방법 논문

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

DOI:

10.3791/52107

⸱

2015년 2월 3일

 ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Inflammation Research, Queen's Medical Research Institute, The University of Edinburgh, 2Department of Cell & Developmental Biology, University College London

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

종양 이전 세포의 진행과 선천성 면역 세포 상호 작용의 가장 초기 사건을 연구하는 것은 암을 이해하고 치료하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 상피 세포 형질전환을 조건부로 유도하는 방법과 제브라피시 유충에서 피부 세포를 발현하는 HRASG12V와 선천성 면역 세포 상호 작용의 후속 라이브 이미징에 대해 설명합니다.

초록

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여기에서는 제브라피시 유충에서 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 유도성 KalTA4-ERT2/UAS 발현 시스템1을 사용하여 상피 세포 형질전환을 조건부로 유도하는 방법과 피부 세포를 발현하는 HRASG12V와 선천성 면역 세포 상호 작용의 후속 라이브 이미징을 설명합니다. KalTA4-ERT2/UAS 시스템은 유도 및 가역적이어서 in vivo에서 정확한 시간적/공간적 해상도로 세포 형질전환을 유도할 수 있습니다. 이를 통해 개별 종양 이전 세포가 출현하자마자 숙주 조직과 어떻게 상호 작용하고 진행 및 퇴행을 추적할 수 있는지 실시간으로 이미지화할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 제브라피시 유충에 대한 최근 연구는 종양 형성의 초기 단계에서 선천성 면역의 영양 기능을 보여주었습니다2,3. 우리의 유도 가능한 시스템을 통해 세포 형질전환의 시작과 후속 숙주 반응을 실시간 이미지로 촬영할 수 있으며, 이는 발암성 영양 염증 반응의 조절을 위한 기본 메커니즘에 대한 중요한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 또한 관심 조직에서 이소성 유전자 발현의 시간적 및 공간적 제어를 달성하기 위해 프로토콜을 조정할 수 있는 방법에 대해서도 논의합니다.

서론

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그렇지 않으면 정상 상피 시트 내에서 발암 세포 자손의 전면에 자라 강하게의 미세 환경과의 상호 작용에 따라 달라집니다. 숙주 조직과의 상호 작용은 종양 전 셀이 상기 부푼 암으로 발전하는 클론 틈새를 확립 할 수 있는지의 주요 결정 요인이 될 가능성이 높다. 개발의 중요성에도 불구하고, 암의 진행이 초기 단계는 생체 내에서, 가장 일반적으로 사용되는 모델 시스템에 액세스 할 수 없습니다.

제브라 피쉬, 다니오 레 리오 (rerio)은, 때문에 개발 전반에 걸쳐 투명성, 수용성 약물의 유전자 조작에 대한 가능성과 접근성의 라이브 영상 검사에 대한 잘 확립 된 모델 생물이다. 상피 세포를 변환하는 과발현, 인간의 종양 유전자 HRAS G12V을 애벌레 제브라 피쉬 모델을 사용하여 최근의 연구는 숙주 세포가 특정 H 2 O 2 (으)로에서 신호를 유도 것을 보여 주었다선천성 면역 세포의 모집. 흥미롭게도, 모집 면역 세포, 호중구 및 대식 세포는 종양 전 세포 증식을 지원 2,3- 영양 역할을하는 것으로 하였다.

종양의 개시 및 진행의​​ 초기 사건뿐만 아니라 염증 반응의 기여를 이해하기 위하여, 하나는 이후 초기 시점에서 이러한 이벤트 이미지 할 수 있어야한다. 그러므로 시간적 및 조직 특이 적으로 세포 변환을 제어 할 필요가있다. 우리는 성공적으로 조건부 피부 특이 적 프로모터 각질 4 (krt4)의 제어하에 인간 종양 유전자 HRAS G12V을 표현하는 초파리 4에서 적응 된 GAL4 / UAS 시스템을 5 활용합니다. GAL4 전사 활성 즉, KalTA4 (6)의 수정 된 버전은, 상류 활성화 서열의 제어 (UAS하에 HRAS G12V의 발현을 가능하게). 조건부 전사 활성의 발현을 유도하기 위하여, 특별히 KalTA4 -4- Hydroxytamoxifen 결합 인간 에스트로겐 수용체 α의 돌연변이 리간드 결합 도메인 (ER의 T2) (7)에 융합 된 (4-OHT) 1. 4- OHT의 부재에서 ER-T2는 열 충격 단백질에 의해 세포질 바인딩된다. 4-OHT에 관심 8의 유전자를 제어 UAS의 KalTA4-ER T2의 핵 전위 이후 활성화 있도록, 단백질이 해리 열 충격 바인딩 (그림 1C을, B). 이러한 발현 시스템은 4 OHT의 존재에 의존 같이, 관심 유전자의 발현 조절 KalTA4 가역적이다. 비가역 재조합 이벤트 리드 치운다 ER의 T2 / 된 LOX 시스템과는 달리, KalTA4 ER-T2 의한 전사 활성화의 유도는 또한 4-OHT 제거함으로써 가역적이다.

다음 프로토콜여보세요 제브라 피쉬 애벌레 피부 세포의 조건 변화와 형광 단백질 발현에 의한 선천성 면역 세포와의 상호 작용의 후속 모니터링 WS. 13 -이 프로토콜에서 사용되는 기본적인 방법은 제브라 피쉬 커뮤니티 (9) 내에서 일반적으로 사용되는 기술과 유사하다.

세대와 함께 유전자 변형 구조의 미세 주입으로 유전자 변형 라인의 조합 적 사용은 모자이크 방식으로 단일 세포를 변환하는 일시적인 접근 할 수 있습니다. 배아와 유충 지브라 피쉬 피부의 산소 투과도는 일 시간이다 고해상도 현미경으로 시간 경과 라이브 영상 검사를위한 가능성을 제기한다. 또한, 수용성 약물 접근성 미래 기전 연구 및 암 발생의 초기 단계의 이해로 이어질 수 생체 내에서 세포의 생물학적 이벤트의 감시를 허용 할 것이다.

_content는 ">이 프로토콜은 모자이크 방식으로, 제브라 피쉬 유충에서 관심있는 조직 조건부 유전자 발현을 수행하도록 할 수있다. 하나는 또한 피부 이외의 화상 깊은 조직을 살 수 있도록 설정 현미경을 최적화 할 수있다.

프로토콜

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다음 실험 절차는 1986년 동물(과학적 절차)법에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 미세주입을 위한 플라스미드 DNA 제조

  1. 플라스미드 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2를 정제하고; cmlc2:eGFP를 제조업체의 지침에 따라 상용 플라스미드 DNA 정제 키트로 사용하고 플라스미드 DNA를 100ng/μl의 최종 원액 농도로 희석합니다.
  2. 제조업체 프로토콜에 따라 BamHI 제한 분해에 의해 플라스미드 pT3TS/Tol214를 함유하는 트랜스포사제를 선형화합니다. 이 단계는 하룻밤 사이에 연장될 수 있습니다. 표준 프로토콜에 따라 페놀/클로로포름 추출로 선형화된 DNA를 침전시킵니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 다량의 capped RNA를 위한 상용 전사 키트를 사용하여 선형화된 플라스미드의 transposase mRNA를 in vitro에서 전사하고, nuclease-free water에서 100ng/μl의 최종 원액 농도로 희석 및 분취합니다. 네이티브 1-2% TAE(40mM Tris, 20mM 아세트산, 1mM EDTA) 아가로스 겔 전기영동(80-120V)으로 정제된 RNA의 품질을 보장합니다. RNA를 -80°C에서 보관하십시오.

2. 일시적 유전자 발현을 위한 플라스미드 DNA의 미세주입

  1. 주사 중에 수정란을 담을 수 있도록 아가로스 주사 플레이트를 준비합니다. 3mm 페트리 접시에 액체 90% 아가로스를 붓습니다. 아가로스를 40-50 °C로 식히고 액체 아가로스 위에 쐐기 모양의 미세 사출 금형 TU-1을 추가합니다. 실온에서 경화시킨 후 아가로스를 4°C에서 30분 동안 그대로 두었다가 곰팡이를 제거합니다. 미세 사출 금형은 4°C에서 보관하고 재사용하십시오.
  2. 주입 용액의 부분 표본을 준비합니다. 얼음 위에서 다음 단계를 수행합니다. 플라스미드 DNA 1 μl(최종 농도 10 ng/μl), 트랜스포사제 mRNA 2 μl(최종 농도 20 ng/μl), 10 mg/μl 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란 2 μl, 5x Danieau 용액 2 μl(290 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 3 mM Ca(NO3)2, 25 mM HEPES, pH 7.6)을 뉴클레아제가 없는 물에서 10 μl의 최종 부피로 분해합니다.
  3. 내부 필라멘트가 포함된 직경 1mm의 붕규산 유리 모세관에서 마이크로피펫 풀러로 모세관을 반대 방향으로 당겨 바늘을 준비합니다. heat 530, pull 200, velocity 80 및 time 150 프로그램을 사용하십시오.
  4. 바늘 하나에 2μl의 주사 용액을 채웁니다(얼음에 보관). 용액을 모세관으로 방출하는 동안 마이크로로더 팁을 조심스럽게 당겨 기포를 방지합니다. 집게로 바늘 끝을 조심스럽게 부러뜨립니다.
  5. 공압식 피코 펌프로 낙하 크기를 조절하십시오. 방울 직경/부피(V = 4/3πr3)를 측정하고 디메틸폴리실록산의 입체 현미경 아래에서 안구 마이크로미터로 입자 크기를 조정합니다. 0.5 nl에 해당하는 100 μm를 권장합니다. 이는 주입된 각 배아당 균일하고 재현 가능한 농도를 보장합니다. 주입된 농도를 적정하고 각 구성물 및 플라스미드 준비에 대해 조정합니다.
  6. Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 15와 Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg 16의 십자가에서 얻은 접합자(그림 1A)를 3ml 페이스트를 사용하여 사출 플레이트의 금형에 놓습니다. 한편, 용액이 마르거나 응고되는 것을 방지하기 위해 미리 준비된 주사 바늘의 끝을 디메틸폴리실록산에 보관하십시오.
  7. 첫 번째 절단 전에 융모막을 통해 입체경 아래에서 사전 측정된 방울(0.5 nl에 해당하는 100 μm)을 배반구디스크(17)에 주입합니다(그림 1A). 단세포 단계로의 주입은 발달 중인 세포 덩어리에서 플라스미드 DNA와 RNA의 균일한 분포 가능성과 생식세포 전달 가능성을 증가시킵니다. 구성의 표현이 모자이크되는 경향이 더 많다는 것은 주목할 만합니다.

3. 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)에 의한 조건부 피부세포 형질전환

  1. 주입된 배아를 0.3x Danieau 용액에 옮기고 인큐베이터에서 28.5°C로 유지합니다. 구체 단계17에서 접시에서 수정되지 않은 계란을 제거합니다. 동시 주입된 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란은 형광 입체경에서 주입 제어로 사용할 수 있습니다.
  2. eGFP의 심장 발현을 위해 24 hpf (수정 후 시간)에서 배아를 스크리닝합니다. 72hpf까지 cmlc:eGFP 양성 제브라피시 배아를 계속 높입니다. 수질(0.3x Danieau)을 주의 깊게 모니터링하십시오.
  3. 72hpf에서 겸자로 부화하지 않은 배아의 융모막을 제거합니다. 1개의 집게로 융모막을 조심스럽게 찌르고 다른 집게를 사용하여 잡아당깁니다. 형광 입체경을 사용하여 lysC:dsRed2 발현을 위한 배아를 선택합니다.
  4. 10mM의 (Z)-4-하이드록시타목시펜 10μl를 20ml의 0.3x Danieau 용액(최종 농도 5μM)에 추가합니다. 40-60개의 배아 배치에 하나의 표준 페트리 접시(90mm)에 4-OHT 유도 용액을 사용합니다.
  5. 배아를 갓 만든 유도 용액 20ml가 들어 있는 새 페트리 접시에 옮깁니다.4-OHT는 어두운 곳에서 보관하고 취급해야 합니다. 첫 번째 발현 징후는 유도 시작 2시간 후 감지될 수 있습니다. 유도 단계는 하룻밤 사이에 연장될 수 있으며, 초기 숙주 세포: 종양 전 세포 상호 작용이 치료 후 몇 시간 후에 이미 발생할 수 있음을 염두에 두십시오.

4. 제브라피시 유충의 장착 및 라이브 이미징

  1. 직경 60-18mm의 구멍을 삽입하여 20mm 페트리 접시를 준비합니다. 고진공 실리콘 그리스를 사용하여 페트리 접시 바깥쪽 바닥의 구멍을 25mm 덮개 유리로 덮고 밀봉합니다(그림 1B).
  2. 1% 저융점(LMP) 아가로스를 준비합니다. 가열 블록에 1.5°C의 LMP 아가로스 튜브 37ml를 보관하십시오.
  3. Tg(krt4:KalTA4-ERT2; UAS : eGFP-HRASG12V; lysC:dsRed2) 형광 입체경 하에서 녹색 형광 피부 세포 및 dsRed2 양성 선천성 면역 세포 발현을 위한 유충. 20ml 유도 용액에 0.4% 트리카인18 1ml를 첨가하여 유충을 마취합니다.
  4. 페이스트렛으로 미리 선택된 유충을 액체 LMP 아가로스로 옮깁니다. 유충을 LMP 아가로스로 가라앉히고 커버 유리로 옮깁니다(그림 1B). 입체경 아래에서 배아의 방향을 지정합니다. 작업 거리(최대 6마리의 유충)를 줄이기 위해 유충을 유리에 직접 놓아야 합니다.
  5. LMP 아가로스를 굳어진 후 트리카인이 함유된 유도 용액으로 덮습니다(그림 1B 화살표).
  6. 반전 형광등, 레이저 스캐닝 또는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 포함된 유충을 이미지화합니다. 40X 또는 63X 대물렌즈를 작동 거리가 긴 대물렌즈로 사용하면 전체 유충에 초점을 맞출 수 있습니다.

결과

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Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006과 Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg 사이의 교배세포의 접합자를 수정 후 10-15분 후에 수집하여(그림 1A) 1개의 세포기 배아를 얻었습니다. 주입 후 배아를 3dpf까지 상승시킨 후 4-OHT로 유도하고 라이브 이미징을 위해 장착했습니다(그림 1B). 유도 후 2-6시간 후, 장착된 배아를 도립 형광 현미경(그림 2A) 또는 도립 컨포칼 현미경(그림 2B-C) 아래에 놓고 1.5분 간격으로 2-3시간 동안 이미지화했습니다. 종양 이전 표재성 피부 세포는 정상 각질세포에 비해 더 둥근 형태와 막에 국한된 eGFP-HRASG12V의 녹색 형광 방출로 식별할 수 있습니다. 종양 전 피부 세포와 선천성 면역 세포의 공동 국소화를 위해 이미징 영역을 선택했습니다(그림 2A 화살촉). 호중구의 빠른 이동 과정으로 인해 최대 강도 투영을 얻기 위해 0.7-1.7μm의 Z 스택 단계 크기로 타임 랩스 간격을 1-1.5분 사이로 선택했습니다(그림 2, 비디오 1). 라이브 이미징 중에 관찰할 수 있는 다양한 행동이 있습니다: 호중구는 종양전 세포 옆 및 아래로 이동하거나(그림 2C, 비디오 1), 세포와 직접 접촉을 형성하거나(그림 2B 및 C), 세포사멸을 겪는 종양 전 세포의 잔해를 제거하거나(비디오 1), 종양전 세포의 일부를 적극적으로 삼킵니다(표시되지 않음). 상호 작용의 전체 스펙트럼을 캡처하려면 타임 랩스 라이브 이미징을 통해 그들의 행동을 추적하는 것이 좋습니다.

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그림 1: 제브라피시 유충의 조건부 피부 세포 형질전환에 대한 개략도. (A) Tg(UAS:eGFP-HRASG12V; lysC:dsRed2) 수정 후 10분 동안 제브라피시(mpf). 수정란은 융모막(화살촉)으로 둘러싸여 있습니다. 주사 부위는 배반구(별표)로, 배아의 동물적 극을 정의하는 난황(화살표)의 세포질 흐름에 의해 형성됩니다. (B) 제브라피시 유충의 장착. 25mm 커버 유리로 밀봉된 18-20mm 구멍(화살촉)이 있는 60mm 페트리 접시. 제브라피쉬 유충은 고정되어 1% LMP 아가로스에 의해 커버 유리에 장착됩니다. LMP 아가로스를 덮기 위해 5μM 4-OHT를 함유하는 0.3x Danieau 용액(화살표)을 사용합니다. (C) 4-OHT는 표재성 피부 세포의 변형을 유도했습니다. (a) 유충 피부의 개략적인 단면 프로파일. 배아 및 유충 피부는 두 개의 상피 세포층, 표재성 세포층과 기저 세포층으로 구성되어 있으며, 이는 기저막(BM)에 연결되어 있습니다. (b) 표재성 피부 세포 사이에서 종양 전 세포 클론을 유도하는 일시적인 발현 시스템. KalTA4-ERT2는 krt4 promoter(노란색)에 의해 구동되는 가장 바깥쪽 피부층에서만 독점적으로 발현됩니다. KalTA4-ERT2의 모자이크 발현은 표재성 세포에서 UAS 제어(파란색) eGFP-HRASG12V 발현을 활성화하여 종양 이전 세포(녹색)의 클론을 유도합니다. (D) 과도 발현 시스템의 개략도. (a) pTol2-krt4:KalTA4-ERT2의 Tol2 카세트; cmlc2:일시적으로 사용되는 eGFP 발현 벡터. (b) 전사 활성화제 발현의 조건부 유도. KalTA4는 4-Hydroxytamoxifen(4-OHT)과 특이적으로 결합하는 인간 에스트로겐 수용체 α(ERT2)의 돌연변이 리간드 결합 도메인에 융합됩니다. 4-OHT가 없을 경우 ERT2는 열 충격 단백질(Hsp90)에 의해 세포질에서 결합됩니다. 4-OHT 결합 시 Hsp90이 해리되어 KalTA4-ERT2의 핵 전좌 및 UAS 제어 eGFP-HRASG12V 발현의 후속 활성화를 허용합니다. 스케일 바 A = 500 μm. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 종양 전형성 및 선천성 면역 세포 상호 작용의 실시간 이미징. (에이씨) 4 dpf Tg(UAS:eGFP-HRASG12V의 이미지; lysC:dsRed2) pTol2-krt4:KalTA4-ERT2가 주입된 배아; cmlc2:eGFP 및 transposase mRNA를 한 세포 단계에서 수행합니다. 이미지는 4-OHT 유도 6시간 후에 촬영되었습니다. (A) 치료 6시간 후 꼬리지느러미 부위의 측면도, 피부 세포를 발현하는 eGFP-HRASG12V 패치(화살표) 및 lysC:dsRed2+ 호중구(화살표)를 보여줍니다. (BC) 컨포칼 타임랩스 영상에서 촬영한 대표 이미지로, 피부 세포(녹색)를 발현하는 eGFP-HRASG12V와 호중구(빨간색)의 상호 작용을 보여줍니다. (B) 종양 전(前) 세포는 접촉하는 호중구(화살촉)와 함께 짧은 사상(filopodial) 확장을 형성합니다. (C) 호중구(빨간색)는 종양 이전 피부 세포(녹색)의 클론과 밀접하게 접촉합니다. 눈금 막대 A = 100 μm; B / C = 50 μm. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: 종양 이전 형성 및 선천성 면역 세포 상호 작용의 타임랩스 라이브 이미징. 4 dpf Tg(UAS:eGFP-HRASG12V의 저속 촬영; lysC:dsRed2) 배아, pTol2-krt4:KalTA4-ERT2 주입; cmlc2:eGFP 및 transposase mRNA를 한 세포 단계에서 수행합니다. lysC:dsRed2+ 호중구(빨간색)와 eGFP-HRASG12V를 발현하는 피부 세포(녹색)의 상호 작용을 보여주는 4-OHT 유도 후 6-9시간 후의 컨포칼 타임랩스 영상. 호중구는 종양전(preneoform) 세포 옆과 아래로 이동하여 세포사멸(apoptosis)을 겪는 종양전(preneoplastic cell)의 잔여물을 제거합니다. 1.3μm의 Z 스택 스텝 크기로 3시간 동안 1.5분의 타임 랩스 간격.

토론

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배아 발생 및 유충 발달 동안 배아 제브라피쉬 피부는 두 개의 상피층, 주변엽이라고 하는 표재층과 기본 기저막에 부착된 기저 각질세포 층으로구성됩니다(그림 1C, a). 여기에 제시된 프로토콜은 제브라피쉬 유충의 표재성 피부층에서 전종양 세포 형질전환을 조건부로 유도하는 간단한 방법을 설명하고 라이브 이미징에 의한 선천성 면역 세포와의 후속 상호 작용 분석을 허용합니다. 프로토콜의 기본 방법론은 잘 확립된 제브라피쉬 기술 9-13을 따르며 프로토콜을 쉽게 조정하고 수정할 수 있습니다.

여기에 사용된 krt4 프로모터5 는 특히 가장 바깥쪽 피부층에서 KalTA4-ERT2 발현을 유도합니다(그림 1C, b). 그러나 krt4:KalTA4-ERT2구조 (그림 1D, a)를 생성하는 데 사용되는 모듈식 MultiSite Gateway 복제 전략은 단일 복제 단계에서 KalTA4-ERT2 앞에 관심 있는 프로모터를 복제할 수 있는 가능성을 제공합니다. 따라서 본원에 제시된 방법의 적응은 배아 발생 및 유충 단계 동안 대부분의 조직에 대해 가능하다. 프로모터 서열의 가용성은 이로써 제한 요인이다. 또한, UAS 뒤에 복제된 거의 모든 관심 유전자는 공간적 및 시간적으로 제어된 KalTA4-ERT2 발현을 사용하여 다양한 발달 단계에서 조건부로 과발현될 수 있습니다. 따라서 우리의 프로토콜은 제브라피쉬 유충의 관심 있는 모든 조직에서 모자이크 방식으로 조건부 유전자 발현을 수행하도록 조정될 수 있습니다. 간이나 췌장과 같은 더 깊은 조직을 생사로 촬영하기 위해 현미경 설정을 최적화할 수도 있습니다.

우리는 여기에서 프로토콜을 사용하는 하나의 응용 프로그램을 설명했으며, 유사하게, 후보 염증 조절제의 발현 유도 및 정지 후 호중구 및 대식세포 행동 변화를 쉽게 라이브 이미지로 쉽게 볼 수 있기 때문에 염증 반응의 조절을 연구하기 위해 이 프로토콜을 사용하여 다른 염증 조절제를 과발현할 수 있습니다. 또한, 적응된 프로토콜은 조직 형태 형성 및 장기 형성의 여러 단계에서 세포 이동 및 행동 변화를 추적하고 최종적으로 유도 가능한 KalTA4-ERT2/UAS 발현 시스템에 의해 표적이 될 수 있는 다른 특정 세포 계통과 선천성 면역 세포 상호 작용의 상호 작용을 라이브 이미지로 촬영하려는 사람들에게도 도움이 될 것입니다.

우리는 F0 스크리닝 프로세스를 단순화하는 선택 마커20으로 녹색 형광 양성 심장에 의한 배아의 후속 선택을 허용하는 cmlc2:eGFP-pA 카세트(그림 1D, a)를 포함하는 제브라피쉬 Tol2kit20-23의 pDestTol2CG 벡터를 사용했습니다. 관심 있는 트랜스포존 측면 유전자를 게놈에 안정적으로 삽입하는 것은 트랜스포자제 mRNA와 함께 플라스미드 DNA를 동시 주입함으로써 촉진됩니다. 마이크로 주입을 위한 플라스미드 DNA 및 전위 효소 mRNA의 준비는 표준 프로토콜을 따릅니다. 그러나 구조물을 게놈에 성공적으로 통합하는 것은 Tol2 기반 전치(14)에 달려 있습니다. 이는 RNase 및 DNase에 의한 오염 및 분해를 방지하기 위해 멸균 조건에서 얼음 위에서 작업하는 데 특별한 주의를 기울여야 함을 강조합니다. 단일 세포 단계 배아에 대한 미세 주입은 제브라피쉬의 기능 획득 및 상실 연구를 위한 강력하고 잘 확립된 기술입니다9,10. 잘 훈련된 사람은 1,000시간 안에 1개 이상의 배아의 난황자에 쉽게 주입할 수 있지만 배반판(그림 1A, 별표)에 주입하려면 더 많은 경험과 훈련이 필요합니다. 이 절차에서 중요한 것은 바늘을 다루는 것입니다. 바늘은 손상 없이 세포를 관통하려면 매우 가늘어야 하므로 맨 끝에서만 부러져야 합니다. 각 배아에 균일한 주입을 보장하기 위해 주입 중 방울 크기를 정기적으로 제어하고 측정하는 것이 중요합니다. 조심스럽게 다루면 바늘을 사용하여 배아를 회전시킬 수 있습니다. 이것은 배반판과 최적의 침투각을 찾는 데 종종 필요합니다.

주입에 사용되는 DNA 및 트랜스포자제 mRNA의 농도는 거의 확실하게 발현 효율에 영향을 미칩니다. 더 높은 용량은 이식유전자를 발현하는 세포의 비율을 증가시킬 수 있지만 DNA(>50ng/μl) 및 전이 효소 mRNA(>100ng/μl)의 농도가 높을수록 주입된 배아 사이에서 독성 효과의 가능성도 발생합니다. 우리는 주사용 10ng/μl DNA 및 20ng/μl 전자리효소 mRNA를 사용하는 것을 선호하며, 이는 주입된 배아당 50pg의 플라스미드 DNA 및 100pg의 RNA에 해당합니다. 이러한 농도로 주입된 배아의 100%는 정상적으로 발달하며, 단일 세포로의 주입 효율에 따라 4-OHT 유도 후 40-70% 사이에서 eGFP-HRASG12V 발현을 나타냅니다. 양성 배아 중 일반적으로 약 30%는 1-10개의 클론을 가지고 있고, 40%는 10-50개의 클론을 가지고 있으며, 30%는 50개 이상의 클론을 가지고 있습니다. 우리의 연구 목표로 인해 우리는 eGFP-HRASG12V를 발현하는 클론이 더 적은 배아의 사용을 선호합니다. 우리는 일시적인 실험을 위해 10-50개의 클론이 있는 배아를 선택합니다. 형질전환 창립자 물고기의 생성을 위해 표피에 eGFP 양성 심장 마커와 다수의 eGFP-HRASG12V 양성 클론이 모두 있는 배아만 선택하는 것이 좋습니다.

(Z)-4-하이드록시타목시펜은 빛에 노출될 때 시스-트랜스(E-Z) 상호 전환을 겪습니다24. 시스 이성질체(E)는 트랜스 대응물보다 항에스트로겐 효과가 100배 적은 것으로 밝혀졌습니다25,26. 따라서 빛에 대한 노출을 피해야 합니다. 에탄올에 용해된 4-OHT 원액은 -20°C에서 어두운 곳에 장기간 보관할 수 있습니다. 인큐베이터 내에서 표적 유전자 유도 및 운송 중에 페트리 접시를 빛으로부터 보호하기 위해 상자를 사용하는 것이 좋습니다. 이미징 영역이 매우 작고 UV 광선에 대한 4-OHT의 노출이 최소한으로 감소하지만 최대 발현 수준을 유지하기 위해 장기간에 걸쳐 이미징하는 동안 2시간마다 유도 용액을 지속적으로 교환하는 것이 좋습니다. 4-OHT는 제브라피쉬 배아 발생 과정에서 융모막과 가장 바깥쪽 피부층을 통해 효과적으로 투과화되므로 유전자 발현을 매우 빠르게 유도할 수 있습니다. 유도 2시간 후 eGFP 방출을 쉽게 관찰할 수 있으며, 표적 유전자 발현의 첫 징후는 치료 1시간 후에 관찰될 수 있고 치료 3시간 후에 정체기가 관찰될 수 있다고 보고되었습니다8. 차이점은 우리 연구에 사용된 다른 프로모터 때문일 수 있습니다. 4-OHT 처리가 용량 의존적이라는 이전에 보고된 바와 같이8,27, 우리는 일시적인 접근법에서 강력하고 재현 가능한 발현 수준을 달성하기 위해 보고된 최고 농도인 5μM을 사용하기로 선택했습니다. 이것은 이식유전자를 운반하는 모든 세포가 표적 유전자 발현을 유도할 것임을 보장해야 합니다.

여기에 제시된 일시적인 접근 방식은 다중 및 무작위 게놈 삽입 이벤트의 가능성으로 인해 다양한 발현 수준으로 이어질 수 있다는 점을 고려해야 합니다. 또한, Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006의 Tol2 형질전환 배경에서 전위효소 mRNA를 사용하면 유전자 침묵 또는 파괴를 초래할 수 있는 UAS 형질전환유전자의 잠재적인 전위가 발생할 수 있습니다. 그러나 여기에 제시된 방법은 일시적인 접근 방식을 나타내기 때문에 주사 후 배아의 사전 선택이 필수입니다. 많은 실험실에서 UAS 서열이 형질전환 자손에서 침묵하는 경향이 있으므로 pTol2-krt4:KalTA4-ERT2를 주입한다는 것을 발견했습니다. cmlc2:eGFP 구조물을 Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 배아에 주입하는 것은 UAS 구조물을 Tg(krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2:GFP) 배아. Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006과 교배된 안정적인 형질전환 계통 Tg(krt4:KalTA4-ERT2)를 사용하면 시간 용량 의존적 4-OHT 유전자 활성화의 온/오프 동역학을 정확하게 모니터링할 수 있습니다.

유충을 장착하는 동안 중요한 단계는 LMP 아가로스와 커버 유리로 옮기는 것입니다(그림 1B). 액체 LMP 아가로스 온도에는 짧은 시간 프레임이 있어 열 충격이나 겔의 경화로 인해 물고기에 해를 끼치지 않고 미리 선택된 유충의 안전한 전달 및 방향을 지정할 수 있습니다. 유충은 후속 현미경 분석을 위한 작동 거리를 줄이기 위해 커버 유리에 직접 향해야 합니다. 이는 현미경 검사 중 제한 요인이 될 수 있으므로 적절한 대물렌즈를 선택해야 합니다. 일단 장착되면 유충은 몇 시간에서 며칠까지 유지될 수 있습니다.

본원에 제시된 모델 시스템의 조건성은 이식유전자의 4-OHT 활성화에 의한 반복적인 형질전환을 허용한다. 발현 시스템은 4-OHT의 존재에 따라 달라지므로 관심 유전자의 KalTA4 제어 발현은 가역적입니다(그림 1D, b). 비가역적 게놈 재조합 사건을 촉진하는 Cre-ERT2/Lox 시스템과 달리28, KalTA4-ERT2/UAS는 4-OHT의 추가 또는 제거 시 활성화 및 비활성화될 수 있으며 이러한 반복 유도 가능성은 Cre-ERT2/Lox 시스템에 비해 기술의 장점입니다. 그러나 일정한 수준의 4-OHT에 대한 요구 사항은 실험을 며칠에서 몇 주로 연장해야 하는 경우 제한 사항입니다.

공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship에서 Y. F. 100104/Z/12/Z에 자금을 지원했습니다.

칼 터커(Carl Tucker) 박사와 에든버러 대학교 퀸즈 의학 연구소(Queen's Medical Research Institute)의 어류 시설 팀에게 감사의 말씀을 전합니다. 에든버러 대학교 MRC 생식 의학 센터의 면역조직학 및 이미징 시설의 Michael Millar에게 도움을 주신 데 감사드립니다.

p5E-krt4 진입 벡터를 제공해 주신 쾰른 대학교 발달 생물학 연구소의 Matthias Hammerschmidt 교수와 Heiko Loehr 박사에게 감사드립니다. 또한 pDestTol2CG 목적지 벡터를 제공해 주신 에든버러 대학교 신경재생센터의 Dirk Sieger 박사님께도 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(Z)-4-HydroxytamoxifenSigma AldrichH7904에탄올에 희석하여 -20°C에서 암흑에 보관합니다. &데그; C
20X 대물렌즈Zeiss20X/0.5 Ph2 ∞/0.17
40X 대물렌즈Zeiss40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18
63X 대물Zeiss63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17
BamHINew England BiolabsR0136S
컨포칼 현미경ZeissLSM 510 META
커버 유리VWR631-0171직경 25 mm
디메틸폴리실록산시그마 알드리치DMPSV
다우 코닝 고진공 실리콘 그리스 Sigma AldrichMKBL4135V
Flaming/Brown P-97 마이크로피펫 풀러Sutter Instruments Co.P-97프로그램: 열 530, 당기기 200, 속도 80, 시간 150
형광 스테레오스코프 LeicaM205
FA Kwik-Fill Brosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Microinjection mold TU-1Adaptive Science ToolsTU-1
Microloader tipEppendorf930001007
MicroscopeZeissAxiovert 200
mMESSAGE mMACHINE KitAmbionAM1348
뉴클레아제가 없는 물InvitrogenAM9937
공압 피코 펌프세계 정밀 기기 PV820 
공압 피코 펌프워너 인스트루먼트PLI-90A
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2; cmlc2:eGFPDr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh
QIAprep Spin Miniprep KitQuiagen27106
로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트런시그마 AldrichR888110 mg/μ l 물 속의
입체 :LeicaM80
Tg(lysC:dsRed2)nz50TgBMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)
Tricaine/MS-222Sigma AldrichA5040
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-100
UltraPure Low Melting Point Agarose Invitrogen16520-050
UltraPure Phenol : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올Invitrogen15593-03125:24:1, v / v
는 렌즈

참고문헌

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Gal4 UAS4 Hydroxytamoxifen

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