두 가지 유세포 분석 기반 방법인 체외 T 세포 프라이밍 분석 및 세포 내 사이토카인 염색을 사용하여 수지상 세포의 항원 제시 능력과 마우스의 웨스트 나일 바이러스 돌연변이 감염에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 측정했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
마우스에서 야생형보다 높게 WNV 타고난 사이토킨 및 T 세포 반응을 유도 감쇠 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 비 구조적 (NS) 4B-P38G 변이체. 최근 골수 분화 인자 88 (에서 MyD88) 시그널링 WNV NS4B-P38G 돌연변이 감염시 초기 T 세포 프라이밍 및 메모리 T 세포의 발달에 중요한 것으로 나타났다. 본 연구에서 두 계측법 기반의 방법을 흐름 - 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석 및 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)는 - 수지상 세포 및 T 세포의 기능을 평가하기 위해 사용 하였다. OTII 트랜스 제닉 마우스의 CD4 + T 세포를 표지 - 분석 프라이밍 T 세포에서 세포 증식은 카르복시 플루오 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)으로 두 군의 쥐들로부터 수지상 세포의 공동 배양에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 보다 크게 전통 전체적인 감도를 개선하여 이러한 접근법은 CD4 + T 세포 증식의 비율의 정확한 결정을 제공알 방사성 시약 분석. microcentrifuge 관 시스템은 ICS 프로토콜 모두 세포 배양 및 사이토킨 염색 절차에서 사용 하였다. 기존의 조직 배양 플레이트 기반 시스템에 비해,이 수정 절차는 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 수행 쉬웠다. 또한, WNV- 감염된 세포는 BL3 시설 외부의 추가 분석을 가능 모두 분석에 파라 포름 알데히드로 처리 하였다. 전반적으로, 이러한 시험 관내 면역 분석법 효율적 WNV 감염시 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다.
서론
웨스트 나일 바이러스 (WNV), 신경성, 플러스 감지 플라 비 바이러스, 신흥 보건 위협이다. 현재, 백신은 인간의 사용 (1) 승인되지 않았다. 비 구조 (NS) (b) 단백질의 P38G 대체가 감쇠 웨스트 나일 바이러스 균주, 야생형 WNV NY99 변형이보다 마우스에는 마우스의 치사하지만 높은 타고난 사이토 카인 및 T 세포 반응을 유도하지 알려져있다. NS4B-P38G 돌연변이로 면역화 마우스는 모든 치명적인 야생형 웨스트 나일 바이러스와 보조 도전으로부터 보호했다. 이 NS4B-P38G 돌연변이 이상적인 백신 후보에 적합한 기능을 가지고 있음을 시사한다. NS4B-P38G 돌연변이가 높은 보호 후천성 면역을 유도하는 메커니즘은 명확하게 아직 이해되지 않습니다. 병원체 관련 분자 패턴을 인식 수신자 같은 수용체 (TLR에)는, 바이러스 감염에 대한 선천성 면역의 개시에 필수적인 역할을한다. 코어 TLR 신호 전달 경로가 골수 분화 일차 응답 GE를 이용기본 어댑터 3,4로 북동 88 (에서 MyD88). 최근 연구에서, 시그널링에서 MyD88 쥐 5 NS4B- P38G WNV 감염 중에 돌연변이 세포 성 면역의 개발에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 수지상 세포 (DCS)는 바이러스 감염시 ....
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프로토콜
모든 동물 실험은 의학 분지 택사스 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
감염 - 비와 웨스트 나일 바이러스에 감염된 마우스에서의 DC 1. 분리
- 나이와, 성별 일치 6-10주 된 야생형 C57BL / 6 (B6)과에서 MyD88 - / - 마우스. 복강 (IP) WNV NS4B- P38G 돌연변이의 500 플라크 형성 단위 (PFU) 접종. - / - CO 2와 마우스 3 일 후 감염에, B6과에서 MyD88를 안락사. 컨트롤과 같은 두 그룹의 감염되지 않은 마우스를 사용합니다. 각 그룹에서 세 마우스를 사용합니다.
- 젖은 70 % 에탄올을 사용하여 희생 마우스의 왼쪽 및 모피는 전방 및 후방 다리 사이의 중간에 대해, 마우스 왼쪽의 털을 절단. 체강을 오픈. 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. RPMI와 페트리 접시에서 비장를 놓습니다.
- 항에있어서 CD11c 양성 자성 비드를 사용하여 비장의 수지상 세포를 분리제조업체의 지침.
2. 정제 OTII 제닉 마우스의 T 세포의 라벨링
- 순진한 OTII 마우스에서 수확 한 비장은 위의 단계 1.2에
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결과
- / - OVA 펩티드의 존재 또는 부재 쥐 T 세포 프라이밍 분석에서, CFSE 표지 된 CD4 + T 세포는 NS4B-P38G 감염된 변이체 야생형에서 MyD88 정제 수지상에서 배양 하였다. 오일은 음성 대조군으로 사용 하였다 표지 T 세포 또는 OVA없이 단독으로 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 총 T 세포 FL1 채널상의 형광 강도의 분석을 위해 게이팅 하였다. 마커는 수지상 세포를 공동 배양없이 증식 속도를 결정하기 위해 제 0 일에 신선하게 표지 된 CD4 + T 세포에 기초하여 설정 하였다. 이 배양 조건 하에서 증식 속도 (1.6 %)의 낮은 수준이 있었다. : 1의 비율로 동일한 마커 (10)와 DCS의 공 배양 CD4 + T 세포의 증식 속도를 측정 하였다. 인해 공동 배양 높은 비율 및 증식 성질, T 세포는 추가 표현형 스테인레스없이 혼합 집단에 게이팅 될 수있다닝.
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토론
웨스트 나일 바이러스는 BL3 병원체이다. 때문에 안전 규정, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 샘플 면역 학적 분석은 종종 BL3 시설이나 수행이 더 길고 지루한에서 장비의 가용성에 의해 제한됩니다. 최근의 연구에서 우리는 웨스트 나일 바이러스 감염 5시 세포 매개 면역 반응을 연구하기 위해 두 개의 흐름 세포 계측법 기반의 방법을 사용했다. 모두 분석에서, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 세포는 1 ~ 2 % PFA 직접 또는 4 % PFA를 포함하는 고정 / 투과성으로 용액으로 처리 하였다. 이 바이러스에 감염된 세포의 1 % PFA 고정 효율적으로 검출 한계 이하 12 감염성 입자의 수를 감소시킬 수 있다고 알려져있다. 따라서, 두 가지 방법이 크게 BL3 시설 내부 성능 시간을 단축했다. BrdU의 또는 방사성 티미 딘의 혼입을 통해 포함한 T 세포 증식을 측정하는 많은 확립 분석법이 있는데, 흐름 CFSE는 MOR를 제공 한 OTII T 세포를 표지하여 시험 관내 T.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 연구는 T.W.(R01AI072060 및 R01AI099123)에 대한 NIH 보조금의 지원을 받았습니다. G. Xie는 Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. MyD88–/– 마우스를 제공해 주신 Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven)과 Dr. Shizuo Akira(일본 오사카 대학)에게, OTII 형질전환 마우스를 제공해 주신 Dr. Y Cong (UTMB, Galveston)에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | 37°C에서 예열; C |
| anti-CD11c 마그네틱 비드 | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | 제조사 따름 s 지침 |
| CD4 방지 마그네틱 비드 | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | 제조업체를 따르십시오. s 지침 |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA 잔류물 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| 펩타이드 | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A 솔루션 | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e-Bioscience | 11-0081-82 | |
| 고정/투과화 용액 | BD-Bioscience | 554722 | |
| 투과화/세척 완충액 | BD-Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNγ-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri 유세포 분석기 | BD 생명 |
참고문헌
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R.
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