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방법 논문

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

14.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52090

⸱

2014년 8월 22일

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

이 논문에서

요약

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

초록

하나의 나노 입자에 결합 된 자기 및 플라즈몬 특성은 반대로 소설 magnetomotive 영상 방식의 개선, 동시 캡처 및 (CTCs) 종양 세포를 순환의 탐지 및 광열 치료와 결합 된 복합 분자 영상을 포함한 생물 의학 응용 프로그램의 숫자에 유리한 시너지 효과를 제공 암세포. 이러한 응용 프로그램은 근적외선 (NIR) 영역에서 광 흡수와 강한 자기 모멘트와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성을위한 프로토콜의 개발에 상당한 관심을 자극했다. 여기서는 중유 마이크로 에멀젼 법에 기반 하이브리드 나노 입자의 합성에 대해 신규 프로토콜을 제시한다. 본원에 기술 된 프로토콜의 고유 기능은 또한 자기 플라즈몬 특성이 기본 블록에서 다양한 크기의 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성이다. 이러한 접근법은 높은 덴와 나노 입자를 얻을균일 한 나노 입자의 볼륨에 분산되어 자기와 플라즈몬 기능의 SITY. 하이브리드 나노 입자가 용이하게 타겟팅 가능한 항원 결합을 담당하는 팹 부를 떠나는의 Fc 잔기를 통해 항체를 부착시켜 작용 화 될 수있다.

서론

별개의 물리 화학적 특성을 가진 서로 다른 물질로 구성된 하이브리드 나노 입자는 복합 분자 이미징, 치료 제공 및 모니터링, 새로운 검사 및 진단 분석 1-3를 포함하여 생물 의학 응용 프로그램에서 새로운 기회를 열 수 있습니다. 이 자기장 플라즈몬 공명과 응답과 관련된 매우 강한 광 산란 및 흡수 횡단면을 제공하기 때문에 단일 나노 입자의 플라즈몬과 자기 특성의 조합은 특히 중요하다. 예를 들어, 자기 플라즈몬 나노 입자 외부 전자석 3-5 통해 시간적 신호 변조를 적용하여 표지 세포의 암시 야 이미지의 콘트라스트를 증가시키기 위해 사용되었다. 자기 - 광 음향 이미징, 자기​​ 플라즈몬 나노 입자 콘트라스트 신호 대 배경 쥐에서 큰 개선을 활성화 - 최근 유사한 원리는 새로운 영상 기법의 개발에 적용되었다IO 6,7. 또한 하이브리드 나노 입자가 동시에 포착 및 전혈 및 생체 내에서 8,9 종양 세포 순환의 검출에 사용될 수 있음을 도시 하였다. 또한, 자기 플라즈몬 나노 입자는 암세포 (10)의 광열 치료와 결합 된 특정 분자와 광 MR 이미징을 위해 사용될 수 theranostic 에이전트 유망한.

여러 가지 접근 방법이 자기 ​​플라즈몬 나노 입자의 합성 탐구 하였다. 아령 형상 관능의 Au-FE 3 O 4 나노 입자 (11)를 형성하는 금 나노 입자에 대한 예, 유 등. 이용 분해의 Fe (CO)의 산화를 05. 왕 등 알. 열분해 방법 (12)을 사용하여 금으로 코팅 된 산화철 나노 입자를 합성 하였다. 몇몇 다른 접근법들은 AG 증착 하였다 자성 코어 입자 상에 중합체 코팅 또는 아민 관능기 분자에 의존하이브리드를 만들 수있는 고분자 표면에 오래 쉘은 7,13 입자. 또한, 산화철 나노 입자는 정전 기적 ​​상호 작용 또는 화학적 반응을 통해 14,15 금 나노로드에 부착 하였다. 이러한 접근 방식은 자기 플라즈몬 나노 구조를 얻을 수 있지만, 그들은 생명 의료 애플리케이션에서 매우 바람직하다 둘 다 근적외선 (NIR) 창에서 흡광도 또는 강한 자기 모멘트로 자기 플라즈몬 조합의 어느 정도의 호텔이 손상. 예를 들어, 아령의 Au-FE 3 O 4 나노 입자로 인해이 스펙트럼 범위에서 높은 조직 탁도 생체 내에서의 유틸리티를 제한 520 nm에서 플라즈몬 공명 피크를 가지고있다. 또한, 현재의 프로토콜에 의해 생성 된 자기 플라즈몬 나노 입자는 ACH가 될 수있는 것보다 상당히 작다는 것을 단지 하나 또는 소수의 (11) (10 개 미만) 14,15 상자성 잔기 (예를 들면, 산화철 나노 입자)로 제한된다조밀 나노 구조에 ieved. 예를 들어, 조밀하게는 60nm 직경의 구형 나노 입자는 6 nm의 천 초상 자성 나노 입자의 주문에 포함 할 수있다. 따라서, 하이브리드 나노 입자의 자기 적 성질을 향상시키기위한 좋은 공간이있다. 또한, 앞서 설명한 프로토콜 중 일부는 상대적으로 복잡하고 합성 14,15 중 입자 응집을 피하기 위해 신중한 최적화가 필요하다.

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 현재 예술의 주요 한계를 해결하는 강력한 근적외선 흡광도 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 합성은 중유 마이크로 에멀젼 방법 (16)에 그 기원이있다. 이것은 훨씬 작은 일차 입자로부터 원하는 크기의 나노 입자의 조립에 기초한다. 이 접근법을 성공적으로 금, 철 산화물, 반도체 PRI 같은 단일 물질로부터 나노 구조물을 생성하기 위해 사용되어왔다메리는 16 입자. 우리는 마지막으로 구형 나노 하이브리드 차 입자를 조립 한 후, 6 nm의 직경 골드 쉘 / 철 산화물 코어 입자를 제작함으로써, 제 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성에 연장. 나노 클러스터뿐만 아니라, 예컨대 초상 자성 특성을 유지하면서 강한 자기 모멘트를 달성하는 등의 성분의 나노 입자의 특성을 개선 할 수 있지만 또한 이와 같은 강한 같은 구성 입자 결석 새로운 특성을 만드는 개별 나노 입자 사이의 상호 작용을 이용한다으로 일차 입자 조립 NIR 창의 광학 흡광도. 이 프로토콜은 자기 및 플라즈몬 작용기 고밀도 하이브리드 나노 입자를 산출한다. 일차 입자가 synthetized 후, 우리의 방법은 본질적으로 간단한 냄비 반응이다. 전체적인 플라즈몬 공진 강도 및 자기 모멘트는 일차 입자와, 거기는의 수에 의해 결정된다는 efore 쉽게 애플리케이션에 따라 최적화 될 수있다. 또한, 우리는 또한 분자 특정 타겟팅이 필요 다양한 생물 의학 응용 프로그램에 대한 하이브리드 나노 입자에 항체 접합하기위한 절차를 개발했다. 항체 타겟팅을 사용할 항원 결합을 담당하는 팹 부분을 떠나는의 Fc 부분을 통해 연결되어 있습니다.

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프로토콜

1 측정 장치 및 유리 제품 제조

  1. 즉, 적절한 보호 장비, 실험실 코트, 일회용 장갑, 눈 보호구를 착용 할 것.
  2. 응축기로 둥근 바닥 플라스크를 연결하고 온도계 온도 모니터링과 실리콘 오일 욕에 젖어. 오일 욕 (도 1) 아래 열원 (예, 핫 플레이트)를 놓는다. 온도에게보다 높​​은 260 °의 C를 측정 할 수있는 온도계를 사용합니다.

차 하이브리드의 합성 2 매그니토 플라즈몬 나노 입자

  1. 자성 코어 나노 입자를 만들기
    1. 라운드 353.2 mg의 (1 mmol)의 철 (III) 아세틸 아세토 네이트, 1 ㎖ (2 밀리몰) 올레산, 1 ㎖ (2 밀리몰)의 올레 일 아민, 1.292 g (5 mmol)의 1,2 - hexadecanediol 및 10 ml의 페닐 에테르에 추가 -bottom 플라스크.
    2. 적극적으로 환류 1 시간 동안 250-260 ° C에 자기 교반 바, 열을 이용하여 혼합물을 저어. 용액이 식을 때까지 기다립니다RT에 이르기까지. 온도 페닐 에테르의 비등을 방지하고 응축기 환저 플라스크로부터 반응 혼합물의 폭발을 방지하기 위해 260 ° C 미만의 확인.
      주의 : 반응 혼합물을 매우 뜨겁와 화학 물질이 자극의 원인이 될 수 있습니다. 흄 후드 작동하고 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다. 오일 목욕 적절한 환기를 마련하십시오.
      NOTE : 오일 욕이 자성 나노 입자의 합성 1 시간 동안 250-260 ºC 온도로 유지된다. 원칙적으로, 파이렉스 유리 접시는이 목적을 위해 사용될 수있다. 그러나, 파이렉스 유리 연속 최대 온도는 벤더 정보에 따라 ºC ~ 260이다. 따라서, 금속 컨테이너는 그보다 높은 온도를 견딜 복수 실행 중에 더 오래 지속될 수있는 반응을위한 안전한 옵션을 제공한다.
  2. 자성 코어 입자에 금을 증착 셸
    1. 411.5 밀리그램 (1.1 mmol)을 금 에이스 추가테이트, 0.25 ㎖ (0.75 밀리몰) 올레산 1.5 ㎖ (3.0 밀리몰)의 올레 일 아민, 둥근 바닥 플라스크에 775.3 mg의 (3 mmol)의 1,2 - hexadecanediol, 및 15 ml의 페닐 에테르.
    2. 2.1 단계에서 자성 나노 입자의 5 ml의 현탁액을 추가합니다. 180 ° C까지 반응 혼합물을 가열하고 1 시간 동안 환류하에 유지. RT로 냉각 솔루션을 기다립니다.
    3. 15 분 동안 3,250 × g에서 원심 분리 하이브리드 차 나노 입자를 침전 50 ㎖의 에탄올을 추가합니다.
    4. 욕조 초음파 처리기를 사용하여 25 ml의 헥산의 침전물을 재현 탁. 기본 하이브리드 나노 입자를 침전 25 ㎖의 에탄올을 추가합니다. 15 분 동안 3,250 XG에 원심 분리기 헥산에 침전을 재현 탁. 이 단계를 세 번 반복합니다.
    5. 진공 데시 케이 터의 O / N에서 침전 차 하이브리드 나노 입자를 건조. 입자가 완전히 건조되었는지 확인합니다.

3 하이브리드 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터 합성 및 크기 분리

  1. 욕조 초음파 처리기를 사용하여 1 ㎖의 헥산에 건조 기본 하이브리드 나노 입자 5 mg을 재현 탁. 가시적 석출물이 존재하지 않을 때까지 나노 입자 현탁액을 초음파 처리.
  2. 연결 캡 20 mL 유리 바이알에 3.1-10 ㎖의보기 단계에서 도데 실 황산나트륨 (2.8 ㎎ / ㎖)의 수용액으로 용액을 추가한다. 다음 단계 전에 두 단계의 혼합을 방지하기 위해 드롭으로 차 하이브리드 나노 입자 드롭의 정지를 추가합니다.
  3. 10 분 동안 80 ° C에서 수조에서 가열 한 다음 2 시간 동안 욕조 초음파 처리기에서 2 상 용액을 초음파 처리. RT로 냉각 솔루션을 기다립니다.
    1. 초음파 목욕의 작동 레벨 라인에 물을 채 웁니다. 초음파 목욕 유리 병을 중앙에. 바로 두 단계 사이의 에멀젼 형태. 초음파 처리 시작 후 손으로 2 상 용액을 흔들어; 이는 주 하이브리드 나노 입자를 포함하는 상과 수성 상 사이에 아래 혼합 용이하게한다.
      참고 : 그쪽주의초음파기 t 작업의 2 시간 후 가열한다.
  4. 30 분 동안 100 XG에 하이브리드 나노 클러스터 현탁액을 원심 분리기. 침전물과 상층 액을 모두 수집합니다. 10 분 초음파 하에서 0.1 mM의 시트르산 나트륨의 침전물을 재현 탁. 나노 클러스터의 예상 크기는 직경이 ~ 180 ㎚이다.
  5. 새로운 원뿔 튜브로 단계 3.3에서 뜨는을 전송합니다.
  6. 30 분 동안 400 XG에 3.4 단계에서 현탁액을 원심 분리기. 침전물과 상층 액을 모두 수집합니다. 10 분 초음파 하에서 0.1 mM의 시트르산 나트륨의 침전물을 재현 탁. 나노 클러스터의 예상 크기는 직경이 ~ 130 ㎚이다.
  7. 새로운 원뿔 튜브로 단계 3.5에서 뜨는을 전송합니다.
  8. 30 분 동안 1,500 XG에서 단계 3.6에서 현탁액을 원심 분리기. 10 분 초음파 하에서 0.1 mM의 시트르산 나트륨에 재현 탁하고 침전물을 수집한다. 나노 클러스터의 예상 크기는 ~ 직경 90 ㎚이다.
  9. 300 추가 _6, UV-VIS-NIR 흡수 스펙트럼 측정 용 96 웰 마이크로 플레이트 리더로 ​​L 개의 나노 클러스터 현탁액. TEM 영상 탄소 코팅 된 구리 그리드에 10 ㎕의 나노 클러스터 현탁액을 삭제합니다.

나노 클러스터에 대한 단일 클론 항체의 4 활용

  1. 100 ㎕의 단클론 항체 용액 PBS (1 ㎎ / ㎖), pH가 7.2, 예를 들어, 안티 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2) 항체 또는 항 표피 성장 인자 수용체 1 (EGFR) 항체를 준비합니다.
  2. 3.9 ml의 4 mM의 HEPES, pH를 7.2 단계 4.1에서 항체 솔루션을 추가합니다. 원심 분리기 8 ° C에서 20 분 동안 3,250 XG에 10 K MWCO 원심 필터를 통해 솔루션을 제공합니다. 100 μL의 최종 볼륨, 4 mM의 HEPES, pH가 7.2에서 항체를 재현 탁.
    NOTE :이 단계는 HEPES와 항체 용액에 원본 미디어를 대체하기 위해 수행된다.
  3. 항체 용액 100 mM의 NaIO 4-100 μL의 10 μl를 추가합니다. 알루미늄과의 반응 바이알을 덮RT에서 uminum 호일 및 진탕를 사용하여 30 분 동안 혼합한다.
  4. 1X PBS 500 μl를 첨가하여 반응을 켄 칭하고.
  5. 단계 4.4에서 항체 용액에 46.5 MM의 링커 용액 2 μL (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2)를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 흔들어.
  6. 8 ° C에서 20 분 동안 3,250 XG에 10 K MWCO 원심 분리기 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. ~ 1 ㎎ / ㎖의 항체 농도에 이르게 100 μL의 최종 부피로 1X PBS에 재현 탁 항체.
  7. 실온에서 120 분 동안 단계 4.6 (1 ㎎ / ㎖)에서 1.0 1 μL에게 ~ OD에서 수정 된 항체를 100 ㎕의 나노 클러스터 현탁액을 섞는다.
  8. 10 -3 M 5 kDa의 티올 PEG의 10 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 흔들어.
  9. 3 분 동안 830 × g으로 용액을 원심 분리기. 상층 액을 버리고 PBS, pH를 7.2 / 5 V kDa의 PEG w 100 ㎕의 2 %에서 침전물을 재현 탁.
  10. 항체 공역 나노 클러스터의 흡광도 스펙트럼을 측정하고 비교하기 위해 톤그는 노출 된 나노 클러스터의 스펙트럼을 흡수. 접합 후 나노 미터 레드 시프트의 몇 가지를 기대합니다.
  11. 나노 입자와 같은 붉은 NIR 영역에서의 OD의 증가에 크게 시프트 골재로 나타낸 경우, 5 × 10-3 M.에 티올 PEG의 농도를 증가 또한, 30 분에 티올 PEG와 배양 시간을 증가시키고 200 XG 단위 원심 속도를 감소시킨다.
  12. 암 세포 라벨링 테스트를 위해 하나 또는 배지 1X PBS (ML 1 ~ 10 6 세포) 암 세포 현탁액 단계 4.9에서 항체보기 접합 된 나노 입자를 추가하고 60 분 동안 혼합한다.

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결과

immunotargeted 자기 플라즈몬 나노 클러스터의 합성을위한 방식은도 2에 도시된다. 첫째, 자기의 Fe 3 O 4 산화철 나노 입자는 열분해 법 통해 synthetized된다. 이어서, 박막을 약 1 nm의 금 쉘은 열분해를 통해 철 산화물 코어 입자 상에 증착된다. 씨앗 중유 마이크로 에멀젼 방법을 이용하여 자기 플라즈몬 나노 클러스터를 생성하도록 캘리포니아 주 6 나노 하이브리드 입자는 역할을한다. 나노 클러스터는 특정 분자 표적에 대한 단일 클론 항체로 작용한다.

합성 된 철 산화물 코어 입자의 크기는 직경이 ~ 5 ㎚이다. 자성 코어 상에 금 쉘 증착 한 후, 기본 철 산화물 코어 / 쉘 금 나노 입자의 크기가 증가 직경 ~ 6 nm이다. 골드 쉘과 증착 후 적자색에 산화철 나노 입자의 콜로이드 갈색 색상 변경,마지막으로, ~ 180 nm의 직경 구형 나노 클...

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토론

자기 플라즈몬 나노 클러스터의 성공적인 합성에 중요 단계는 고도로 단 분산 금 차 쉘 / 철 산화물 코어 입자를 제조하고 나노 클러스터로 일차 입자의 자기 조립을 지시하는 것을 포함한다. 일차 입자 및 계면 활성제 사이의 몰비는 나노 클러스터의 크기 분포를 결정하는데 중요한 역할을한다. 차 나노 입자의 비 균일 한 크기 분포는 자기 플라즈 모닉 나노 클러스터를 조립하는 동안 큰 골재 형성의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 나노 클러스터의 형성 방법은 마이크로 에멀젼 양친 성 계면 활성제에 의존 : 소수성 꼬리 기는 함께 일차 입자를 보유하고 친수성 ​​머리 기는 나노 클러스터 수용액을 안정화. 계면 활성제의 농도는 나노 클러스터 조립체를 결정 고농도 작은 나노 클러스터 또는 각각의 일차 입자 및 입자 응집 초래 저농도의 형성으로 이어질 것이다.

합성 AS-나노 클러스터는 추가적인 분리 단계를 필요로 300 nm의 CA에 CA가 50 nm 내...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 NIH 보조금 R01 EB008101 및 R01 CA103830에 의해 부분적으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PYREX 50 ml 둥근 바닥 끓는 플라스크 짧은 목 & 24/40 [ST] 조인트Corning4320A-50열분해 반응
PYREX 41 x 300 mm 24/40 [ST] 외부/내부 조인트가 있는 5-전구 Allihn 콘덴서Corning2480-300열분해 반응
실리콘 오일FisherS159-500오일 배스
핫 플레이트 교반기코닝PC-351교반 기능으로 리액톤 가열
온도계ThermoWorks221-092온도 측정
철 (III) 아세틸 아세토 네이트 FisherAC11913-02501 차 하이브리드 나노 입자 합성 용 재료
올레산 99 %FisherA195-5001 차 하이브리드 나노 입자 합성 용 재료
금 (III) 아세테이트FisherAA3974206: 1 차 하이브리드 나노 입자 합성 용 재료
: HexaneFisherH292-1: 1 차 하이브리드 나노 입자 합성 용 재료
페닐 에테르 : 99 %FisherAC13060-0025: 1 차 하이브리드 나노 입자 합성 용 재료
1,2- 헥사 데칸네디올 90 %시그마213748-50G: 1 차 하이브리드 나노 입자 합성
용 재료Oleylamine 70 %SigmaO7805-100G1 차 하이브리드 나노 입자 합성 용 재료
도데 실황산나트륨FisherBP166-100클러스터 합성
구연산나트륨 이수화물시그마W302600클러스터 합성
단클론 항 EGF 수용체 항체SigmaE2156세포 라벨링 특이성 테스트
단클론 항 HER2 항체SigmaAMAB90627Cell 라벨링 특이성 테스트
Sodium periodateSigma311448Oxidate Fc 항체 영역
Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014B대한 항체 접합을 위한 이종 작용성 링커
, 5 kCreative PEGworksPLS-604항체 결합 후 남은 금 표면을 패시베이트하십시오.
Amicon Ultra-4 원심 필터 유닛과 Ultracel-10 막MilliporeUFC801008단백질 정제
HEPESSigmaH3375Buffer
PBS, 1x 용액FisherBP2438-20Buffer
UV-Vis 분광기BioTek Synergy HT스펙트럼
원심분리기획득 Eppendorf5810R분리
투과 전자 현미경FEITECNAI G2 F20 X-TWIN나노 구조의 형태 획득
정립 현미경LeicaDM6000암시야 이미지 획득
SonicatorBranson1510초음파 처리
탄소 필름 300 메쉬 그리드EMSCF300-CuTEM 이미징
96웰 플레이트Corning09-761-145UV-Vis 판독 플레이트
나노클러스터 메톡시-PEG-티올에

참고문헌

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  16. Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).

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