를 종자 및 / N을 O를 품어.

박테리아 4. 문화

  1. 사용 살모넬라 엔테 혈청 형 Typhimurium의 NCTC 12023 줘야D 타입 (WT) 변형. 비교를 위해, SIF에 대한 키 이펙터 시파 부족 SPI2-T3SS 및 Δ 시파에서 Δ ssaV 결함이있는 돌연변이 균주를 사용합니다. 강화 된 GFP의 구성 적 발현 플라스미드 pFPV25.1을 품고 균주를 사용합니다.
    참고 : 세균 균주가 50 ㎍ / ㎖의 카르 베니 실린 및 / 또는 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 (Δ ssaV, Δ 시파의 추가와 함께 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 (WT)와 LB의 추가와 함께 (LB) 루리아 - 베르 타니 국물에 일상적으로 배양 )의 플라스미드를 유지하는 데 필요한.
  2. 다음 신선한 LB에 1:31 희석 3.5 시간 동안 성장을 계속, 적절한 항생제로 3 ㎖ LB에서 박테리아의 단일 콜로니를 접종하고 폭기 진탕 조건에서 37 ºC에서 / N을 O 성장. 이 시간 시점에서 배양 후반 로그 상에 도달하고 박테리아 매우 침습적이다. '롤러 드럼'폭기 테스트 튜브 문화를 배양하는 것이 편리하다.

HeLa 세포의 감염에 의해 5.살모넬라 균과 골드 BSA-로다 민 NPS는 체이스 - 라벨 (방식에 대한 그림 1 참조) 펄스

  1. 계대 배양 균의 OD (600)를 측정하고 1 ㎖의 PBS (~ 3 × 108 CFU / ㎖) 600 = 0.2 중독 묽은의 다양성을 달성하기 위해 8 웰 챔버 슬라이드에서 HeLa 세포에 박테리아의 적당량을 추가 감염 100 (MOI).
  2. 비 내면화 박테리아를 제거하기 위해 PBS로 3 회, 세포 배양기에서 30 분 동안 인큐베이션 세척 (이 시점을 0 시간의 감염 후, 0 시간 또는 파이로 설정 하였다). 100 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 함유하는 신선한 배지 300 μl를 추가하고 1 시간 동안 유지한다. 그런 다음 배양 시간의 나머지 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 매체와 매체를 교체하십시오.
  3. 1 시간 동안 100 ㎍ / ㎖의 젠타 마이신을 함유하는 배양 배지로 배양 한 후, 배지는 공동 (30 mM의 HEPES, pH가 7.4, FCS, L 글루타민, 페놀 레드 및 중탄산 나트륨없이 이글스 MEM) 매질을 묘화로 대체10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 ntaining. 골드 BSA-로다 NPS는 OD = 0.1 (520)의 최종 농도를 얻기 위해 HeLa 세포에 첨가 하였다.
    참고 : 골드 BSA-로다 민 NPS는 또한 감염 전에, 또는 다양한 시간 포인트 파이에서 세포에 첨가 할 수있다
  4. 1 시간 배양 한 후, 배지를 제거 PBS로 3 회 세척하고, 배양 시간의 나머지 10 % FCS 및 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 영상 매체의 300 μl를 추가합니다.
    참고 : 배양 기간이 사용 된 NP 및 세포주의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. RAW264.7 대 식세포를 위해, 우리는 충분히 내재화 허용 OD 520 = 0.05의 농도로 된 NP와 그 30 분의 인큐베이션을 관찰했다.

6. 이미징

  1. 서로 다른 시간 지점에서 고해상도 이미징을위한 가습 환경 챔버와 공 초점 레이저 주사 (CLSM) 또는 회전 디스크 (SD) 현미경으로 공 초점 이미징 시스템을 사용합니다.
  2. 온도 C에 스위치가 안정 될 때까지 시스템을 조작부 기다립니다. 이러한 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택 등 GFP에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 금 BSA-로다 민 NP에 같은 이미지 설정을 최적화합니다. 이 프로토콜의 경우, 512 X 512 픽셀의 400 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 μm 인 Z-스텝 크기를 사용한다. GFP 각각 아르곤 레이저 (488 nm의)와 헬륨 네온 레이저 (543 nm의)를 사용하여 금 BSA-로다 민을 흥분. 세포의 형태를 관찰하기위한 명 시야 (BF) 채널을 포함. 현미경 시스템 및 다른 감염 조건의 경우, 설정은 적절하게 조정되어야한다.
    참고 사진 승수 (PMT) 검출기로 검출 된 BF 채널과 신호의 광원과 같은 아르곤 레이저를 사용합니다.
  3. 표시된 시간 - 점에서 PI, 스테이지 현미경 및 기록 이미지에 감염된 세포를 함유하는 8 웰 챔버 슬라이드 마운트.

이미지 7. 분석

  1. 현미경 이미지 분석 소프트웨어를 사용 (참조 살모넬라 균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 개조를 분석합니다. '열기'를 클릭하고 파일을 선택하여 데이터를 엽니 다.
    참고 : 또한, 같은 ImageJ에 나 피지 같은 오픈 소스 소프트웨어 패키지 양적 이미지에 사용될 수있다 분석한다.
  2. 아이콘 뷰를 능가 클릭의 개체 도구 모음에서 figure-protocol-1 새로운 표면 항목을 추가 할 수 있습니다. 에 클릭 figure-protocol-2 (다음).
  3. 관심 (ROI)의 지역을 선택 세그먼트 ROI를 분석합니다. 보기 영역에서 이미지 위에 겹쳐 사각형 테두리가 절에서는 투자 수익 (ROI)을 대표한다. Y-, 해당 x 축에 값을 입력하고 Z- 필드 또는 직접 크기와 ROI의 위치를​​ 변경하려면 미리보기 사각형에 화살표를 클릭합니다. 다음을 클릭합니다 figure-protocol-3 = "/ 파일 / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg"/> (다음).
  4. 소스 채널로 선택 채널 3 (금 BSA-로다 민 NP에 대한 신호). 결과 영역의 부드러움을 설정하는 부드러운 옵션을 선택합니다. 수동으로 값을 정의 또는 자동으로 생성 된 값을 적용합니다. 임계 값의 경우, 절대 강도 옵션을 선택합니다.
  5. 임계 조정 용의 옵션을 선택하고 값을 설정. 보기 영역에서, 표면 임계 미리보기가 회색으로 표시됩니다.
  6. 탭 분류 표면에 생성 된 표면은 여러 기준에 의해 필터링 할 수 있습니다. 기본 필터는 다른 필터 '복셀> (10)의 수'는 '추가'를 클릭하여 포함시킬 수있다. 필터링이 필요없는 경우, 삭제 버튼을 클릭하여 모든 필터를 삭제합니다. 클릭 figure-protocol-4 (다음).
  7. 표면 생성을 완료하려면 클릭/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg은 "/> (마침). 개체 목록에서 지금 확인되지 않은 항목의 볼륨 및 새로 생성 한 표면의 상자 것은보기 영역에 표시됩니다.
  8. 통계를 내 보냅니다. 이제 능가보기에서 대상의 색상은 지역에 따라 보라색에서 빨간색으로 변화한다. 그리고 '플롯 번호 영역'표는 통계 정보 (예를 들어, ID 번호와 객체의 영역)를 보여줍니다. 클릭하여 Excel 파일을 사면 (1)의 모든 통계를 내 보냅니다 figure-protocol-5 (저장).

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결과

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골드 NPS는 구연산과 타닌산에 의해 염화 금산의 감소를 통해 확립 된 방법을 통해 생성되었다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 합성 금 NPS는 약 10 nm의 크기와 모양에 준 구형이다. BSA 코팅 및 로다 민 - 라벨은 형태 나 크기 (그림 2B)에 영향을 미치지 않았다.

이것은 금 NP에 용이 다양한 포유 동물 세포에 의해 흡수 및 세포 내 이입 시스템 (7)에서 종료 할 수 있다고보고되었다. 기존의 연구에 따르면, 밝은 적색 형광 신호는 세포의 NP에 효과적으로 내재화를 나타내는, 금 BSA - 로다 민 NP는 (도 3, WT 5 열연 PI)와 함께 1 시간 배양 후 HeLa 세포에서 관찰되었다. 빨간 신호의 대부분은 국민 연금이 늦게 엔도 솜 또는 리소좀에 국한되었다는 것을 보여주는, 녹색 신호와 colocalized 발견되었다. 그러나 후반 엔도 솜 /...

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토론

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포유류 세포의 엔도 리소좀 시스템은 영양소 흡수, 호르몬 - 매개 신호 전달, 면역 감시 및 항원 제시 (17)과 같은 중요 생리 학적 과정을 제어한다. 지금, 마커의 다양한 세포 내 이입 경로 및 추적 연구의 표지에 사용 된 최대. 예를 들어, LysoTracker 프로브는 선택적으로 낮은 내부 pH가 세포 구획에 축적하고 효과적으로 나노 몰 농도 18 살아있는 세포에 레이블을 지정할 수 있습니다 리소좀 라벨링에 대한 분자 프로브 (생명 기술, USA)에 의해 개발 된 형광 acidotropic 프로브입니다. 그러나, 세포 LysoTracker 프로브의 긴 시간 배양 리소좀 pH의 증가를 유도하고 리소좀 (19)의 잠재적 인 생리적 변화가 발생할 수 있습니다. 이러한 형광 표지 된 덱스 트란과 같은 일부의 생체는 자주 엔도 / 리소좀 라벨에 사용된다. 그러나, 낮은 광 안정성, 짧은 순환 수명, P주시를 OOR 유지 장기 라이브 세포 이미징에 응용 프로그램을 방해하고...

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공개 사항

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이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

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이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft의 지원을 받아 Sonderforschungsbereich 944 'Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments' 및 HE1964/18 in priority program 1580의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화 금시그마-알드리치, 520918
타닌산시그마-알드리치,403040
시트르산 삼나트륨시그마C8532
소 혈청 알부민시그마A2153
NHS-로다민피어스46406
DMSO시그마D8418
HEPESSigmaH3375
GentamicinApplichemA1492
KanamcyinRothT832
CarbenicillinRoth6344
8웰 챔버 슬라이드Ibidi80826조직 배양 처리, 멸균
Imaris 소프트웨어Bitplane버전 7.6다양한 구성 사용 가능
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참고문헌

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