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방법 논문

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

10.9K 조회수

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DOI:

10.3791/52119

⸱

2014년 10월 14일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

이 논문에서

요약

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

초록

OP9/OP9-DL1 공동 배양 시스템은 마우스와 인간 기원의 배아 및 조혈 전구 세포에서 분화된 혈액 세포 유형을 유도하기 위한 잘 확립된 방법이 되었습니다. 현재 조혈과 관련된 점점 더 다양해지는 복잡한 유전적, 세포적, 분자적 질문을 해결하는 데 사용되고 있으며, 이러한 기본 발견을 치료 응용 분야로 전환하기 위한 노력의 최첨단에 있습니다. 절차는 간단하며 일상적으로 확실한 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 in vitro에서 성공적인 조혈 분화를 달성하려면 시약 및 세포 배양 유지 관리의 세부 사항에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 또한 이 프로토콜은 어렵지는 않지만 숙달하기 위해 주의하고 연습해야 하는 기술에 민감한 단계를 특징으로 합니다. 여기에서는 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 T 림프구를 분화하는 절차에 중점을 둡니다. 당사는 재현성 있게 강력한 in vitro 세포 분화를 가능하게 하는 중요한 단계와 매개변수에 대한 논의와 함께 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 기술은 동물 사용을 줄이고 비용을 절감하며 기본 및 중개 실험의 일정을 단축할 수 있는 잠재력이 있기 때문에 이 분야의 관심사에 부합합니다.

서론

마우스 배아 줄기 세포(mESC)를 in vitro에서 T 세포로 분화하는 세포 배양 시스템이 확립되었습니다.1 이 시스템은 T세포 분화를 촉진하기 위해 노치 신호전달의 능력을 이용합니다. 2 OP9-DL1 세포주는 골수 유래 OP9 세포3을 Notch ligand, Delta-like 1 (DL1)로 transduction하여 생성되었습니다. 4 in vitro에서 Notch 신호 캐스케이드의 활성화는 다른 세포 계통을 배제하고 T 세포 발달을 촉진합니다. 적절한 사이토카인을 포함하는 이 시스템은 조혈 및 궁극적으로 T 세포 계통을 향한 mESC의 순차적 진행을 지원하는 세포 배양 "미세환경"을 제공합니다. 이 시스템은 흉선에서 정상 T 세포 존재발생 과정에서 볼 수 있는 다양한 발달 단계에서 T 세포의 유세포 분석을 지원합니다. T 세포 발달과 관련된 선별된 질문을 조사하기 위해 이 절차는 마우스 배아 줄기 세포 유래 조혈 전구체에서 T 세포 발달을 유도하는 데 사용되는 생체 내 전체 마우스 모델5 및 체외 태아 흉선 장기 배양 방법에 대한 매력적인 대안이 되었습니다. 6 OP9 공동 배양 시스템의 주요 장점은 표준적이고 간단한 세포 배양 기술을 포함하고 실험 동물의 지속적인 사용에 의존하지 않는다는 것입니다.

우리는 이 접근 방식을 사용하여 실험에서 이전에 발표된 상세한 프로토콜을 따릅니다. 7 우리는 이 기술을 활용하여 조작되지 않은 mESC 클론, 키메라 배아8을 만들기 위해 직접 선별된 고품질 mESC 클론 및 약물 선택에서 직접 나오는 안정적으로 transfection된 ESC 클론의 조혈 분화 산물을 조사했습니다. 9 우리는 이 모델에서 mESC에서 중배엽 유사 콜로니로의 초기 시험관 내 분화의 시간적 동역학이 개별 클론 간에 가변적일 수 있다는 점에 주목했습니다. mESC-OP9 공동 배양은 중배엽으로의 진행을 육안으로 평가할 수 있습니다. 이 작업은 일반적으로 공동 배양 5일째까지 완료되지만, 개별 클론의 경우 하루나 이틀 정도 지연될 수 있습니다. 최적의 조혈전구세포(HPC) 형성과 강력한 림프구형성을 얻기 위해서는 이식 전에 정량적(~80-90%) 중배엽 형성이 이루어져야 합니다. 따라서 여러 mESC 클론으로 작업할 때 이 "5일차" 통로는 모든 클론이 중배엽 유사 콜로니로의 전이를 완료할 때까지 지연하는 것이 가장 좋습니다. 이것은 조혈 분화 조건으로 전달된 후 클론 간의 후속 발달의 동기화를 가능하게 합니다. 80-90% 중배엽 형성을 통과한 지 3일 후, OP9 단층에서 HPC를 수집합니다. HPC는 새로운 OP9 세포에 파종되어 단핵구, 적혈구 및 B 세포 계통을 구별할 수 있습니다. 또는 HPC를 OP9-DL1 세포에 파종하여 T 세포 발달로 유도할 수 있습니다. 모든 시험관 내 분화 배양물은 5일째부터 Flt-3L을 제공하고, IL-7은 8일째부터 추가로 제공됩니다. 실험 중 다양한 시점에서 수행된 유세포 분석을 통해 조혈 분화 및 T 세포 발달의 단계와 계통을 통한 진행 상황을 모니터링할 수 있습니다. CD4/CD8 이중 양성(DP) T 세포는 공동 배양 16일째부터 나타나기 시작하며, DP 및 CD8 단일 양성(SP) 세포는 모두 20일째까지 풍부합니다. 공동 문화의 일반적인 결과와 견고성은 발생하는 중요한 발달 전환점의 완료를 시각적으로 확인하는 능력에 크게 좌우됩니다. 이 프로토콜은 성공적인 차별화의 핵심인 이러한 이정표와 다른 중요한 매개변수를 인식하기 위한 가이드가 되는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

문화 미디어, 사이토 카인 및 젤라틴 판의 1 준비

  1. 높은 포도당과 피루브산 나트륨과 이글의 중간 (DMEM) 둘 베코의 변형 례를 사용하여 ES 세포 매체를 준비한다. 1 % HEPES 버퍼, 1 % 비 필수 아미노산, 0.1 % 겐타 마이신 (50 ㎎ / ㎖) 및 0.1 % (태아 혈청 (FBS)를 공인 20 % ESC, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % L-글루타민을 추가 55 μM) β-머 캅토 에탄올. 여과에 의해 ES 세포를 멸균 매체.
  2. 제조업체의 지침에 따라 분말 알파 최소 필수 중간 (α-MEM)의 1 L함으로써 OP9 미디어를 준비합니다. 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 혼합하는 반전. 이 500 ㎖의 분취 액으로 여과하여 멸균.
    참고 : 분말로 만든 미디어의 사용은 권장 개선 OP9 세포의 유지 보수 및 시험 관내 분화 결과를 얻을 가능성이있다. 이 방법은 우리의 표준 절차가되었다. 그러나, 우리는 그쪽에주의t 우리는 시간에 적절한 성공을 미리 만들어진 액체 α-MEM을 사용했다.
  3. 90 % FBS 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가하여 미디어를 동결 준비합니다. 부드럽게 소용돌이 여과 소독. 4 ℃에서 보관하십시오.
  4. 10 μg / ml의 완전한 OP9 미디어에서 인간 재조합 FLT-3 리간드 (FLT-3L)을 용해하여 2,000x FLT-3 리간드 (10 μg / ㎖)을 준비합니다. -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장. 안정성 및 저장에 대한 공급 업체의 권장 사항을 따르십시오.
    참고 : FLT-3L의 안정성 (4 ° C 또는 3개월 -80 ° C에서의 1 개월) 짧습니다.
  5. 전체 OP9 미디어를 사용하여 1,000 배 IL-7 (1 μg / ㎖)를 준비합니다. -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 및 저장. 안정성 및 저장에 대한 공급 업체의 권장 사항을 따르십시오 (IL-7은 -80 ° C에서 최대 12 개월 동안 안정적이다).
  6. LIF의 난의 열 일곱 단위의 1:10 희석 1,000 배 백혈병 억제 인자 (LIF) (10 μg / ㎖)를 준비N ES 세포 매체. 4 ℃에서 보관 나누어지는. 나누어지는 병에 제조업체가 제공하는 유효 기간을주의해야합니다.
    참고 : 제품이 제조 일로부터 농축 또는 희석 된 형태로 적어도 18 개월 동안 안정적이다.
  7. 젤라틴 6 - 웰 플레이트를 준비하여 6 - 웰 플레이트의 각 웰에 1.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 추가한다. 코팅에 적어도 30 분 수에 뚜껑 실온에서 멸균 후드에서 요리를 둡니다. 요리는 가습 인큐베이터 하룻밤에 남아있을 수 있습니다. 바로 세포 파종 전에 남은 젤라틴 용액을 제거합니다. 젤라틴 용액이 완전히 우물에 건조시키지 마십시오.

2 준비 및 피더 세포 및 마우스 배아 줄기 세포의 유지 보수 (MESC)

주 : 5 % CO 2 가습 37 ° C 배양기에서 모든 세포를 품어.

  1. 해동 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF)
    1. 냉동 바이알 (~ 5 × 10 6 빠른 해동 셀 / 마이 토마 이신 C 처리 (또는 다른 mitotically 체포) MEFs의 유리 병)하고 15 ML 튜브에 전송할 수 있습니다.
    2. 점차적으로 동결 매체로부터 DMSO를 희석 드롭 현명한 방식으로, 해동 세포에 ES 세포 매체의 8 ML을 추가합니다.
    3. 5 분 동안 4 ° C에서 400 X g에서 원심 분리기 세포. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 ES 세포 미디어 3 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁.
    4. 미리 예열 ES 세포의 미디어 (33)를 가하여 50 ㎖의 원심 분리 관을 준비한다. 36 ml의 최종 볼륨을 가지고 재 부유 MEFs의 3 ML을 추가합니다.
    5. 이 젤라틴 6 웰 플레이트의 각 웰에 재 부유 MEFs 3 ㎖를 배포합니다. 세포가 부착하고 그들에 mESCs 시드 전에 확산 할 수 있도록 최소 6 시간 동안 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 자신의 미디어를 2-3 일마다 변경되는 경우 이러한 mitotically 체포 피더 층은 초기 시딩 후 몇 일 동안 사용할 수있다.
      주 : 갓 체포 MEFs도 사용할 수 있습니다.
    6. 시드 mESCs
      1. 37 ° C의 물을 욕조에 얼어 붙은 MESC 클론 유리 병을 빠른 해동 2.1.1-2.1.3에 설명 된대로 세포를 준비합니다.
        참고 : 우리는 6 웰 플레이트의 합류 우물에서 MESC의 두 병을 동결.
      2. (단계 2.1.5에서 준비) 체포 MEF 단일 층과 6 - 웰 플레이트의 (MESC 클론 당) 한 우물에서 용지를 제거하고 MEF 단일 층의 상부에 mESCs의 3 ml의 씨앗. 1,000 배 LIF (10 NG / ㎖)의 3 μl를 추가합니다. 인큐베이터에 요리를 돌려줍니다.
    7. ES 세포 유지 보수 및 트립신 매개 통로
      참고 : MESC의 합류에 따라 변경 매일 미디어, 또는 분할. 최적의 수확 및 분할 / 재 판 세포 매일.
      1. ES 세포 미디어를 제거하고 PBS의 2 ㎖로 mESCs을 씻는다. PBS를 제거합니다. 0.25 % 트립신의 1 mL를 넣고 3 ~ 5 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
      2. 트립신 세포를 수집하고 15 ㎖의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 적극적 m의 덩어리를 분리시킨 세포 현탁액을 피펫ESCS. 트립신을 중화하기 위해 세포 현탁액에 완전한 ES 세포 미디어 2 ML을 추가합니다.
      3. 4 ° C에서 5 분 동안 400 X g에서 스핀 세포. 상층 액을 제거하고 3 ML의 ES 세포 미디어에서 펠렛을 재현 탁.
      4. 준비 체포 MEF 단일 층을 포함하는 6 - 웰 플레이트에서 용지를 제거합니다. 각 웰에 ES 세포의 미디어 3 ㎖ 중의 (원하는 분할 비에 기초하여) 세포 현탁액의 적절한 양을 추가하는 시드된다. 1,000 배의 LIF의 3 μl를 추가합니다. 이일에 통과 할 수있는 상태가됩니다 6 : 합류 MESC 잘 일을 분할합니다.
    8. OP9 / OP9-DL1 세포 유지
      1. OP9 세포의 유리 병을 해동 (단계를 수행 2.1.1-2.1.3 OP9 미디어를 사용)
      2. 10cm 조직 배양 접시에 7 ML의 OP9 미디어를 추가합니다. 플레이트를 통해 세포를 배포, 드롭 현명한 방식으로 재현 탁 세포의 3 ML을 추가합니다. 배양기에서 하룻밤 세포를 놓습니다.
      3. 다음날 OP9 세포의 합류를 확인합니다. 요리는 많은 죽은 부동 세포를 포함하는 경우, 레모미디어를했습니다 신선한 OP9 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 거의 완전 합류가 관찰되지 않은 경우 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 네 근처에 합류 OP9 단층 : 분할 1 (트립신을 사용하여).
        주 : 플레이트에 대한 이일에 다시 합류 동일한 수준에 도달해야한다. 오버 합류하게 OP9 세포를지지 않도록주의 해주십시오.
      4. 확장 주식으로 OP9 세포의 조기 구절을 동결.
        참고 : 우리가 합류 10cm 접시 근처에 하나에서 OP9 세포의 두 병을 동결. 확장 주식의 각각의 바이알에 대해서는 나중에 더 MESC 공동 문화 실험에 사용되는 작업 주식을 만들 전파 될 수있다. 온도 변동에 부정적인 정지의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 오히려 -80 ° C 냉동고에 비해 액체 질소에 냉동 모든 OP9의 주식을 유지합니다.

    3 OP9-DL1 공동 배양 절차

    1. 공동 배양 준비
      1. 약 일주 전에 공동 문화의 시작에, MEFs, mESCs 및 OP9 전지 작업 STO 해동CKS. OP9-DL1 세포를 공동 배양 일 8까지 필요하지 않기 때문에, 공동 문화 개시 후 처음 삼일 동안 OP9-DL1 세포를 해동. 유지 또는 필요에 따라 모든 셀을 동결.
      2. 실험 규모에 기초하여 일 0 공존 배양에서 80 % 합류점에 도달 제조 OP9 세포 단층을 가진 10cm 플레이트의 초기 수를 결정 (예 MESC 클론의 수는 차별화되는 공존 배양 시점의 개수 ) 분석. 4 일 : 공동 문화를 준비하기 위해 한 사이 OP9 세포의 합류 접시 근처에 분할 6 이일을 앞두고 단일 층이 필요합니다 때의.
        참고 : 하나는 ESC 클론 당 적어도 하나의 플레이트가 필요합니다. 5 일 경과 6 개의 판을 씨앗에 충분한 세포를 산출한다 0 일에 (아래 설명 참조) 일반적으로, ESC 단일 클론은 단일 플레이트에 시딩. 매일 5 판은 하나의 후속 분석 시점을 가능하게 할 것이다.
      3. OP9 단일 층이 지속적으로 공동 문화의 통과를 위해 필요한 것입니다 때문에,주의 항상 터 유지 보수에 걸릴공동 문화와 병렬로 추가 OP9 배양 플레이트의 적절한 수있다.
    2. 일 0 : 공동 문화의 개시
      1. 2.3.1-2.3.4에서와 같이 MESC를 수집합니다. 세포를 계산합니다.
      2. 각 MESC 클론은 접시 당 OP9 미디어 10ml에 5 × 10 4 MESC를 준비합니다.
        NOTE :. 우리가 사용되지 않았지만, 우리는 대안 매체는 α-MEM, 10 % FBS로 이루어진, 5 × 10 β-머 캅토 에탄올이 또한 분화의 공동 배양에 사용하기 위해보고되었다 -5 M 10 참고
      3. OP9 요리에서 이전 용지를 제거하고 접시에 골고루 세포를 배포 돌보는 요리에 MESC 현탁액의 10 ML을 추가합니다. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
    3. 주 3 : 미디어 변경
      1. 인큐베이터에서 요리를 제거하고 현미경으로 관찰한다. 콜로니의 광택을 잃게하고 평평하게 나타납니다 시작해야한다.
      2. 요리에서 용지를 제거하고 부드럽게 신선한 OP9 10 ㎖를 추가미디어.
      3. 인큐베이터에 공동 배양 접시를 돌려줍니다. 시각 콜로니 80-90 %의 시각적 중배엽 같은 형태를 표시 ~까지 수행되지 않아야 다음 통로 (5 일)에 대한 OP9 피더 단층 제제의 타이밍을 알리는 일일 중배엽 형 콜로니 형성을 모니터. 5 일째 세포 전사 공정의 최대 연기 2 일이다.
    4. 제 5 일 : 사전 도금 트립신 매개 통로입니다.
      참고 : 최적의 합류 OP9 세포를 사전에 10cm 요리의 적절한 수를 준비합니다. 공동 문화 시각적 단계 3.3.3에 설명 된 기능을 표시하는 경우에만 다음 단계를 진행합니다 (또한 대표 결과 참조).
      1. 공동 배양 접시에서 미디어를 꺼내십시오. 씻어 4 ml의 PBS를 추가합니다. PBS 소용돌이 및 제거합니다. 0.25 % 트립신의 4 mL를 넣고 ~ 5 분 동안 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
      2. 돌보는 것은까지 과도한 기포를 도입하지 격렬한 피펫 팅함으로써 세포를 트립신의 층을 방해균질 주로 단일 세포 현탁액을 얻을 수있다.
      3. 전체 OP9 미디어의 4 mL를 넣고 피펫으로 혼합한다. 30 분 동안 인큐베이터에서 비어있는 새 10cm 접시와 장소에 전송 세포 OP9 세포가 접시에 부착 할 수 있도록합니다. 이러한 "도금 전"단계는 공동 배양의 다음 단계로 이송 OP9 세포의 수를 감소시킨다.
      4. 40 μm의 셀 스트레이너 50 ㎖의 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
      5. 사전 도금 접시에서 비 부착 세포를 수집하고 튜브에 세포 스트레이너를 통해 전달합니다. PBS의 6 ㎖로 가볍게 요리를 세척하고 뒤에 첨부 된 OP9 세포를 떠나, 같은 여과기를 통과.
      6. 4 ° C에서 400 × g으로 5 분 원심 분리기 세포. 상층 액을 제거하고 완전한 OP9 미디어의 3 ㎖에 펠렛 세포를 재현 탁. 세포를 계산합니다.
      7. 최적의 합류 OP9 세포 10cm 플레이트에서 용지를 제거합니다.
      8. 각 분석 시점 들어 OP9 모노에 5 × 105 세포를 시드10 ㎖의 최종 부피의 층을 포함한다.
      9. 5 NG / ML 인간 재조합 FLT-3L를 추가하고 배양기에서 접시를 놓습니다.
    5. 8 일 : 조혈 전구 세포 (HPC) 컬렉션
      참고 :이 단계를위한 시간들이 될 수 있도록 사전에 OP9 또는 OP9-DL1 세포 단일 층과 6 - 웰 플레이트의 적절한 수를 준비 ~ 80 %의 합류.
      1. 40 μm의 여과기와 50 ㎖의 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
      2. 인큐베이터에서 요리를 제거하고 현미경으로 관찰한다. HPC의 반짝이 클러스터는 느슨하게 OP9 단층에 연결해야합니다. 피펫 OP9 단층과 접시에 기존 미디어를 세척 (그러나 지나치게 방해하지 않음)에 의해 가능한 한이 세포의만큼을 수집합니다. 거품을 방지하기 위해, 항상이 HPC 수집 / 세척 단계에서 피펫의 끝에서 용지의 최소 1 ml에 둡니다.
      3. 튜브에 40 μm의 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 만약 모든 HPC의 동일 판에 8 ㎖의 PBS를 추가하고 현미경으로 확인 우리다시 수집. 더 강력한 세척으로 (필요한 경우) PBS로 세척 / 수집 단계를 반복합니다. 이미 동일한 플레이트에서 세포를 함유하는 튜브에 세포 스트레인.
      4. 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기 세포.
      5. 5 NG와 OP9 미디어 (판은 5 일에 시드 당) 3 ML의 마스터 믹스를 준비 / ㎖ FLT-3L 1 NG / ml의 IL-7.
      6. FLT-3L + IL-7 마스터 믹스 OP9 미디어에서 (처리 된 각 10cm 접시 3 ml)에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다. OP9 세포와 6 웰 플레이트의 한 우물에 각 판에서 수집 된 세포를 전송합니다.
        1. , 단구, B 세포 계통 또는 적혈구 세포를 향해 이용시 OP9 세포 상에 수집 된 세포를 시드하기 위해. T 세포를 유도하기 위해, OP9-DL1 세포 단층 상에 세포를 시드.
      7. 인큐베이터에 6 - 웰 플레이트를 놓습니다.
    6. 10 일 : 미디어 변경
      1. 각각 별개 MESC 클론 피더 셀형 combina 대해 15 ml의 원심 분리 튜브를 준비공동 문화 기.
      2. FLT-3L의 5 겨 / ㎖와 IL-7의 1 겨 / ㎖로 OP9 미디어의 마스터 믹스를 준비합니다. 각 웰에 3 ML을 준비합니다.
      3. 부드럽게 같은 ESC 복제 피더 세포 유형의 조합을 포함하는 여러 우물에서 미디어를 결합 6 웰 플레이트의 각 웰에서 미디어를 수집합니다.
      4. 각 웰에 OP9 미디어 마스터 믹스 2 ㎖를 (3.6.2 참조)에 추가합니다.
      5. 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 동안 400 X g에서 수집 된 미디어. 물론 당 OP9 미디어 마스터 믹스 1 ㎖의 각 펠렛 (볼 경우 매우 작은) (3.6.2 참조) 원래 단계 3.6.3에서 수집을 상층 액을 제거하고 재현 탁.
      6. 다시 각 웰 미디어가 원래 3 ml의 각 웰에 볼륨을 가져 수집되는 세포에 1 ㎖를 배포합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
    7. 주 12 : 아니 트립신 통로
      참고 :이 초 동안 그들은 최적의 시간에 컨 플루 언트 될 수 있도록 사전에 OP9 또는 OP9-DL1 세포를 6 웰 요리의 적절한 수의 준비스탭. 날 (12)은 현상 적혈구, 단핵구, 및 초기 단계의 T 세포의 유세포 분석에 적합하다.
      1. 마스터 믹스 FLT-3L의 5 겨 / ㎖와 IL-7의 1 겨 / ㎖로 OP9 미디어 (공동 문화에 계속 각 웰 3 ㎖) 준비합니다.
      2. 40 μm의 여과기 (공동 문화의 각 ESC 복제 피더 세포 유형의 조합 일)과 50 ㎖의 원심 분리기 튜브를 준비합니다.
      3. 적극적으로 잘에 (단일 층을 포함하여) 모든 세포를 해리하는 각도에있는 기존 미디어를 피펫. 단일 세포 현탁액을 닮은 상태가 될 때까지 강력한 피펫 계속합니다.
      4. 튜브에 스트레이너를 통해 수집 된 세포를 전달합니다. 남아있는 모든 세포를 씻어 수집하기 위해 각 웰에 PBS의 3 ML을 추가합니다. 같은 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 동일한 클론 ESC 피더 세포 유형 조합을 포함하는 다수의 웰에서 세포 수확기.
      5. 사용 된 셀 스트레이너를 취소하고 잘 하나에 나누어 상당을 제거 (~ 6 ml)을 원하는에 대한(또는 다른) 유동 세포 계측법은 일에 실시되는 분석한다. 사용하기 전에 얼음이 분주을 저장합니다.
      6. 4 ° C에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리기 세포. 상층 액을 제거합니다. 물론 당 마스터 믹스의 3 ㎖에 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 펠렛을 재현 탁은 다시 시드합니다. 적절한 피더 세포 유형에 각 세포 현탁액을 잘 당 3 mL를 넣고 배양기에서 접시를 놓습니다.
    8. 주 14 : 미디어 변경
      1. 3.6 절에 설명 된 단계를 따릅니다.
    9. 주 16 : 아니 트립신 통로
      참고 :이 단계에서 사전에 최적으로 합류 OP9 또는 OP9-DL1 세포를 6 웰 요리를 준비합니다.
      참고 : 유동 세포 계측법 B 림프구 및 중간 단계의 T 세포 분석을위한 날 (16)가 이상적입니다.
      1. 3.7 절에 설명 된 단계를 따릅니다.
    10. 주 18 : 미디어 변경
      1. 3.6 절에 설명 된 단계를 따릅니다.
    11. 주 20 : 아니 트립신 통로
      주 : 일 20 전유동 세포 계측법에 대한의 이상적인는 T 세포를 개발 최종 단계에 중간 분석.
      1. 3.7 절에 설명 된 단계를 따릅니다. 원하는 경우, 세포에게 과거의 일 (20) 교류 매체의 변화를 차별화 수행하고 더 트립신은 림프구의 확장 속도를 매일 모니터링, 모든 이일 통로 없습니다.

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결과

LIF의 존재 MEFs에 성장하면 mESCs는 미분화 상태로 유지 될 수있다. 이상적인 조건에서, 그들은 위상차 현미경에 빛나는 후광에 둘러싸인 세포의 소형 식민지 (그림 1)로 나타납니다. 이러한 문화는 매일 모니터링해야합니다. 세포의 합류에 따라 미디어가 변경 될 수 있거나 세포를 분리 할 수​​있다. 이웃 MESC 식민지는 서로의 접점에 와서는 안된다. 미분화 mESCs의 정상적이고 건강한 배양은 시험 관내 T 세포 분화를위한 필수적인 출발점이다. 공 배양을 시작하면, 그것은 세포가 혼잡하지 않고 완전히 합류하는 것이 좋습니다. OP9 단일 층에 세포를 파종 수확 세포의 대부분이 (오히려 피더 세포보다) MESC 그래서입니다. 합류의 주요 차이 일 0에서 차별화 할 수있는 다양한 MESC 클론 사이에서 관찰되는 경우가 TIS에 미리 부착하여 MEFs을 제거하는 가장 좋은 것입니다공동 문화 시드를위한 mESCs를 계산하기 전에 (전체 ES 세포 미디어를 사용하여 단계 3.4.3...

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토론

OP9-DL1 공동 배양 시스템은 줄기 세포에서 혈액 세포 유형의 개발시 각종 유전자 산물의 역할을 연구하기 위해 이용되어왔다. 8,12,13 또한 유전자 조절 DNA의 기능을 연구하기위한 효과적인 모델을 입증 세포 분화 과정. 9,14 시간 및 조혈 많은 기본적인 질문을 해결 실험에서 상당한 비용 절감 효과를 얻을 수있는 전체적인 마우스 모델의 대안으로이 방법을 사용. 그러나 이러한 목적으로이 프로토콜의 적응이 절차에 사용되는 MESC 클론 사이의 잠재적 인 변동성 대해 인식이 필요합니다. 게시 된 프로토콜의 타임 라인이 평균에서 기대할 수있다, 잘 유지, 비 조작 MESC 라인. 7 또한, MESC 복제는 일반적으로 더 높은 품질의 아르와 OP9 공동 문화에 매우 견고하게 수행 키메라 생쥐의 발생으로 선택 . 한편, MESC 클론은 안정로부터 직접 나오는ectopically 통합 형질 전환 유전자를 가진 형질 전환은 평균에서 평균 이하에 이르기까지 초기 분화 효율의...

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공개 사항

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감사의 글

유세포분석 전문가의 도움을 주신 Joon Kim님께 감사드립니다. 저자 연구실에서의 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 SCORE 프로그램(B.D.O에 SC1-GM095402 보조금)과 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, J.C.Z.P.에 보조금)의 지원을 받고 있습니다. J.C.Z.P.는 캐나다 발달 면역학 연구 의장의 지원을 받고 있습니다. Hunter College의 생물 의학 연구 인프라는 보조금 MD007599를 통해 NIH RCMI(Research Centers in Minority Institutions) 프로그램의 일부 지원을 받습니다. 우리는 또한 보조금 C023048를 통해 Hunter College에서 줄기 세포 연구를 시작할 수 있도록 지원한 뉴욕주 줄기 세포 과학 프로그램(NYSTEM)에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMCorning15-013-CV
줄기세포 인증 FBSGemini100-125열 비활성화
페니실린/스트렙토마이신Corning30-002-CI
L-알라닐 L-글루타민Corning25-015-CI
HEPES 완충액 MilliporeTMS-003-C
비필수 아미노산ThermoScientificSH30853.01
겐타마이신 리젠트 솔루션 (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-머캅토에탄올(55mM) in DPBSLife Technologies 21985-023
필터 유닛MilliporeSCGPU05RE0.22 μ m PES 멤브레인
세포 배양 등급 물코닝25-055-CM
&알파;-MEM 라이프 테크놀로지 12000-022분말, 제조 권장 사항에 따라 재구성
중탄산 나트륨 SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03개별 로트 테스트 필요 
디메틸 설폭사이드 시그마D2650
재조합 인간 Flt-3 리간드R& D 시스템308-FK
재조합 쥐 IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
0.1% 젤라틴이 함유된 Utrapure 물MilliporeES-006-B
MEFs 미토마이신 C 처리MilliporePMEF-CF모든 유사분열 정지된 MEFs는
DPBSCorning21-031-CV
Cell strainer (40 μ m)Fisher22363547
조직 배양 접시 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-wellBD Falcon353046
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브USA Scientific1615-5500
15 ml 원심분리기 튜브BD Falcon352096
50 ml 원심분리기 튜브BD Falcon352070
ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브 셀 스트레이너 캡BD 팔콘352235튜브 for FACS 
ES R1 세포ATCCSCRC-1011
OP9 세포, 세포는 Riken Laboratory Cell Repository(일본)에서 얻을 수 있습니다.
OP9-DL1 세포       세포는 Zú에서 요청할 수 있습니다. &틸드; iga-Pflü CER 연구실.
FlowJo 소프트웨어 Tree StarFACS 데이터 분석
유세포 분석기BDFACScan, FACSCalibur 및 FACSVantage가 실험실에서 사용되었습니다
5 , , , , , , .

참고문헌

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

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