우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다.
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방법 논문
의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화 크립토 콕 쿠스 네오 포르 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서
이 논문에서
요약
초록
크립토 콕 쿠스 네오 포르 만에 의한 대 식세포의 감염의 많은 측면을 광범위하게 연구하고 잘 정의되어 있습니다. 그러나, 명확하게 이해되지 않는 한 특정의 상호 작용은 세포 외 유출 용균 비이다. 이 과정에서 효모 세포는 대 식세포와 CN 가능한 모두 나뭇잎 제대로 이해 메커니즘에 의해 세포 외 공간으로 해제됩니다. 여기서 우리는 시간 경과 현미경에 의해 24 시간 감염 기간에 대해 개별적으로 감염된 대 식세포의 큰 숫자를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 감염된 대 식세포가 세포 배양 인큐베이터과 동일한 조건을 제공 현미경에 부착 된 CO 2 분위기의 가열 챔버 내에 수용된다. 라이브 디지털 현미경 정적 이미지에서 사용할 수없는 호스트와 병원체 간의 동적 상호 작용에 대한 정보를 제공 할 수있다. 그 반대의 경우도 마찬가지 대식 세포가 곰팡이 감염을 처리하는 방법에 대한 단서를 제공 할 수 각 감염된 세포를 시각화 할 수 있다는. 이 기술의 전복잡한 현상 뒤에있는 역학을 공부 SA 강력한 도구입니다.
서론
크립토 세포와 대식 세포 사이의 곰팡이 감염의 단계가 아니라 1-3 설명되어 있습니다. 효모 세포는 대 식세포에 의해 섭취 된 후, 상호 작용의 다양한 발생할 수 대식구는 세포 외 공간으로의 진균 부하 해제 용해되거나, 그것의 세포막 (4)의 범위 내에서 효모 세포를 유지하여 감염을 제어 할 수있다. 비 용균 세포 외 유출, 식세포가 주변 환경으로 크립토 셀의 일부 또는 전부를 소거하는 프로세스 또는 인접 셀 및 호스트와 병원체 모두 5 가능한 남아 : 그러나, 몇 년 전에 새로운 결과 두 그룹에 의해 독립적으로 설명 된 -8. 몇몇 연구는 이러한 상호 작용의 뒤에 분자 메커니즘을 이해하려고했지만 우리는 여전히이 현상을 원동력에 대한 전체 이해를 필요가 없습니다.
기능은 실시간으로 영상을 캡쳐하고 그 후 여러 감염을 분석 할에드 대 식세포는 하나가 곰팡이 감염시 형태와 대 식세포 심지어 스트레스에서 타이밍, 공간 능력, 변화에 관해서 비 용해성 세포 외 유출을 둘러싼 물리적 특성에 대해 많은 질문에 대답 할 수 있습니다. 세포 배양기의 것과 필적 환경에 수납 될 수 있도록함으로써, 우리는 식세포 진균 세포 상호 작용의 동적 특성을 엿볼 수있다. 연구진은이 과정의....
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프로토콜
모든 동물의 작업은 규정과 의학의 알버트 아인슈타인 대학 동물 연구소의 지침에 따라 이루어졌다.
C.의 1 성장 조건 콕 쿠스 네오 포르 만 H99 (혈청 형 A)
- 개별 C. 성장 사부로 한천 접시에 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 식민지.
- 어느 날 이전에 실험 한 식민지를 선택하고 사부로 배지 10 ㎖를 접종.
- 문화가 250 rpm의 속도로 흔들어 37 ° C에서 하룻밤 성장하도록 허용합니다.
2 분리 및 C57에서 차 뼈 대 식세포의 제조 / BL6 마우스
- 더 이상 호흡까지 CO 2 챔버 내에 동물을 배치하여 마우스를 안락사. 두 번째 조치로, cervically 해부를 시작하기 전에 목을 탈구. 70 %의 에틸 알코올로 몸 전체를 소독.
- 멸균 DMEM 모두 대퇴골 및 경골과 장소 뼈를 제거합니다.
- 여분의 조직과 근육 드를 사용하여 제거뼈가 완전히 깨끗해질 때까지 licate가 정리합니다.
- 70 % 에틸 알코올을 포함하는 페트리 접시 만 그대로 뼈를 삽입하고 관....
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결과
이 기술은 이미지를 생성 세포 C. phagocytosed 후에 발생하는 주변 환경 정보를 수집하기 위해 다양한 방식으로 분석 될 수있다 콕 쿠스 네오 포르 만이.도 1에 도시 된 바와 같이, 감염되거나 감염되지 않은 아르 중 약 100 대 식세포있다. 이 대 식세포의 각각은 시청자에게 매우 미세한 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 그림 2와 3은으로, 다른 대식 세포 및 효모 세포 사이에 발생할 수있는 결과, 심지어 식세포 대 식세포 사이에있다. 대 식세포는 비 용해성 세포 외 유출, 세포 - 세포 이동, 또는 발생할 수있는 다른 세포 과정을 겪고으로 득점 할 수있다. 감염시 이러한 이벤트의 타이밍은 또한 동영상 촬영시 설정 매개 변수를 기준으로 확인 할 수 있습니다.
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토론
여기서 우리는 곰팡이 식세포 작용을 기록하고 24 시간 동안 실시간으로 분석 할 수있는 방법을 설명 하였다. 본 연구실은 비 용균 세포 외 유출의 시간적 측면 많은 공부이 프로토콜을 사용하고이 프로세스를 둘러싸고 형태 요소를 확인하기 위해 실시간으로 현미경을 사용하는 것을 계속할 것이다.
이 기술은 이상적인 결과를 산출하기 위해서는 특별한주의가 프로토콜의 특정 단계에 부여해야합니다. 너무 많은 세포 이동 및 각 셀의 상호 작용의 관찰이 방해로 사용할 수 없다 동영상을 생성 할 수 있기 때문에 너무 적은 세포가 상당한 수없는 데이터를 얻을 수있는 반면 전날 밤 도금 셀 밀도가 중요하다. 목표는 각각의 대 식세포가 감염 기간의 지속 기간 동안 추적 될 수있는 대 식세포의 균등 필드를 달성하는 것이다. 같은 맥락에서, 세포 외 CN을 멀리 세척하는 것은 전으로 중요한 단계입니다tracellular CN 필드를 모호하고 대 식세포의 가시성의 손실로 이어질 수 시간에 걸쳐 분할됩니다........
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공개 사항
저자는 우리가 더 경쟁 재정적 이해 나 관심의 다른 충돌이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 상 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733에 의해 부분적으로 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sabouraud 포도당 한천 | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud 포도당 육수 | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES 완충액 | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| 비필수 아미노산 | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 독성 |
| 3003 조직 배양 페트리 접시 | 피셔 사이언티픽 | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek 유리 바닥 배양 접시 | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| 마우스 IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | 우리 실험실 | ||
| Axiovert 200M 인큐베이팅 챔버가 있는 현미경 | Zeiss |
참고문헌
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal p....
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재인쇄 및 허가
