우리는 현행 cGMP(Good Manufacturing Practices) 지침에 따라 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 인간 양막 상피 세포(hAEC)를 분리하고 배양하는 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
만삭 또는 만기 전 양막에서 유래한 인간 양막 상피 세포(hAEC)는 재생 의학을 위한 세포의 잠재적 공급원으로 연구자와 임상의의 관심을 끌고 있습니다. 이러한 관심의 이유는 이 세포가 매우 다재다능한 분화 능력, 낮은 면역원성 및 항염증 기능을 가지고 있다는 증거 때문입니다. 이러한 특성으로 인해 연구자들은 전임상 동물 연구에서 다양한 질병 및 장애를 치료하는 데 사용할 수 있는 hAEC의 잠재력을 조사하여 많은 성공을 거두었습니다.
hAEC는 다양한 질병 및 장애 치료에 널리 적용되고 있습니다. hAEC의 잠재적인 임상 응용 분야에는 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 및 급성 폐 질환의 치료가 포함됩니다. 전임상 동물 연구에서 임상 시험으로 진행하려면 세포 치료제에 대한 더 높은 수준의 품질 관리 및 안전성이 필요합니다. 안전성 및 품질 관리 고려 사항을 위해 세포 분리 프로토콜은 동물성 제품이 없는 시약을 사용하는 것이 좋습니다.
우리는 연구자들이 동물성 제품이 없는 시약을 사용하여 hAEC를 분리, 동결 보존 및 배양할 수 있는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법의 장점은 적절한 세포 수율, 생존력 및 성장 잠재력을 유지하면서 잠재적으로 유해한 동물 병원체를 인간에게 전달할 위험 없이 이러한 세포를 분리, 특성화, 동결 보존 및 배양할 수 있다는 것입니다. 전임상 동물 연구에서 임상 시험으로 전환하는 연구자에게 이러한 방법론은 규제 승인을 크게 가속화하고 위험을 줄이며 치료용 세포 집단의 품질을 개선할 것입니다.
서론
이러한 태반과 같은 주 산기 소스, 태반 막, 탯줄과 양수에서 파생 된 세포는 재생 의학 1,2 세포의 잠재적 인 소스로 연구자와 임상의의 주목을 받고있다. 이 관심의 이유는이 세포 유형 모두 소성 및 면역 기능 3, 그들의 잠재적 인 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 특성을 어느 정도 가지고 있다는 것입니다.
hAECs 회생 세포 물질의 풍부한 전위 소스를 제공, 용어 또는 용어 사전 양막 멤브레인 (4)로부터 유도 될 수 상피 이종 집단이다. 세포 치료 매력적 hAECs을 속성은 자신의 다 능성, 낮은 면역 원성 및 항 염증 기능을 포함한다. hAECs은 (높은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 능성 중배엽 계통으로 분화 할 수 cardiom를 밝혀졌다yocytes, 근육 세포, 골 세포, 지방 세포), 내배엽 계통 (췌장 세포, 간 세포, 폐 세포)와 외배엽 계통 (헤어, 피부, 신경 세포와 성상 세포) 5-10.
안심, 자신의 다 능성의 hAECs 어느 형태의 종양에 표시 또는 생체 내에서 종양 발생을 촉진하지 않습니다에도 불구하고. 또한, hAECs 또한 클래스 II 인간....
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프로토콜
참고 : 태반이 용어 선택 과목 제왕 섹션의 설정에, 싱글 건강한 임신에서 수집해야합니다. 작성된 동의서들은 태반의 수집을 위해 주어져야한다. 귀하의 관련 인간의 연구 윤리위원회는 승인 모든 수집 및 인체 조직의 사용을해야한다.
양막 상피 세포의 1. 분리
- 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 표면에 태반을 놓습니다.
- 멸균에게 행크스 평형 염 용액 (HBSS)을 사용하여 태반 표면 및 막으로부터 가능한 한 많은 혈액을 세척한다.
- 탯줄이 위를 향하도록 배치 태반으로, 기계적으로 양막과 융모막 세포막의 바깥 쪽 가장자리를 구분합니다.
- 분리되면, 수동으로 탯줄, 멤브레인의 에지 주변에서 작업, 태반의 융모막 막에서 양막 멤브레인 스트립.
참고 : caref 될UL은 양막에서 융모막 막 오염의 조각을 제거합니다. - 멸균 가위를 사용하여, 250 ml의 HBSS를 포함하는 용기를 밀봉 한 500㎖의 탯줄과 장소의 기지에서 약 2cm를 양막 막 잘라.
- 양막 멤브레인을 포함하는 밀봉 된 병을 흔들어 깨끗이 씻으십시오.
- 15cm 페트리 접시에 수집 멸균 집게를 사용....
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결과
이 절차가 제대로 따라하면, 1 억 2 천만 hAECs의 평균 수익률은 80-160000000 세포의 전형적인 범위, 예상해야한다. 이러한 수율에서 83 ± 4 %의 평균 생존 능력을 기대할 수있다. 임상 방법에 증가 된 평균 수익률과 약간 낮은 가능성으로 인해 혈청 단백질의 부족으로 아마 또한 동물성 제품보다 더 높은 트립신의 활동으로 인해, 그리고 수 있습니다. 격리 hAECs은 <1 % CD90, CD105 간충직 마커 양성 세포와 92 %는 EpCAM 양성 세포의 평균 기포 표면 프로파일을 갖는다. 이 마커는 각각 상피 (24, 25)와 중간 엽 26 계통에 대한 자신의 특이성으로 인해 선정되었다. 이 과정은 (그림 1)을 완료하는 데 약 4-5 시간이 걸릴 수 있습니다.
냉동 보존은 튜브 및 최종 세포 수율의 수에 따라 20 ~ 60 분을 필요로한다. 우리는 이전에 냉동 보존 매체의 범위를 테.......
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토론
이 방법의 성공에 중요한 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. hAECs의 분리하기 전에 최대 3 시간 동안 태반이나 양막의 저장 그러나 그것은 조직은 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋습니다, 물류 또는 스케줄링을 위해 바람직 할 수있다. 티슈가 저장 될 경우에는 저장 양막 막의 박리 및 세정 다음 수행하는 것이 권장된다. 양막은 39 ° C에서 멸균 항생제를 함유하는 HBSS에 저장 될 수 있으나 세포 생존이 연장 된 축적 시간에 따라 감소 할 수있다. 우리와 다른 세포 수율과 생존의 변동성을 발견하고, 바람직하게는 제왕 절개에 의해 전달 건강한 용어 출생에서 수집되는 태반을 권장이 변동성을 최소화하기 위해.
우리는 혈구 양막 막의 오염이 효소 활성의 억제 및 세포 수율 감소를 초래할 것으로 발견했다. 따라서프로토콜에서 중요한 단계는 태반의 철저한 세척과 양막을 권장합니다. 이 다운 스트림 효소 억제를 방지하기 위해 / 화이트 분명 나타날 때까지 양막 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 빅토리아 주 정부의 운영 인프라 지원 프로그램(Operational Infrastructure Support Program)의 재정적 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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| Liberty Dressing Forcep, 뾰족한 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| 가위 - 날카롭고 뭉툭한 스트레이트 | 피셔 사이언티픽 | NC0562592 | |
| 멸균 라텍스 장갑 | 피셔 사이언티픽 | 19-014-643 | |
| 보호 의류 | |||
| 보호 의류 (가운) | U-line | S-15374-M | |
| 격리 가운 | U-line | S-15374-M | |
| 멸균 라텍스 장갑 | 피셔 사이언티픽 | 19-014-643 | |
| 범용 안면 마스크 | Cardinal Health | AT7511 | |
| 보닛 | Medline | CRI1001 | |
| 신발 커버 | U-line | S-7873W | |
| 미디어 및 시약 | |||
| Hanks' 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) | 칼슘이나 마그네슘이 없는 | Life Technologies | |
| 14175095 TrypZean (동물성 제품– 무료 재조합 트립신) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| 대두 트립신 억제제 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue 시약 | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype 제어 | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5 isotype 제어 | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype 제어 | BD Pharmingen | 340754 | |
| 콜라겐 유형 VI | 시그마 Aldrich | C7521 | |
| 소모품 | |||
| 50 ml 눈금 피펫 | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml 눈금 피펫 | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml 눈금 피펫 | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml 팔콘 튜브 | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml 팔콘 튜브 | BD/Falcon | 352096 | |
| 15cm 페트리 접시 | Corning | 351058 | |
| 70 μ m 필터 | BD / 팔콘 | 352350 | |
| 0.22 μ M 필터 | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml 피펫 팁 | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μ l 피펫 팁 | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml 주사기 | BD/의료용 | 309661 | |
| 플라스틱 주걱 | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| 플라스틱 계량 보트 | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| 크라이오 바이알 | Nunc | 377267 | |
| 장비 | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| 생물학적 위험 캐비닛 |
참고문헌
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.
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