방법 논문

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

DOI:

10.3791/52095

⸱

2014년 11월 18일

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

이 논문에서

요약

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MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

초록

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미르 복제 및 높은 처리량 시퀀싱 미르-SEQ는, 단일 염기 해상도의 miRNAs를 정량화하기 위해 사체 차원의 접근 방식으로 독립적이라고. 이 기술은 miRNA의 분자 3 ', 5'올리고 뉴클레오티드 어댑터를 연결하여 miRNA가를 캡처하고 새로이 miRNA의 검색을 할 수 있습니다. 강력한 차세대 시퀀싱 플랫폼과 커플 링,은 miR-SEQ는 miRNA의 생물학의 연구 수단이되어왔다. 그러나, 올리고 뉴클레오티드 결찰 단계에 의해 도입 상당한 편향 정확한 정량 도구로서 사용되는은 miR-SEQ을 방지했다. 이전의 연구는 현재의 miR-SEQ 방법의 편견은 종종 일부 miRNA가 1,2 1,000 배까지 오류가 부정확 한 miRNA의 정량으로 이어질 것을 보여줍니다. RNA 결찰에 의해 부여 이러한 편견을 해결하기 위해, 우리는 모두 3 ', 5'결찰 단계에 대한 95 %의 결찰 효율성을 초래 작은 RNA 결찰 방법을 개발했다. 이 메신저를 벤치마킹지속적으로 기대 값에서보다 두 배 편차 번호를 읽어 산출, 몰 또는 차등 혼합 된 합성의 miRNA를 사용하여 라이브러리 생성 방법을 입증했다. 또한,이 고효율의 miR-SEQ 방법은 생체 내 총 RNA 샘플 2에서 정확한 게놈 전체의 miRNA의 프로파일 링을 허용한다.

서론

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높은 처리량 시퀀싱 기반의 방법론은 널리 크게 생물학적 시스템 3,4의 분자 복잡성에 대한 우리의 이해를 확장 최근 몇 년 동안 많은 생물학적 시료에 적용되고있다. 그러나, 높은 처리량 시퀀싱 RNA 샘플의 제조는 종종 이러한 강력한 기술의 잠재 성을 제한하는 고용 방법론에 내재 특정 바이어스를 부여한다. 이 방법은 특정 편견 잘 결찰 기반, 작은 RNA 라이브러리 준비 1,2,5,6- 문서화되어있다. 이러한 편견은 1,000 배의 변화에​​에서 격렬 변수 및 오류가 발생하기 쉬운 시퀀싱 데이터에서 miRNA의 풍요의 추론을, 몰 합성의 miRNA에 대한 숫자를 읽 결과.

파아지 - 유래의 T4 RNA 리가 제의 특성에 초점을 연구 효소는 높은 처리량 시퀀싱 실험에서와 같이 편향된 라이브러리를 나타내 뉴클레오타이드 기반 선호도 7 나타내는 것을 문서화 까지. RNA 리가 제에 의해 부여 된 편향을 최소화하기 위하여, 여러 전략이 사용되었다; 거대 분자, 9 군집 결찰 사이트 6 근접한 어댑터 뉴클레오타이드 서열을 랜덤 화하고, 결찰 어댑터 (2)의 높은 농도를 채용. 이 세 가지 방법의 조합을 통해 우리는 높....

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프로토콜

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참고 : 전체 과정 동안의 RNase가없는 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

3 '링커 1. Adenylation

  1. 뉴 클레아 제 무 H 2 O. 100 μM 3 '라이 게이션 반응을 위해 설계된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 희석
    참고 : 올리고 뉴클레오티드는 5 '인산기, 5에서 무작위 뉴클레오티드'끝, 및 3 'dideoxycytosine이 있어야합니다. 5 adenylation 10 '인산기 효율적인 5 M의 효소의 요구 사항이다.' 포스페이트 직접 변형과 폴리 뉴클레오티드 키나아제와 함께 올리고 뉴클레오티드의 예비 처리에 의해 첨가되거나 주문할 수있다. 5 '말단에서 무작위 뉴클레오티드는 특정 최종 끝이 다른 6 이상 반응에 합류하기위한 RNA 리가 제는 전시 순서 기본 설정을 최소화하는 데 중요합니다. 3 올리고 뉴클레오티드 t의 '말단 dideoxycytosine는 (3)에 차단 부재를 배치'오 후속 결찰 단계 동안 링커 링커 concatamers의 형성을 억제하고 또한 연결 반응 (11) (3 ') (3)의 단부에 형성된 mi....

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결과

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위의 방법에 대한 예상 결과는 처음에 (그림 2) M의 RNA 리가 아제에 의한 adenylation의 대상이었다 DNA 올리고 뉴클레오타이드의 크기의 단일 염기 변화 (증가)의 관찰해야한다. 3 '결찰 후, 아크릴 아미드 겔의 시각화 (도 3 참조) 겔 100-300 뉴클레오티드 영역에서 분명 날카로운 고 분자량 밴드를 나타낸다. 이것은 사용되는 총 RNA 샘플 고품질 인 것을 나타낸다 (악화되지 않음). 둘째 하나는 초과 인 젤의 25 뉴클레오티드 지역에서 매우 밝은 신호, unligated 3 '링커를 관찰해야한다. 또한, (3 ')에 결찰 입력이없는 RNA 제어를 포함하는 것이 도움이 될 수있다. 이는 3 '링커의 순도를 나타내는 것이며, 또한, 비특이적 신호가 문제 될 때 사이클 넘버의 표시에 대한 PCR 단계로 연결되는 실시 할 수있다. 5 '결찰에 대한 진단도 없다그러나도 4에 도시 채용 PEG8000의 고농.......

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토론

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본원에 기재된 방법은 결찰 효율, 즉 PEG, 무작위 링커의 사용의 높은 농도, 및 링커 2,6,9 고농도을 최대화하기 위해 여러 주요 변수를 사용한다. 이 방식은 총 RNA 시료 (2)로부터 안정적으로 정량적 시퀀싱 라이브러리를 허용한다. 우리는 입력 RNA의 다수의 적정을 수행하고 선행하는 방법론 (데이터 미기재) 1-8 μg의 범위에서 총 RNA 량에 가장 적합한 것으로 결론 지었다. 10-500 ng의 범위의 양으로 사용하는 경우, 판독 공간의 대부분은 어댑터 concatamers 및 RNA 리가 제를 정제하는 박테리아 서열에 의해 소비된다. 그러나, 그것은 저에이 숫자를 읽 불구하고 동일한 높은 입력 샘플과 비교했을 때 현재 미르 종, 여전히 실제 금액을 반영 이러한 낮은 입력 실험에서 주목할 가치가있다. 위해 총 RNA 샘플에서 관찰 미르 프로필이 실제 반영되도록하려면, 다른 샘플의 반대 심문을 할 수 있도록 양 우리는 정기적으로 세 합성 교정기 RNA를 12의

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 링커 설계 및 결찰 효율성에 관한 유익한 토론을 해준 Yi 연구실 구성원들, 특히 Zhaojie Zhang에게 감사의 뜻을 전하며, J.E.L.에 대한 박사 후 연구원(#125209)을 통해 이 연구를 지원해 준 미국 암 학회(American Cancer Society)에도 감사의 뜻을 전합니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 지원도 받았습니다 R01AR059697 (R.Y.에게) 및 Linda Crnic Institute for Down Syndrome의 연구 보조금. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3' 링커(5' 인산화, 3' 차단)통합 DNA 기술맞춤형
5' 링커통합 DNA 기술맞춤형5' 차단, HPLC 정제
T4RNL2(1-249 K227Q)New England BiolabsM0351S사전 아데닐화 DNA 어댑터의 결찰에 특화
10x 결찰 완충액(ATP 제외)뉴잉글랜드 M0351S
10x 결찰 완충액(ATP 포함)
RNaseOUTInvitrogen10777-019
폴리에틸렌 글리콜(mol. Wt. 8,000)M0204L
Nuclease-free waterAmbionAM9937에 포함된 New England Biolabs우리는 증류 장치에서 수집한 물이 동일한 품질임을 발견했습니다.
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT 키트Invitrogen18080-051 
Phusion PCR kitNew England BiolabsM0530S
Illumina RP1 프라이머Integrated DNA Technologies맞춤형Illumina
Illumina RT 프라이머서열 정보 Integrated DNA Technologies맞춤형Illumina Illumina 인덱스 프라이머에서 사용 가능한 서열 정보
IntegratedDNA Technologies맞춤형Illumina
40% AcrylamideFisher ScientificBP14081
UreaSigma AldrichU6504
Ammonium persulfateSigma AldrichA3678
Tetramethyethylenediamine (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x Denaturing RNA loading bufferNew England Biolabs포함 M0351S
면도날포함 VWR55411-050
SpinX Centricon 튜브CostarCLS8161
저잔류 마이크로퓨지 튜브Fisher Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
Adenylation kitNew England BiolabsE2610L
에 포함된 BiolabsM0204L 에 포함된 New England Biolabs에서 사용 가능한

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  2. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency ....

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태그

RNAmiR SeqRNAcDNAmiRNA

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