프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

요약

PAD4는 펩티딜-아르기닌을 펩티딜-시트룰린으로 전환하는 효소입니다. PAD4의 조절 장애는 여러 인간 질병과 관련이 있습니다. 용이하고 처리량이 많은 호환 가능한 형광 기반 PAD4 분석에 대해 설명합니다.

초록

번역 후 변형은 많은 단백질 기질의 곁사슬에서 공유 변이를 증가시켜 단백질 기능 상태를 변화시킬 수 있습니다. 히스톤 꼬리는 모든 인간 단백질 중에서 가장 많이 변형된 스트레치 중 하나를 나타냅니다. 펩티딜-아르기닌 데이미나제 4(PAD4)는 아르기닌 잔기를 유전적으로 암호화되지 않은 시트룰린 잔기로 전환하는 것으로 나타났습니다. 현재까지 기술된 몇 가지 분석법은 만족스러운 감도로 조작적으로 용이했습니다. 따라서, 적절한 분석법의 부족은 강력한 비공유 PAD4 억제제의 부재에 기여했을 가능성이 높습니다. 본 명세서에서는 PAD4 활성을 모니터링할 수 있는 새로운 형광 기반 분석법이 설명됩니다. pro-fluorescent substrate analog는 protease trypsin의 첨가에 따른 PAD4 효소 활성을 형광 방출에 연결하도록 설계되었습니다. 이 분석법은 고처리량 스크리닝 조건과 호환되며 강력한 신호 대 잡음비를 갖는 것으로 나타났습니다. 또한, 과발현된 PAD4를 함유하는 조세포 용해물로 분석을 수행할 수도 있습니다.

서론

포유 동물 단백질의 다수 무겁게 리보솜에 의한 단백질의 생합성 다음 효소의 작용에 의해 변성된다. 이러한 번역 후 변형 (PTMS)는 크게 단백질 ^1-3 (다른 기능 사이)의 크기, 전하, 구조 및 올리고머 상태를 변경하여 프로테옴의 기능적 다양성을 증가시킬 수있다. 그 결과, 단백질 구조의 변화는 단백질 분해, 세포 분화, 시그널링, 유전자 발현의 조절, 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 같은 생리 학적 결과로 이어질 수있다. 이러한 수정은 인간의 모든 단백질의 큰 비율에 널리 퍼져 있지만 히스톤 단백질이 공유 수정 ^4의 비정상적으로 높은 숫자를 받아야에 터미널이 종료됩니다. 히스톤 단백질은 게놈 DNA의 응축을 촉진 구조 단백질의 패밀리이다. 구조화되지 않은 히스톤 꼬리의 공유 수정 세리 의해 수행 및 규제, 잔류 (작가)의 공유 변형을 촉진 같은 수정 (지우개), 역 및 변경을 구별 할 수 효소의 S는 히스톤 꼬리 (독자) ^5-7에 각인된다. 실제로, 공지 PTMS 대부분 메틸화, 인산화, 아세틸, sumoylation, 유비퀴틴 및 citrullination ⁸ 포함한 히스톤이 짧은 세그먼트 내에서 관찰 할 수있다.

Citrullination는 비

프로토콜

1. PAD4 변환, 발현, 및 정제

1. PAD4 변환의 경우, 화학적으로 유능한 E. PAD4의 GST 융합을 포함하는 플라스미드를 pGEX 변환 다음 절차를 사용하여 단백질 발현 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. 화학적 유능한 (염화 칼슘)를 준비 E. 표준 프로토콜에 따라 대장균 (BL21 (DE3)) 세포.
   1. 미리 제조 한 화학적 유능한 BL21 (DE3) 세포를 얼음에 50㎕의 해동 및 5 ㎖의 배양 관에 PAD4 유전자를 포함하는 플라스미드를 pGEX 1 μL와 혼합한다. 부드럽게 매 2 분 흔들어 섞으면 서 10 분 동안 얼음 혼합물을 품어.
   2. 열은 40 초 동안 42 ° C의 물을 용기에 혼합물을 배치하여 셀을 충격. 즉시 세포가 복구 할 수 있도록 2 분 동안 다시 얼음에 세포 플라스미드 혼합물을 배치합니다. 혼합물에 멸균 된 LB 액체 배지 1 ㎖를 추가하고 1 분 동안 얼음에 배치합니다.
   3. 1 250 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 세포 충격 열을 품어시간. 피펫 (75) 암피실린 내성 한천 접시에 형질 전환 세포의 μL, 15 시간 동안 37 ° C에서 품어. 4 ℃에서 보관 판.
2. PAD4 식입니다. ....

결과

처음에, 그것은 ZRcoum는 96- 웰 플레이트 형식으로 PAD4의 활성에보고 할 수 있음을 입증 하였다. 웰은 상기 기판과 함께 ZRcoum PAD4의 존재 / 부재 하에서 배양 하였다. 15분의 475 nm의 필터 (도 2A) - 37 ° C에서 45 분의 인큐베이션 기간 후, 형광 40분의 340로 측정 하였다. 예상 한 바와 같이, 형광 레벨은 ZRcoum (또는 시트룰린 ZRcoum) 내의 형광 낮게 유지 잠긴 상태로 남아 있었다. 용액에 과량의 트립신 / EDTA를 첨가하면, 형광 물질은 ZRcoum로부터 해방 있었지만 PAD4의 존재 하에서 거의 변하지 않았다. EDTA의 첨가로 인해 필수적인 칼슘 이온을 킬레이트 화하는 능력에 PAD4 반응의 중단을 지원하기위한 것이다. 이들 데이터로부터, 형광 출력의 5.2 배의 감소 PAD4의 .......

토론

여기서, PAD4의 활성을 모니터링하는 형광 기반 분석이 성공적으로 개발되었다. 이 분석은 여러 고처리량 조건에서 믿을 수 없을 정도로 견고한 것으로 입증되었으며 전체 세포 용해물과도 호환됩니다³⁷.

히스톤 단백질과 이를 둘러싼 DNA 가닥 사이의 친화력은 시트룰린화 시 아르기닌 측쇄의 양전하가 중화되기 때문에 느슨해집니다. 아르기닌 측쇄의 중화가 PAD4 활동을 모니터링하기 위해 유사하게 활용될 수 있다고 구상되었습니다. PAD4에 의한 아르기닌을 시트룰린으로 전환하면 트립신 매개 가수분해에 대한 감수성이 크게 감소할 것으로 예상됩니다. 트립신은 라이신과 아르기닌의 C-말단 아미드 결합을 가수분해하는 데 뚜렷한 선호도를 가지며, pH 범위 7.5에서 8.5 근처에서 최적의 활성을 보입니다. 따라서 모든 트립신 용액은 pH 7.5에서 제조되었고 모든 분석은 pH 8.0에서 수행되었습니다. 또한, 형광단 7-아미도-4-메틸쿠마린의 아르기닌 C-말단으로의 아세틸화.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)	Amresco	J106-2KG	a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (회백색 분말), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP902-25	http://www.fishersci.com
이소프로필티아갈락톤스 (IPTG)	Life Technogolies	15529-019	http://www.lifetechnologies.com
모든 완충염	Fisher Scientific		Can은 Fisher Scieintifc에서 구매할 수 있습니다. 폭스바겐; 아크로스; 시그마-알드리치; 등.
프로티노 글루타티온(GSH) 아가로스	Machery-Nagel	745500.10	4 °에 저장; C; http://www.mn-net.com/
클로로아미딘	케이맨 화학	10599	-20 °에 저장; C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell 플레이트(96 및 384)			Corning에서 구매; Sigma-Aldrich
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