마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
OP9/OP9-DL1 공동 배양 시스템은 마우스와 인간 기원의 배아 및 조혈 전구 세포에서 분화된 혈액 세포 유형을 유도하기 위한 잘 확립된 방법이 되었습니다. 현재 조혈과 관련된 점점 더 다양해지는 복잡한 유전적, 세포적, 분자적 질문을 해결하는 데 사용되고 있으며, 이러한 기본 발견을 치료 응용 분야로 전환하기 위한 노력의 최첨단에 있습니다. 절차는 간단하며 일상적으로 확실한 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 in vitro에서 성공적인 조혈 분화를 달성하려면 시약 및 세포 배양 유지 관리의 세부 사항에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 또한 이 프로토콜은 어렵지는 않지만 숙달하기 위해 주의하고 연습해야 하는 기술에 민감한 단계를 특징으로 합니다. 여기에서는 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 T 림프구를 분화하는 절차에 중점을 둡니다. 당사는 재현성 있게 강력한 in vitro 세포 분화를 가능하게 하는 중요한 단계와 매개변수에 대한 논의와 함께 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 기술은 동물 사용을 줄이고 비용을 절감하며 기본 및 중개 실험의 일정을 단축할 수 있는 잠재력이 있기 때문에 이 분야의 관심사에 부합합니다.
서론
마우스 배아 줄기 세포(mESC)를 in vitro에서 T 세포로 분화하는 세포 배양 시스템이 확립되었습니다.1 이 시스템은 T세포 분화를 촉진하기 위해 노치 신호전달의 능력을 이용합니다. 2 OP9-DL1 세포주는 골수 유래 OP9 세포3을 Notch ligand, Delta-like 1 (DL1)로 transduction하여 생성되었습니다. 4 in vitro에서 Notch 신호 캐스케이드의 활성화는 다른 세포 계통을 배제하고 T 세포 발달을 촉진합니다. 적절한 사이토카인을 포함하는 이 시스템은 조혈 및 궁극적으로 T 세포 계통을 향한 mESC의 순차적 진행을 지원하는 세포 배양 "미세환경"을 제공합니다. 이 시스템은 흉선에서 정상 T 세포 존재발생 과정에서 볼 수 있는 다양한 발달 단계에서 T 세포의 유세포 분석을 지원합니다. T 세포 발달과 관련된 선별된 질문을 조사하기 위해 이 절차는 마우스 배아 줄기 세포 유래 조혈 전구체에서 T 세포 발달을 유도하는 데 사용되는 생체 내 전체 마우스 모델5 및 체외 태아 흉선 장기 배양 방법에 대한 매력적인 대안이 되었습니다. 6 OP9 공동 배양 시스템의 주요 장점....
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프로토콜
문화 미디어, 사이토 카인 및 젤라틴 판의 1 준비
- 높은 포도당과 피루브산 나트륨과 이글의 중간 (DMEM) 둘 베코의 변형 례를 사용하여 ES 세포 매체를 준비한다. 1 % HEPES 버퍼, 1 % 비 필수 아미노산, 0.1 % 겐타 마이신 (50 ㎎ / ㎖) 및 0.1 % (태아 혈청 (FBS)를 공인 20 % ESC, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 추가 55 μM) β-머 캅토 에탄올. 여과에 의해 ES 세포를 멸균 매체.
- 제조업체의 지침에 따라 분말 알파 최소 필수 중간 (α-MEM)의 1 L함으로써 OP9 미디어를 준비합니다. 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 혼합하는 반전. 이 500 ㎖의 분취 액으로 여과하여 멸균.
참고 : 분말로 만든 미디어의 사용은 권장 개선 OP9 세포의 유지 보수 및 시험 관내 분화 결과를 얻을 가능성이있다. 이 방법은 우리의 표준 절차가되었다. 그러나, 우리는 그쪽에주의t 우리는 시간에 적절한 성공을 미리 만들어진 액체 α-MEM을 사용했다. - 90 % FBS 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 미디어를 동결 준비합니다. 부드럽게 소용돌이 여과 소독. 4 ℃에....
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결과
LIF의 존재 MEFs에 성장하면 mESCs는 미분화 상태로 유지 될 수있다. 이상적인 조건에서, 그들은 위상차 현미경에 빛나는 후광에 둘러싸인 세포의 소형 식민지 (그림 1)로 나타납니다. 이러한 문화는 매일 모니터링해야합니다. 세포의 합류에 따라 미디어가 변경 될 수 있거나 세포를 분리 할 수있다. 이웃 MESC 식민지는 서로의 접점에 와서는 안된다. 미분화 mESCs의 정상적이고 건강한 배양은 시험 관내 T 세포 분화를위한 필수적인 출발점이다. 공 배양을 시작하면, 그것은 세포가 혼잡하지 않고 완전히 합류하는 것이 좋습니다. OP9 단일 층에 세포를 파종 수확 세포의 대부분이 (오히려 피더 세포보다) MESC 그래서입니다. 합류의 주요 차이 일 0에서 차별화 할 수있는 다양한 MESC 클론 사이에서 관찰되는 경우가 TIS에 미리 부착하여 MEFs을 제거하는 가장 좋은 것입니다공동 문화 시드를위한 mESCs를 계산하기 전에 (전체 ES 세포 미디어를 사용하여 단계 3.4.3.......
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토론
OP9-DL1 공동 배양 시스템은 줄기 세포에서 혈액 세포 유형의 개발시 각종 유전자 산물의 역할을 연구하기 위해 이용되어왔다. 8,12,13 또한 유전자 조절 DNA의 기능을 연구하기위한 효과적인 모델을 입증 세포 분화 과정. 9,14 시간 및 조혈 많은 기본적인 질문을 해결 실험에서 상당한 비용 절감 효과를 얻을 수있는 전체적인 마우스 모델의 대안으로이 방법을 사용. 그러나 이러한 목적으로이 프로토콜의 적응이 절차에 사용되는 MESC 클론 사이의 잠재적 인 변동성 대해 인식이 필요합니다. 게시 된 프로토콜의 타임 라인이 평균에서 기대할 수있다, 잘 유지, 비 조작 MESC 라인. 7 또한, MESC 복제는 일반적으로 더 높은 품질의 아르와 OP9 공동 문화에 매우 견고하게 수행 키메라 생쥐의 발생으로 선택 . 한편, MESC 클론은 안정로부터 직접 나오는ectopically 통합 형질 전환 유전자를 가진 형질 전환은 평균에서 평균 이하에 이르기까지 초기 분화 효율의.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
유세포분석 전문가의 도움을 주신 Joon Kim님께 감사드립니다. 저자 연구실에서의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 SCORE 프로그램(B.D.O에 SC1-GM095402 보조금)과 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, J.C.Z.P.에 보조금)의 지원을 받고 있습니다. J.C.Z.P.는 캐나다 발달 면역학 연구 의장의 지원을 받고 있습니다. Hunter College의 생물 의학 연구 인프라는 보조금 MD007599를 통해 NIH RCMI(Research Centers in Minority Institutions) 프로그램의 일부 지원을 받습니다. 우리는 또한 보조금 C023048를 통해 Hunter College에서 줄기 세포 연구를 시작할 수 있도록 지원한 뉴욕주 줄기 세포 과학 프로그램(NYSTEM)에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| 줄기세포 인증 FBS | Gemini | 100-125 | 열 비활성화 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Corning | 30-002-CI | |
| L-알라닐 L-글루타민 | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES 완충액 | Millipore | TMS-003-C | |
| 비필수 아미노산 | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| 겐타마이신 리젠트 솔루션 (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-머캅토에탄올(55mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| 필터 유닛 | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μ m PES 멤브레인 |
| 세포 배양 등급 물 | 코닝 | 25-055-CM | |
| &알파;-MEM | 라이프 테크놀로지 | 12000-022 | 분말, 제조 권장 사항에 따라 재구성 |
| 중탄산 나트륨 | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | 개별 로트 테스트 필요 |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마 | D2650 | |
| 재조합 인간 Flt-3 리간드 | R& D 시스템 | 308-FK | |
| 재조합 쥐 IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| 0.1% 젤라틴이 함유된 Utrapure 물 | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs 미토마이신 C 처리 | Millipore | PMEF-CF | 모든 유사분열 정지된 MEFs는 |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μ m) | Fisher | 22363547 | |
| 조직 배양 접시 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml 원심분리기 튜브 | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml 원심분리기 튜브 | BD Falcon | 352070 | |
| ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 셀 스트레이너 캡 | BD 팔콘 | 352235 | 튜브 for FACS |
| ES R1 세포 | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 세포 | , 세포는 Riken Laboratory Cell Repository(일본)에서 얻을 수 있습니다. | ||
| OP9-DL1 세포 | 세포는 Zú에서 요청할 수 있습니다. &틸드; iga-Pflü CER 연구실. | ||
| FlowJo 소프트웨어 | Tree Star | FACS 데이터 분석 | |
| 유세포 분석기 | BD | FACScan, FACSCalibur 및 FACSVantage가 실험실에서 사용되었습니다 |
참고문헌
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notc....
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재인쇄 및 허가
