이 논문에서는 절단에 대한 특별한 수정(예: 자당 첨가) 없이 절단 준비 전에 동물의 심내 관류 없이 기존의 생리학적 용액을 사용하여 생리학적 온도에서 급성 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에서 우리는 급성 뇌 조각의 준비를위한 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 크게 결과의 품질을 결정하는 전기 생리 패치 클램프 실험을위한 중요한 요소이다. 이 절차를 절단하는 동안 냉각 단계를 생략하는 성숙한 동물에서 매우 유수의 뇌 구조를 다루는 특히, 건강한 슬라이스와 세포를 얻는 데 도움이되도록 표시되었습니다. 승온 만에 추측 할 수 신경 건강을 지원함으로써 정확한 메커니즘은, 그것이 그 추론하기 위하여 스탠드에도 가능한 한 슬라이싱이 수행되는 온도는 온도 관련 아티팩트를 방지하는 생리 학적 조건에 근접한다. 이 방법의 또 다른 중요한 장점은 절차의 단순성 때문에 짧은 준비 시간이다. 증명 방법에서는 성인 마우스는 사용되지만 동일한 과정 어린 마우스뿐만 아니라 래트에 적용 할 수있다. 또한, 다음 패치 카스티A 실험 수평 소뇌 슬라이스 수행되지만 동일한 절차가 다른 평면뿐만 아니라 뇌의 다른 후방 영역에서 사용될 수있다.
서론
제시된 방법의 목적은, 특히 성인 또는 이전 동물을 사용하는 경우, 시험 관내 전기 생리 학적 실험을 위해 고품질 급성 뇌 조각을 얻을 수있다.
두 우아한 문장 Skrede과 Westgaard 1에 의해 설명 된 바와 같이 급성 뇌 분할 방법은, 현대 신경 과학 연구의 기초 중 하나가되었습니다 전 세계적으로 수많은 변형에 사용된다. 슬라이스 품질 슬라이스 당 뉴런 생활의 수에 반영되는 시간의 기간 동안 세포는 조직의 무결성뿐만 아니라 자신의 전기 생리 학적 및 형태 학적 특성을 유지한다. 또한, 안정된 기록 용 최대 기간은 조각의 품질에 의존한다. 따라서, 수십 따라, 원래 슬라이싱 방법은 상기 절단 조성물의 복잡한 변형에 의해 종종 2-10을 절단 후 슬라이스 복구를 강화하기 위해 개별 연구 그룹에 의해 개발 된 오뿐만 아니라 냉각 생리 솔루션과 동물의 내 심장 미리 관류 (예 : 아스 코르 빈산, 티오 우레아 또는 H 2 O 2를 추가하는 등) R 복구 솔루션.
최근 11를 표시 한 바와 같이, 슬라이스 동안 생리적 온도는 신경 세포의 건강에 냉각보다 더 도움이 될 것 같다; 성인 (2~8개월) 설치류와 함께 작업 할 때 개선이 가장 눈에 띄는입니다. 극적인 온도 변화를 방지 인해 이러한 가소성 (13)와 이온 채널 반응 속도 13, 14 등의 세포에서 온도에 따라 프로세스에 아티팩트를 방지 할 수 있습니다. 이러한 변화는 막 전압 및 세포 내 칼슘 신호, 스파이크 임계 값에 영향을 미치는, 모양 스파이크 수 있습니다.
여기서 제시된 "핫"급성 슬라이스 제조 방법은, 임의의 뇌 영역에서 고품질의 급성 뇌 조각을 획득 소뇌 피질 및 해마, 뇌간 16 핵을 포함하는 일반적인 절차 </ SUP>뿐만 아니라 후각 망울로, 모두 쥐와 생쥐.
특히, 생리적 온도 슬라이싱 절차는 절단 날이 거의 완벽하게 수평 진동 및 구조적 결함이없는 것을 필요로한다. 정밀 이전 슬라이서 모델 달성하지 않을 수 있습니다; 저온 대사 수차의 비용해도, 기계적 손상 조직 저항력 만들 것 같은 경우에, 우리는 동결 - 냉각 조건 슬라이스 준비를 수행 권장.
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프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 모든 실험 절차는 히브리 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 슬라이스에 대한 솔루션 및 도구 준비
- 표 1에 기재된 이온을 함유하는 표준 생리 용액 (SPS)의 1 L를 준비한다.
- 탈 이온수 (0.055 μS / cm의 전도도) 1,000 ml로 채워진 저장소 유리 병에 미리 10 배의 최종 농도에서의 염을 함유하는 스톡 용액을 준비한다. 소금 (염화나트륨, KCl을, KH 2 PO 4, 황산)을 추가하고 완전히 용해 될 때까지 저어. 4 ℃에서 원액을 저장합니다.
- 실험 당일 최종 SPS 용액을 확인. 자기 교반 막대를 이용하여 글루코스 (3.6 g)과의 NaHCO3 (2.18 g)을 용해, 정제수 700 ml의 스톡 용액 100 ㎖를 첨가하고, 그 다음 1 L. 정제수 위로 추가
- soluti를 평형에서 ~ 20 분 동안 95 % O 2 / 5 % CO 2 가스 처리를하여. 이 후, 1 M CaCl2를 용액 2 ㎖를 추가합니다.
- 다음과 같은 도구 (그림 1)를 조립합니다.
- 두개골을 여는 큰 가위 잘린 다른 도구, 작은 수술 가위를 준비, 뇌를 노출 뇌의 원하는 부분을 해부를 위해 블레이드와 메스 두개골을 리프팅을위한 좋은 팁 집게는 슬라이스를 조작하기위한 작은 주걱한다 해부하는 뇌의 부분.
- 또한, 뇌에서 초과 액체를 제거하기 위해 필터 종이의 작은 조각을 준비, 뇌에 대 한 두 개의 작은 페트리 접시에 뇌를 붙이는 포함 따뜻하게 정제 물과 SPS, 및 시아 노 아크릴 레이트 접착제에 대해 두 개의 유리 500 ml의 비커에 해부한다 분할 단계.
- 분할 및 복구 차에 슬라이스 화장실에서 조각을 이동하는 입이 큰 유리 파스퇴르 피펫 동안 조각을 처리하기위한 작은 브러시를 준비합니다mber. 따뜻한 슬라이스 화장실에서 박테리아의 성장을 방지 할 수있는 도구를 소독. 또한, 깨끗한 실험실 장갑을 사용합니다.
- 깁과 에드워즈 (15)에 의해 기술 등의 침수 슬라이스 복구 챔버를 준비합니다. 지속적으로 95 %, O2 / 5 % CO 2로의 SPS를 가스와 36 ° C로 유지한다. 가스 처리에 슬라이스가 손상 될 수 욕조에 갇혀 작은 기포가 발생하지 않는 것을 확인하십시오.
- 따뜻한 ~ 자석 교반기 또는 수조에 히터 접시에 36 ° C의 SPS 300 ml의. 히터 플레이트가 사용되는 경우, 이온 침전 될 수 과열로부터 용액을 방지하기 위해주의를 기울여야. 경우는, 대신에 이전의 냉각 따뜻한 신선한 SPS 발생합니다.
- 전기 주전자를 사용하여 끓여 정제수 ~ 500 ml의를 가져오고, 비커, 슬라이싱 온도보다 약간 따뜻한 물을 얻기 위해 차가운 물로 300 mL로 결합한다. 이 잘린 동안 정제 물을 데워 사용하고 remai를 사용나중에 분할 목욕의 생리적 온도를 유지하기위한 삶은 물 닝.
- 복강 내에 펜토 바르 비탈 0.1 ㎖ (60 ㎎ / ㎖)을 주입하여 마우스를 마취시키다. 몇 분 후 동물이 감각의 부족을 확인하기 위해 강력한 발가락 또는 꼬리 핀치에 응답하지 않습니다 있는지 확인하십시오.
2. 뇌를 해부
- 두개골의 뒷면 근처 큰 가위로 목을 절단하여 마우스를 빠르게 목을 벨, 그리고 머리가 초과 혈액을 씻어 따뜻하게 정제수로 비커에 빠질 수 있습니다.
- 아마도 작은 가위로 목을 더 제거, 목의 근육과 피부 아래 두개골에서 난원 매그넘 노출.
- 명확 두개골의 개구를 안내하기 위해 두개골 봉합을 볼 수 있도록 두개골 위에 피부를 당겨.
- 난원 매그넘을 통해 작은 가위의 하단 끝을 삽입하고 즉시 기수를 돌려 열린 두개골을 잘라측면. 부드럽게 눈과 frontoparietal 봉합 뒤에 위치로 정수리 뼈까지의 측면 가장자리를 따라 잘라; 그 다음, (도 2a에 녹색 점선 참조) 두개골의 중심을 향해 회전과 두개골의 다른쪽에 정중선을 가로 질러.
- 좋은 팁 집게를 사용하여 (그림 2A 노란색 점선 화살표 참조) 뇌를 노출 비스듬히 frontoparietal 모서리에서 두개골을 들어 올려 비스듬히 당겨합니다. 두개골 들어 올릴 때 뇌가 장소에 머물 수 있도록 두개골, 머리의 뼈 또는 피부에 부착되지 않았는지 확인합니다. 뇌가 두개골로 움직이는 경우, 두개골과 뇌 사이의 결합 조직을 제거하는 작은 가위를 사용한다.
- 뇌가 노출되면, 뇌가 건조하는 것을 허용하지 않는다. 두개골과 따뜻하게 가득 페트리 접시의 뇌를 유지하면서 따라서, 다음 단계를 수행, SPS를 가스실.
- 전자에 사용되는 뇌의 일부를 분리메스와 주걱을 이용하여 뇌의 나머지 xperiment. 소뇌를 사용하는 경우, (그림 2B-D에 붉은 라인을 따라) 중뇌와 뇌교를 통해 하나의 컷에 의해 전뇌에서 분리하고 신선한 포함하는 작은 페트리 접시로 이동, SPS를 가스실.
- 수평면에서 소뇌를 슬라이스 할 때 무대를 절단에 뇌를 붙이는 직선과 넓은 기반을 형성하는 뇌간을 제거합니다. 전뇌에서 절단 된면이 아래로 향하도록 간단히 필터 종이의 젖은 부분에 소뇌를 배치합니다.
- (그림 2B에서 파란색 선으로 표시됨)의 기본을 형성하는 메스와 뇌간을 차단하고, SPS에 소뇌를 반환합니다. 절단의 다른면이 필요할 때, 그에 따라 소뇌 블록 (그림 2C & D에 파란색 선)을 트림.
3. 뇌 조각화
- 가 D가되는 것을 확인하는 의해 절단 단계 준비공예, 무대의 중앙에 superglue의 작은 방울을 적용하기 전에.
- 올바른 쪽이 위로 주걱을 사용하여 SPS에서 뇌 블록을 들어 올리고 필터 종이의 작은 조각을 사용하여 뇌에서 초과 액체를 제거합니다. 그런 다음, 하나의 움직임, 무대에서 접착제의 드롭에 주걱의 두뇌를 밀어 넣습니다.
- 건조으로부터 뇌 조직의 측면에 닫 실행 한 접착제를 방지하기 위해, 파스퇴르 피펫 SPS의 몇 방울을 적용하고 슬라이싱 챔버에서 절단 단을 배치. 관심 영역 (예 : 소뇌 피질) 블레이드를 향하도록 뇌 블록을 맞추고, 따라서 분리되기 전에, 기계적 압력의 최소량을 실시한다.
- 끊임없이 절단 실에서 SPS 가스 처리뿐만 아니라 34-37 ° C에서의 온도를 유지하면서 제조업체의 지시에 따라 각 조각을 잘라. 통근자를 충전함으로써,이 범위에서 절단 실의 온도 유지가온 정제수 온도가 너무 낮게 떨어질 때마다 물 교체와 슬라이서의 알 챔버.
참고 : 분할 매개 변수를 실험적으로 검토되고있는 조직과 신경 세포의 각 유형을 찾을 수 있어야합니다. 세라믹 블레이드와 소뇌 골지 세포와 캠든 SMZ 700 슬라이서의 경우 0.75 mm의 진동 진폭 65 Hz에서 0.05 mm / sec의 속도의 발전을 사용; 소뇌 핵 신경 세포 높은 진폭과 주파수 (1mm, 90 Hz에서, 각각)와 느린 진행 속도 (0.01-0.02 mm / 초)을 권장합니다. 골지과 소뇌 핵 신경 세포 모두를 들어, 슬라이스 두께 300 μm의를해야한다. - 슬라이싱 동안, 조각 자체에 접어 허용하지 않습니다. 부드럽게 바람직뿐만 아니라 실험에 관심이있는 지역에서 조각을 터치, 부드러운 브러시로를 지원함으로써이 문제를 방지합니다. vibratome 블레이드를 만지지 브러시를 방지하기 위해주의; 특히 세라믹 블레이드 경우에도 광 접촉블레이드가 손상 될 수 있습니다.
- 입이 큰, 화재 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버를 유지 / 복구에 분할 실에서 각 조각을 이동합니다.
- 슬라이스 실험을 시작하기 전에 최소한 1 시간 동안 챔버 휴식하자. 이 손상되거나 죽어가는 조직과 세포의 분해를 허용함으로써 청소기 슬라이스 표면에 발생합니다. 처음 시간 동안 34-36 ° C의 범위의 챔버 내에 SPS의 온도 유지; 슬라이스는 슬라이스가 손상되거나이 떠 할 수 기포에 감동되지 않도록.
4. 실험
- 1 시간 후, 복구 챔버 온도를 실온 (17 ~ 25 ° C에서)까지 냉각 할 수 있습니다.
NOTE :이 슬라이스는 박테리아의 성장뿐만 아니라 세포 대사를 느리게하여 사용할 수있는 기간을 연장시킬 수있다. 이 기간은 뇌 영역 및 세포의 종류에 따라 달라집니다. 예를 들어, 골지체 특정 유형의 세포 조각이 건강한 것으로 판명 될 수있다8 시간 다른 유형 반면 절단 후 만 6 시간 지속. - 1 시간이 슬라이스에서 전달 된 후, 다양한 전기 생리학 실험에 대한 슬라이스를 사용합니다.
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결과
기술 된 방법으로 제조 슬라이스 다양한 전기 생리 및 optogenetic 실험에 사용될 수있다. 도 3a 및도 3c에서, 우리는 각각의 차동 간섭 (DIC) 하에서 광학 보아 수평 소뇌 슬라이스 관상 대뇌 피질 슬라이스의 대표적인 예를 나타낸다. 소뇌 슬라이스에서, 소뇌 뉴런 여러 종류의 용이, 그들의 위치 및 셀 체형에 의해 인식 될 수있는 전기 생리 녹화 대상으로 허용한다. 그림 (b)와 3D에서, 예 표시됩니다 자발적으로 활동 소뇌 골지 세포와 대뇌 피질의 피라미드 세포에서 현재 클램프 모드에서 전체 셀 패치 클램프 녹음에서 추적합니다. 핫 슬라이스 뇌로부터 얻어지는 전기 생리 및 optogenetic 레코딩의 품질의 다른 예는 황과 Uusisaari 11 레플러 등. (16)에서 찾을 수있다.
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토론
우리는 생리 대신 빙냉 온도 마우스로부터 급성 뇌 조각을 제조하는 방법을 보여준다.
또한, 추운 상태로 제조와 비교시 따뜻한 조건에서 얻어진 조각의 품질이 우수하다는 11 도시 슬라이서 블레이드 최소한 수직 진동을 가지고 제공되었다. 생리적 온도에서 슬라이스는 단일 셀의 수차뿐만 아니라 네트워크 동작에 명시 할 수있다 대사 과정 17 ~ 19의 변화에 관련된 것과 낮은 온도에 의한 생리 학적 유물을 방지 할 수 있습니다. 또한, 슬라이싱 절차가 분명히 불필요한 지연없이 완료되어야하더라도, 용액이 너무 뜨거워 질 전에 절단을 완료하기 위해 빙냉 조건 슬라이싱 때 그대로 (슬라이싱과 서둘러하고 방지 할 필요가 없다 조직의 오래 지속 동결에 의한 손상). 따라서, 느린 절삭 속도는 우리가 될 수 있습니다ED. 이것은 매우 섬세한 구조를 자르는 경우에 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 두 용액의 뇌의 냉각 단계를 생략하는 것은 상당히 절차뿐...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 이 방법을 검증하는 데 Shiwei Huang 박사(호주 국립 대학교)가 크게 기여한 것에 감사드립니다. 또한, 골지세포에 대해 도움이 되는 의견을 제시해 주신 Kasia Pietrajtis 씨와 피질 실험 데이터에 대해 말씀해 주신 Vitaly Lerner 씨에게 감사드립니다. 이 작업은 PITN-GA-2009-238686(CEREBNET), FP7-ICT(REALNET), ELSC 및 ISF의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 펜토바르비탈 | CTS | 170066 | : 생리식염수 60mg/ml. |
| 큰 가위 | FST | 14001-16 | 날카로운 모서리를 가진 큰 가위나 단두대는 참수에 사용할 수 있습니다 |
| 홍채 가위 | 프레스티지 메디컬 | 48,148 | 가위날이 1.5–보다 길지 않다면 어떤 세밀한 팁 가위도 사용할 수 있습니다; 2cm |
| 파인 팁 집게 | FST | 11254-20 | |
| 메스 | FST | 91003-12 | |
| 메스 블레이드 #11 | FST | 10011-00 | |
| 작은 주걱 | 어부 | 2350 | |
| 여과지 | 모든 실험실 브랜드를 사용할 수 있습니다. | ||
| 페트리 접시 | Duroplan | Z231509-1 | |
| 유리 비커 | SCHOT | 10022846 | |
| 파스퇴르 피펫 | 메이플 리프 브랜드 | 14672-029 | |
| 슈퍼 글루 | LOCTITE | 4091361/1 | |
| 슬라이서 | Campden | 7000-smz | |
| 세라믹 슬라이싱 블레이드 | Campden | 7550-1-C | |
| 자기 히터/교반기 | 절차를 위한 SPS 가열용 | ||
| 전기 주전자 | 온도 제어를 위한 물 가열용 | ||
| 슬라이스 회수실 + 가열 장치 | Warner 악기 | BSC-HT + BSC-BUW | 자체 제작 모델도 사용할 수 있습니다. |
| 온도계 | 해부 및 슬라이싱 중 SPS 온도 모니터링용 |
참고문헌
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
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