이 논문에서는 절단에 대한 특별한 수정(예: 자당 첨가) 없이 절단 준비 전에 동물의 심내 관류 없이 기존의 생리학적 용액을 사용하여 생리학적 온도에서 급성 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에서 우리는 급성 뇌 조각의 준비를위한 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 크게 결과의 품질을 결정하는 전기 생리 패치 클램프 실험을위한 중요한 요소이다. 이 절차를 절단하는 동안 냉각 단계를 생략하는 성숙한 동물에서 매우 유수의 뇌 구조를 다루는 특히, 건강한 슬라이스와 세포를 얻는 데 도움이되도록 표시되었습니다. 승온 만에 추측 할 수 신경 건강을 지원함으로써 정확한 메커니즘은, 그것이 그 추론하기 위하여 스탠드에도 가능한 한 슬라이싱이 수행되는 온도는 온도 관련 아티팩트를 방지하는 생리 학적 조건에 근접한다. 이 방법의 또 다른 중요한 장점은 절차의 단순성 때문에 짧은 준비 시간이다. 증명 방법에서는 성인 마우스는 사용되지만 동일한 과정 어린 마우스뿐만 아니라 래트에 적용 할 수있다. 또한, 다음 패치 카스티A 실험 수평 소뇌 슬라이스 수행되지만 동일한 절차가 다른 평면뿐만 아니라 뇌의 다른 후방 영역에서 사용될 수있다.
서론
제시된 방법의 목적은, 특히 성인 또는 이전 동물을 사용하는 경우, 시험 관내 전기 생리 학적 실험을 위해 고품질 급성 뇌 조각을 얻을 수있다.
두 우아한 문장 Skrede과 Westgaard 1에 의해 설명 된 바와 같이 급성 뇌 분할 방법은, 현대 신경 과학 연구의 기초 중 하나가되었습니다 전 세계적으로 수많은 변형에 사용된다. 슬라이스 품질 슬라이스 당 뉴런 생활의 수에 반영되는 시간의 기간 동안 세포는 조직의 무결성뿐만 아니라 자신의 전기 생리 학적 및 형태 학적 특성을 유지한다. 또한, 안정된 기록 용 최대 기간은 조각의 품질에 의존한다. 따라서, 수십 따라, 원래 슬라이싱 방법은 상기 절단 조성물의 복잡한 변형에 의해 종종 2-10을 절단 후 슬라이스 복구를 강화하기 위해 개별 연구 그룹에 의해 개발 된 오뿐만 아니라 냉각 생리 솔루션과 동물의 내 심장 미리 관류 (예 : 아스 코르 빈산, 티오 우레아 또는 H 2 O 2를 추가하는 등) R 복구 솔루션.
최근 11를 표시 한 바와 같이, 슬라이스 동안 생리적 온도는 신경 세포의 건강에 냉각보다 더 도움이 될 것 같....
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프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 모든 실험 절차는 히브리 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 슬라이스에 대한 솔루션 및 도구 준비
- 표 1에 기재된 이온을 함유하는 표준 생리 용액 (SPS)의 1 L를 준비한다.
- 탈 이온수 (0.055 μS / cm의 전도도) 1,000 ml로 채워진 저장소 유리 병에 미리 10 배의 최종 농도에서의 염을 함유하는 스톡 용액을 준비한다. 소금 (염화나트륨, KCl을, KH 2 PO 4, 황산)을 추가하고 완전히 용해 될 때까지 저어. 4 ℃에서 원액을 저장합니다.
- 실험 당일 최종 SPS 용액을 확인. 자기 교반 막대를 이용하여 글루코스 (3.6 g)과의 NaHCO3 (2.18 g)을 용해, 정제수 700 ml의 스톡 용액 100 ㎖를 첨가하고, 그 다음 1 L. 정제수 위로 추가
- soluti를 평형에서 ~ 20 분 동안 95 % O 2 / 5 % CO 2 가스 처리를하여. 이 후, 1 M CaCl2를 용액 2 ㎖를 추가합니다.
- 다음과 같은 ....
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결과
기술 된 방법으로 제조 슬라이스 다양한 전기 생리 및 optogenetic 실험에 사용될 수있다. 도 3a 및도 3c에서, 우리는 각각의 차동 간섭 (DIC) 하에서 광학 보아 수평 소뇌 슬라이스 관상 대뇌 피질 슬라이스의 대표적인 예를 나타낸다. 소뇌 슬라이스에서, 소뇌 뉴런 여러 종류의 용이, 그들의 위치 및 셀 체형에 의해 인식 될 수있는 전기 생리 녹화 대상으로 허용한다. 그림 (b)와 3D에서, 예 표시됩니다 자발적으로 활동 소뇌 골지 세포와 대뇌 피질의 피라미드 세포에서 현재 클램프 모드에서 전체 셀 패치 클램프 녹음에서 추적합니다. 핫 슬라이스 뇌로부터 얻어지는 전기 생리 및 optogenetic 레코딩의 품질의 다른 예는 황과 Uusisaari 11 레플러 등. (16)에서 찾을 수있다.
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토론
우리는 생리 대신 빙냉 온도 마우스로부터 급성 뇌 조각을 제조하는 방법을 보여준다.
또한, 추운 상태로 제조와 비교시 따뜻한 조건에서 얻어진 조각의 품질이 우수하다는 11 도시 슬라이서 블레이드 최소한 수직 진동을 가지고 제공되었다. 생리적 온도에서 슬라이스는 단일 셀의 수차뿐만 아니라 네트워크 동작에 명시 할 수있다 대사 과정 17 ~ 19의 변화에 관련된 것과 낮은 온도에 의한 생리 학적 유물을 방지 할 수 있습니다. 또한, 슬라이싱 절차가 분명히 불필요한 지연없이 완료되어야하더라도, 용액이 너무 뜨거워 질 전에 절단을 완료하기 위해 빙냉 조건 슬라이싱 때 그대로 (슬라이싱과 서둘러하고 방지 할 필요가 없다 조직의 오래 지속 동결에 의한 손상). 따라서, 느린 절삭 속도는 우리가 될 수 있습니다ED. 이것은 매우 섬세한 구조를 자르는 경우에 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 두 용액의 뇌의 냉각 단계를 생략하는 것은 상당히 절차뿐.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 이 방법을 검증하는 데 Shiwei Huang 박사(호주 국립 대학교)가 크게 기여한 것에 감사드립니다. 또한, 골지세포에 대해 도움이 되는 의견을 제시해 주신 Kasia Pietrajtis 씨와 피질 실험 데이터에 대해 말씀해 주신 Vitaly Lerner 씨에게 감사드립니다. 이 작업은 PITN-GA-2009-238686(CEREBNET), FP7-ICT(REALNET), ELSC 및 ISF의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 펜토바르비탈 | CTS | 170066 | : 생리식염수 60mg/ml. |
| 큰 가위 | FST | 14001-16 | 날카로운 모서리를 가진 큰 가위나 단두대는 참수에 사용할 수 있습니다 |
| 홍채 가위 | 프레스티지 메디컬 | 48,148 | 가위날이 1.5–보다 길지 않다면 어떤 세밀한 팁 가위도 사용할 수 있습니다; 2cm |
| 파인 팁 집게 | FST | 11254-20 | |
| 메스 | FST | 91003-12 | |
| 메스 블레이드 #11 | FST | 10011-00 | |
| 작은 주걱 | 어부 | 2350 | |
| 여과지 | 모든 실험실 브랜드를 사용할 수 있습니다. | ||
| 페트리 접시 | Duroplan | Z231509-1 | |
| 유리 비커 | SCHOT | 10022846 | |
| 파스퇴르 피펫 | 메이플 리프 브랜드 | 14672-029 | |
| 슈퍼 글루 | LOCTITE | 4091361/1 | |
| 슬라이서 | Campden | 7000-smz | |
| 세라믹 슬라이싱 블레이드 | Campden | 7550-1-C | |
| 자기 히터/교반기 | 절차를 위한 SPS 가열용 | ||
| 전기 주전자 | 온도 제어를 위한 물 가열용 | ||
| 슬라이스 회수실 + 가열 장치 | Warner 악기 | BSC-HT + BSC-BUW | 자체 제작 모델도 사용할 수 있습니다. |
| 온도계 | 해부 및 슬라이싱 중 SPS 온도 모니터링용 |
참고문헌
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular s....
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