우리는 현행 cGMP(Good Manufacturing Practices) 지침에 따라 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 인간 양막 상피 세포(hAEC)를 분리하고 배양하는 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
만삭 또는 만기 전 양막에서 유래한 인간 양막 상피 세포(hAEC)는 재생 의학을 위한 세포의 잠재적 공급원으로 연구자와 임상의의 관심을 끌고 있습니다. 이러한 관심의 이유는 이 세포가 매우 다재다능한 분화 능력, 낮은 면역원성 및 항염증 기능을 가지고 있다는 증거 때문입니다. 이러한 특성으로 인해 연구자들은 전임상 동물 연구에서 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 사용할 수 있는 hAEC의 잠재력을 조사하여 많은 성공을 거두었습니다.
hAEC는 다양한 질병 및 장애 치료에 널리 적용되고 있습니다. hAEC의 잠재적인 임상 응용 분야에는 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 및 급성 폐 질환의 치료가 포함됩니다. 전임상 동물 연구에서 임상 시험으로 진행하려면 세포 치료제에 대한 더 높은 수준의 품질 관리 및 안전성이 필요합니다. 안전성 및 품질 관리 고려 사항을 위해 세포 분리 프로토콜은 동물성 제품이 없는 시약을 사용하는 것이 좋습니다.
우리는 연구자들이 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 hAEC를 분리, 동결 보존 및 배양할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법의 장점은 적절한 세포 수율, 생존력 및 성장 잠재력을 유지하면서 잠재적으로 유해한 동물 병원체를 인간에게 전달할 위험 없이 이러한 세포를 분리, 특성화, 동결 보존 및 배양할 수 있다는 것입니다. 전임상 동물 연구에서 임상 시험으로 전환하는 연구자에게 이러한 방법론은 규제 승인을 크게 가속화하고 위험을 줄이며 치료용 세포 집단의 품질을 개선할 것입니다.
서론
이러한 태반과 같은 주 산기 소스, 태반 막, 탯줄과 양수에서 파생 된 세포는 재생 의학 1,2 세포의 잠재적 인 소스로 연구자와 임상의의 주목을 받고있다. 이 관심의 이유는이 세포 유형 모두 소성 및 면역 기능 3, 그들의 잠재적 인 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 특성을 어느 정도 가지고 있다는 것입니다.
hAECs 회생 세포 물질의 풍부한 전위 소스를 제공, 용어 또는 용어 사전 양막 멤브레인 (4)로부터 유도 될 수 상피 이종 집단이다. 세포 치료 매력적 hAECs을 속성은 자신의 다 능성, 낮은 면역 원성 및 항 염증 기능을 포함한다. hAECs은 (높은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 능성 중배엽 계통으로 분화 할 수 cardiom를 밝혀졌다yocytes, 근육 세포, 골 세포, 지방 세포), 내배엽 계통 (췌장 세포, 간 세포, 폐 세포)와 외배엽 계통 (헤어, 피부, 신경 세포와 성상 세포) 5-10.
안심, 자신의 다 능성의 hAECs 어느 형태의 종양에 표시 또는 생체 내에서 종양 발생을 촉진하지 않습니다에도 불구하고. 또한, hAECs 또한 클래스 II 인간 백혈구 항원 (HLAs) 8의 낮은 수준을 표현, 특권 면역 있습니다. 이 속성은 가능성이 면역 능력 원숭이, 토끼, 기니피그, 쥐, 돼지 11 ~ 13을 사용하여 연구에서 입증 된 바와 같이, 동종 및 이종 이식 후 면역 거부를 회피 할 수있는 능력의 기초가. hAECs는 강력한 면역 조절 및 면역 속성을 표시함으로써자가 면역 질환 치료에 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 중요한 실용적인 장점을 제공한다. hAECs는 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템에서 면역 기능을 발휘하는 것으로 추정된다. 에면역의 분비가 (14) 요인을 통해 제안 된 메커니즘의 전자입니다.
전임상 동물 질병 모델에서 hAECs 현재 애플리케이션은 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 폐 질환의 치료를 포함한다. 연구자들은 그들의 고유 한 속성에 뇌졸중 후 뇌 염증을 치료하는 hAECs를 사용에 관심을 보여 주었다. hAECs, 그들은 생착 할 수있는 혈액 뇌 장벽을 통과 최대 60 일 동안 생존, 뉴런으로 분화, 염증을 감소시키고 신경 질환 (15)의 동물 모델에서 손상된 중추 신경계 조직의 재생을 촉진 할 수 있다는 증거가있다.
hAECs 타겟팅 및 다발성 경화증의 발생 및 진행에 기여하는 여러 병리학 적 경로를 취소하는 기능을 제공한다. 예를 들면, 전임상 동물 실험의 결과 hAECs 강하게 면역 것을 제안하고잠재적으로 말초 면역 관용을 유도하고 지속적인 염증 반응을 취소 할 수 있습니다. hAECs는 또한 생체 내에서 신경 세포로 분화 및 신경성의 방대한 16 인자 분비를 통해 내인성 신경 재생을 향상시키는 능력을 갖는 것을 나타내고있다.
설치류 및 인간 양막 상피 세포는 이미 동물 모델에서 간 질환의 치료를위한 그들의 치료 효능을 증명하고있다. 감소 된 간세포 자멸사 수반 간 질환, 간에서의 생착 가능한 hAECs HAEC에 이식 리드의 사염화탄소 유도 손상 모델에서 간 염증 및 섬유증 및 17의 감소.
hAECs는 인슐린과 포도당 수송을 포함하여 표현 췌장 요인으로 자극 할 수있다. 몇몇 연구는 당뇨병 마우스 (18)에서 혈당 수준을 복원 hAECs 가능성을 조사 하였다. 마우스에서 수신hAECs는 모두 동물 체중 및 혈당 수준은 감염 후 세포의 정상 수준으로 감소 하였다. 이들 연구는 당뇨병의 치료를위한 hAECs의 사용을위한 강력한 바이다.
hAECs는 성인과 신생아 모델 19 두의 예방 및 실험 급성 및 만성 폐 손상의 수리 검증 역할을한다. 이러한 연구는 hAECs은 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), 낭포 성 섬유증 (20) 환자에서 돌연변이 이온 채널 등 다양한 폐 관련 단백질을 발현하는 기능 폐 상피 세포로 체외에서 분화 것을 발견했다. hAECs가 부상당한 성인과 신생아 폐에 전달 될 때 또한, 그들은 호중구, 대 식세포와 림프구 21-23을 포함한 폐 백혈구 모집을 감소, 호스트 면역 세포의 변조를 통해 자신의 수복 효과를 발휘한다.
자신의 풍요 로움을 감안할 때,안전 기록, 여러 질병에 대한 입증 된 임상 적용, hAECs를 사용하여 임상 시험은 불가피하다. 임상 시험에 HAEC 치료의 번역을 촉진 목표로, 우리는 현재 좋은 제조 기준 (cGMP의) 지침에 따라 동물 제품 무료 시약을 사용하여, 임상 시험에 적합한 방식으로 문화 hAECs을 분리 cryopreserve과하는 방법을 개발 .
우리는이 프로토콜에게 우리가 동물 유래 시약 6을 사용 hAECs을 분리 성공적으로 사용하고 이전에 출판 된 프로토콜을 기반으로. 우리는 동물 제품 무료 시약 동물 유래 제품을 대체 할 수있는 원래의 프로토콜을 변경, 이후의 최적화는 세포 수율, 생존 및 순도를 최적화하기 위해 실시 하였다. 우리의 목표는 인간의 임상 시험에 대한 전지 제조에 대한 규제 기준을 준수 할 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다.
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프로토콜
참고 : 태반이 용어 선택 과목 제왕 섹션의 설정에, 싱글 건강한 임신에서 수집해야합니다. 작성된 동의서들은 태반의 수집을 위해 주어져야한다. 귀하의 관련 인간의 연구 윤리위원회는 승인 모든 수집 및 인체 조직의 사용을해야한다.
양막 상피 세포의 1. 분리
- 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 표면에 태반을 놓습니다.
- 멸균에게 행크스 평형 염 용액 (HBSS)을 사용하여 태반 표면 및 막으로부터 가능한 한 많은 혈액을 세척한다.
- 탯줄이 위를 향하도록 배치 태반으로, 기계적으로 양막과 융모막 세포막의 바깥 쪽 가장자리를 구분합니다.
- 분리되면, 수동으로 탯줄, 멤브레인의 에지 주변에서 작업, 태반의 융모막 막에서 양막 멤브레인 스트립.
참고 : caref 될UL은 양막에서 융모막 막 오염의 조각을 제거합니다. - 멸균 가위를 사용하여, 250 ml의 HBSS를 포함하는 용기를 밀봉 한 500㎖의 탯줄과 장소의 기지에서 약 2cm를 양막 막 잘라.
- 양막 멤브레인을 포함하는 밀봉 된 병을 흔들어 깨끗이 씻으십시오.
- 15cm 페트리 접시에 수집 멸균 집게를 사용하여 컨테이너, 장소에서 양막 막을 제거합니다.
- 피 묻은거나 찢어 조각을 폐기, (집게 수직으로 개최 할 때) 약 5cm 긴 조각으로 양막 멤브레인을 잘라.
- 500 ml의에있는 장소는 용기를 밀봉하고 250 ml의 HBSS로 약 3 ~ 5 번 씻거나 양막 막 더 오염 혈액 반투명 될 때까지.
참고 : 모든 혈액에 존재하는 솔루션을 소화 효소의 효율을 감소시킬 수있다. - 주의하면서 소화 용액을 50 ml의 효소를 함유하는 용기에 양막 막 조각을 모두 전송HBSS의 이월을 최소화 할 수 있습니다.
- 남아있는 혈액을 제거하기 위해 교반과 함께 15 분 동안 37 ° C에서 물 목욕이나 따뜻한 방에서 솔루션을 소화 효소에 양막 조각을 품어.
- 새로운 멸균 용기에 솔루션과 장소를 소화 효소의 양막 조각을 제거합니다.
- 신선한 효소 100ml를 양막 멤브레인 용액을 소화하고 수욕 또는 부드러운 진탕 (제 1 분해) 따뜻한 방에서 60 분 동안 37 ℃에서 추가 배양한다.
- 양막 막 조각을 제거하고 효소가 세포막의 각 부분에서 배출 솔루션을 소화 할 수 있도록 새로운 컨테이너 돌보는에 배치합니다.
주 : 이것은 용기 내부 림을 따라 양막 조각을 드래그함으로써 달성 될 수있다. - 신선한 효소의 100 ml의 양막 막 조각에 솔루션을 소화하고 부드러운 흔들림 (초 소화) 37 ° C에서 물 목욕이나 따뜻한 방에서 60 분을 품어 추가.
- 셀 suspensi 전달10 분 동안 1,000 XG에 70 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 단계 1.14에서에.
- 제거하고 상층 액을 제거하고, 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 4 ml의 HBSS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득 1ml를 피펫으로 반복해서 피펫.
주 : 제 다이제스트로부터 세포가 동일한 처리 단계가 될 때까지이 단계에서 세포를 얼음에 남아있을 수있다. - 양막 막 조각을 제거하고 효소가 세포막의 각 부분에서 배출 솔루션을 소화 할 수 있도록 새로운 컨테이너 돌보는에 배치합니다.
주 : 이것은 용기 내부 림을 따라 양막 조각을 드래그함으로써 달성 될 수있다. - 10 분 동안 1,000 XG에 70 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 단계 1.18에서 세포 현탁액을 전달합니다.
- 제거하고 상층 액을 제거하고, 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 4 ml의 HBSS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 1 ML의 페이지 반복적으로 피펫단일 세포 현탁액을 수득 ipette.
- 두 다이제스트 또는 대안에서 풀 세포는 세포 수 때까지 분리 된 세포 다이제스트을 유지합니다.
참고 :이 높은 생존 세포에 잠재적으로 낮은 생존 세포의 혼합을 방지 할 수 있습니다. - 10 ~ 20 ml의 최종 부피에 HBSS를 추가하고 생존 능력을 측정하기 위해 트리 판 블루를 사용하여 세포 수를 수행합니다.
- 유동 세포 계측법에 의한 상피 세포 표현형을 확인합니다. 안티는 EpCAM-PE 사용하여 적절한 항체 칵테일을 확인 (1 : 2 희석) 항 CD90-PeCy5 (1 : 250) 및 안티 CD105-APC (1 : 100) HBSS에.
- 25 × 106 세포 / ml의 농도로 하나의 세포 또는 항체 칵테일의 두 다이제스트의 서브 세트를 재현 탁.
- 유동 세포 계측법, 얼룩 이소 컨트롤을 포함하는 항체 칵테일 1 × 10 6 세포의 경우 (예. IgG의 1 이소 제어-PE + 안티 CD90-PeCy5 + 안티 CD105-APC). 설정 사이토 흐름에 대한 흠 ~ 1 × 10 6 세포를 보관하십시오.
- 항체 세포를 품어60 분 동안 4 ° C에서 칵테일.
- 워시 세포는 유동 세포 계측법 1 ㎖ 당 5-10000000 세포에서 HBSS 및 재현 탁에 3 배.
- 유동 세포 계측법 및 참고 결과를 수행합니다. 셀 분리 (는 EpCAM 양성 및 CD90 / CD105 음성 세포의 백분율)의 순도 및 각각 90-95% <1 %가 될 것으로 예상된다.
- 최종 응용 프로그램에 의해 결정되는 적절한 품질 관리 또는 방출 기준에 대한 테스트를 위해 따로 세포의 적절한 수를 설정합니다.
참고 :이 질환 / 바이러스 차단, 또는 다른 안전 또는 생물학적 기준을 포함 할 수 있습니다. - 나머지 세포의 경우, 냉동 보존 프로토콜에 따라, 또는 대안 (문화 단계 3.6 직접) 문화에 직접 배치합니다.
hAECs 2. 냉동 보존
- 데이터 또는 트리 판 블루 배제와 수동 계산 유동 세포 계측법을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다.
- 5 분 동안 700 XG에 원심 분리기.
- 재현 탁 셀동물 제품 무료 냉동 보존 매체에 1 ㎖ 당 1-10000000 세포 사이의.
- O 고리 동결 튜브에 세포의 적절한 볼륨을 피펫 및 냉각이 약 발생하는 위치 제어 속도 냉동 장치에 배치 1 ° C / 분까지 -80 C이 달성 °.
- 장기간 저장을 위해 액체 질소로 전송 튜브.
Cyropreserved hAECs 3. 해동 문화
- 액체 질소에서 냉동 보존 튜브를 제거하고 얼음에 배치합니다.
참고 : 전송의 경우 - 다음 단계로 빠르게 진행합니다. - 얼음이 남아의 작은 조각 (~ 5mm X 5mm) 때까지 37 ℃에서 급속 냉동 보관 유리 병을 녹여.
주 : 세포 용액은 동결 배지에서 DMSO의 독성을 감소시키는 가온하지 않는 것이 중요하다. - 감기 (~ 4 ° C) 혈청이없는 매체와 냉동 보존 매체 10 배 희석 점적 적당한 크기에 추가D 튜브 또는 용기.
- RT에서 5 분 700 XG에 원심 분리기.
- 1 mL 당 1 백만 세포의 농도로 근사, 무 혈청 배지에 재현 탁. 트리 판 블루 배제로 자동 또는 수동 계산을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다. 예상 생존 후 해동 미리 냉동 보존 생존보다 5 ~ 10 % 적습니다.
- 플레이트 표준 세포 배양 처리 된 플라스틱 제품에 세포, 또는 선택적으로 사용 유형 I 코트 문화 표면에 콜라겐.
- I 형 콜라겐 코팅는 아래의 프로토콜을 따라
- 인간의 태반 (25 ml의 탈 이온수 50 μL 빙초산 15 mg의 콜라겐)에서 산 가용성 I 형 콜라겐을 준비합니다.
- 파라 필름으로 비이커를 커버하고 콜라겐 가닥이 용해 될 때까지 37 ° C에서 적당히 저어.
- 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균 여과 콜라겐 용액.
- 탈 이온수로 필터링 된 콜라겐 스톡 1:10 희석. 이 희석 주식은 작업 conce입니다코팅 플라스틱 및 막 표면에 대한 ntration 솔루션입니다.
- 콜라겐 코트 플라스틱, 37 ° C의 실온에서 2 시간 동안 유리와 막 표면, 또는 O / N 2-8 ° C에서.
- 코팅 된 표면에서 초과 액체를 제거하고 O / N을 건조 할 수 있습니다.
- 세포와 매체를 도입하기 전에 무균 조직 배양 등급의 물 또는 HBSS로 씻어.
- 플레이트 혈청 배지에서 25,000 세포 / ㎠의 밀도로 hAECs, 그리고 첨부 72-96 시간 동안 발생할 수있다.
- 첨부 파일에 따라주의 깊게 흡입 및 무 혈청 배지의 적절한 볼륨 2-3 일마다로 대체하여 미디어를 변경합니다.
- 아래의 프로토콜을 이용하여 세포 통로
- 기음 세포 배양 미디어 및 무균 HBSS의 1 배 부피로 세척
- 세포는 세포 배양 물 표면으로부터 분리 될 때까지 관찰되는 효소의 양을 추가 1X 용액을 소화하고 5-15 분 동안 인큐베이션하거나.
- 용액은 세포를 포함하는 소화 효소 CE 보장 모아서LLS 반복 세포 배양면에 용액을 소화 효소를 피펫 팅하여 세포 배양 물 표면으로부터 분리되고
- 5 분 동안 700 XG에 원심 분리기.
- 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 HBSS의 적당한 부피에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득하여 1ml 피펫으로 반복해서 피펫.
- 1 백만 세포 / ml의 대략적인 농도 무 혈청 배지를 추가합니다. 트리 판 블루 배제로 자동 또는 수동 계산을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다.
- 플레이트 혈청 배지에서 25,000 세포 / ㎠의 밀도로 hAECs하고 표준 방법으로 배양을 계속.
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결과
이 절차가 제대로 따라하면, 1 억 2 천만 hAECs의 평균 수익률은 80-160000000 세포의 전형적인 범위, 예상해야한다. 이러한 수율에서 83 ± 4 %의 평균 생존 능력을 기대할 수있다. 임상 방법에 증가 된 평균 수익률과 약간 낮은 가능성으로 인해 혈청 단백질의 부족으로 아마 또한 동물성 제품보다 더 높은 트립신의 활동으로 인해, 그리고 수 있습니다. 격리 hAECs은 <1 % CD90, CD105 간충직 마커 양성 세포와 92 %는 EpCAM 양성 세포의 평균 기포 표면 프로파일을 갖는다. 이 마커는 각각 상피 (24, 25)와 중간 엽 26 계통에 대한 자신의 특이성으로 인해 선정되었다. 이 과정은 (그림 1)을 완료하는 데 약 4-5 시간이 걸릴 수 있습니다.
냉동 보존은 튜브 및 최종 세포 수율의 수에 따라 20 ~ 60 분을 필요로한다. 우리는 이전에 냉동 보존 매체의 범위를 테...
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토론
이 방법의 성공에 중요한 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. hAECs의 분리하기 전에 최대 3 시간 동안 태반이나 양막의 저장 그러나 그것은 조직은 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋습니다, 물류 또는 스케줄링을 위해 바람직 할 수있다. 티슈가 저장 될 경우에는 저장 양막 막의 박리 및 세정 다음 수행하는 것이 권장된다. 양막은 39 ° C에서 멸균 항생제를 함유하는 HBSS에 저장 될 수 있으나 세포 생존이 연장 된 축적 시간에 따라 감소 할 수있다. 우리와 다른 세포 수율과 생존의 변동성을 발견하고, 바람직하게는 제왕 절개에 의해 전달 건강한 용어 출생에서 수집되는 태반을 권장이 변동성을 최소화하기 위해.
우리는 혈구 양막 막의 오염이 효소 활성의 억제 및 세포 수율 감소를 초래할 것으로 발견했다. 따라서프로토콜에서 중요한 단계는 태반의 철저한 세척과 양막을 권장합니다. 이 다운 스트림 효소 억제를 방지하기 위해 / 화이트 분명 나타날 때까지 양막 ...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 빅토리아 주 정부의 운영 인프라 지원 프로그램(Operational Infrastructure Support Program)의 재정적 지원을 인정합니다.
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