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방법 논문

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

7.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52121

⸱

2014년 11월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology & Immunology, The University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, The University of Texas Medical Branch, 3Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, Sealy Center for Vaccine Development, The University of Texas Medical Branch

이 논문에서

요약

두 가지 유세포 분석 기반 방법인 체외 T 세포 프라이밍 분석 및 세포 내 사이토카인 염색을 사용하여 수지상 세포의 항원 제시 능력과 마우스의 웨스트 나일 바이러스 돌연변이 감염에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 측정했습니다.

초록

마우스에서 야생형보다 높게 WNV 타고난 사이토킨 및 T 세포 반응을 유도 감쇠 웨스트 나일 바이러스 (WNV), 비 구조적 (NS) 4B-P38G 변이체. 최근 골수 분화 인자 88 (에서 MyD88) 시그널링 WNV NS4B-P38G 돌연변이 감염시 초기 T 세포 프라이밍 및 메모리 T 세포의 발달에 중요한 것으로 나타났다. 본 연구에서 두 계측법 기반의 방법을 흐름 - 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석 ​​및 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)는 - 수지상 세포 및 T 세포의 기능을 평가하기 위해 사용 하였다. OTII 트랜스 제닉 마우스의 CD4 + T 세포를 표지 - 분석 프라이밍 T 세포에서 세포 증식은 카르복시 플루오 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)으로 두 군의 쥐들로부터 수지상 세포의 공동 배양에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 보다 크게 전통 전체적인 감도를 개선하여 이러한 접근법은 CD4 + T 세포 증식의 비율의 정확한 결정을 제공알 방사성 시약 분석. microcentrifuge 관 시스템은 ICS 프로토콜 모두 세포 배양 및 사이토킨 염색 절차에서 사용 하였다. 기존의 조직 배양 플레이트 기반 시스템에 비해,이 수정 절차는 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 수행 쉬웠다. 또한, WNV- 감염된 세포는 BL3 시설 외부의 추가 분석을 가능 모두 분석에 파라 포름 알데히드로 처리 하였다. 전반적으로, 이러한 시험 관내 면역 분석법 효율적 WNV 감염시 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다.

서론

웨스트 나일 바이러스 (WNV), 신경성, 플러스 감지 플라 비 바이러스, 신흥 보건 위협이다. 현재, 백신은 인간의 사용 (1) 승인되지 않았다. 비 구조 (NS) (b) 단백질의 P38G 대체가 감쇠 웨스트 나일 바이러스 균주, 야생형 WNV NY99 변형이보다 마우스에는 마우스의 치사하지만 높은 타고난 사이토 카인 및 T 세포 반응을 유도하지 알려져있다. NS4B-P38G 돌연변이로 면역화 마우스는 모든 치명적인 야생형 웨스트 나일 바이러스와 보조 도전으로부터 보호했다. 이 NS4B-P38G 돌연변이 이상적인 백신 후보에 적합한 기능을 가지고 있음을 시사한다. NS4B-P38G 돌연변이가 높은 보호 후천성 면역을 유도하는 메커니즘은 명확하게 아직 이해되지 않습니다. 병원체 관련 분자 패턴을 인식 수신자 같은 수용체 (TLR에)는, 바이러스 감염에 대한 선천성 면역의 개시에 필수적인 역할을한다. 코어 TLR 신호 전달 경로가 골수 분화 일차 응답 GE를 이용기본 어댑터 3,4로 북동 88 (에서 MyD88). 최근 연구에서, 시그널링에서 MyD88 쥐 5 NS4B- P38G WNV 감염 중에 돌연변이 세포 성 면역의 개발에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 수지상 세포 (DCS)는 바이러스 감염시 -6,7- 차 T 세포 반응을 개시하는 독특한 능력을 나타내는 중요한 항원 제시 세포의 하나이다. CD4 + 및 CD8 + T 세포는 오랫동안 지속 면역 보호에 기여 야생형 WNV 감염 8,9 다음 숙주의 생존에 중요한 두. 두 면역 분석법 NS4B-P38G 돌연변이 감염된 마우스에서 이들 세포의 기능을 평가하기 위해 본 연구에 사용 하였다.

- / - 생쥐 먼저, 시험 관내 T 세포 프라이밍 분석법 WNV 감염 야생형에서 MyD88의 수지상 세포의 항원 제시 능력을 비교하기 위해 사용 하였다. 분석, 순진한 CD4 <의 감도를 높이려면CFSE (WNV 감염 마우스의 339 수지상 정제하고, 카르복시 숙신 부활절 공 배양 - SUP> + T 세포를 323 (OVA) 펩티드 닭 오브 알부민 대 Vα2 / Vβ5 TCR의 구체적인 표현 OTII 트랜스 제닉 마우스로부터 단리 하였다 OVA 펩티드의 존재 하에서) 표지 된 CD4 + T 세포. 공동 배양 5 일 후에, 세포를 수확하고, 파라 포름 알데히드 (PFA)로 고정하고 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 증식 분석은 전통적으로, 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 삼중 또는 티민 deoxyriboside (3 HTdr) (10)의 혼입을 통해 이루어지고있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분석은 방사성 및 / 또는 웨스트 나일 바이러스 연구가 진행되어 바이오 안전성 레벨 (BL) 3 시설에서 특수 장비를 필요로 하나 있습니다. CFSE가 더 일반적으로되어 면역 학적 검정에 매우 중요 사용한 염료의 형광 강도 반감 의한 일련의 림프구 증식 유세포 분석은 염료보다 안정적이기균등하게, 세포 내로 혼입 유동 세포 계측법에 의해 검출이 용이하고, 방사능이 11이다. 분석은 또한 세포 분열 횟수를 평가하는 기능을 갖는다. WNV 연구에서이 분석을 이용하여 하나의 큰 장점은 1 ~ 2 % PFA로 감염된 세포의 정착이 BL2 실험실에서 유세포 샘플 획득을 가능하게 WNV 12 비활성화 할 수 있다는 것이다.

다음에, 개질 된 세포 내 사이토 카인 염색 (ICS)가 절차에서 MyD88 NS4B-P38G 변이체 감염된 마우스에서 WNV 특정 T 세포 반응의 조절에 시그널링의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 이 분석에서, 감염된 마우스 비장 세포로부터 단리 WNV 특정 펩타이드 체외에서 처리 하였다. Brefeldin는 셀 내 사이토 카인을 유지하기 위해 첨가 하였다. 5 시간 배양 한 후, 세포를 수확하여 세척하고, T 세포의 서브 세트에 대해 염색 하였다. 이어서 세포, PFA 고정 투과 가능 인터페론 (IFN) -γ 스테인드 유세포 분석 하였다.세포를 고정 및 PFA를 포함하는 투과성으로 완충액으로 처리하면 다른 유동 세포 계측법 기반 분석과 마찬가지로, 감염된 샘플 추가 처리 및 분석을 위해 BL2 실험실로 전달 될 수있다. 여러 발표 된 연구에서, 우리는 웨스트 나일 바이러스에 감염된 쥐 13, 14에서 T 세포의 이펙터 기능을 측정하는 ICS를 사용했다. 이 잘 설립을했지만,이 분석의 한 가지 큰 단점은 절차가 매우 긴이며, BL3 시설 내에서 수행 할 때 소요되는 시간이 될 수 있다는 것입니다. 여기서, 마이크로 원심 분리 튜브 기반 ICS 방법보다, 실현 가능한 쉽게 진행하고 시간이 적게 BL3 실험실 내에서 수행 할 때 소요되는 것으로 나타났다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 의학 분지 택사스 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

감염 - 비와 웨스트 나일 바이러스에 감염된 마우스에서의 DC 1. 분리

  1. 나이와, 성별 일치 6-10주 된 야생형 C57BL / 6 (B6)과에서 MyD88 - / - 마우스. 복강 (IP) WNV NS4B- P38G 돌연변이의 500 플라크 형성 단위 (PFU) 접종. - / - CO 2와 마우스 3 일 후 감염에, B6과에서 MyD88를 안락사. 컨트롤과 같은 두 그룹의 감염되지 않은 마우스를 사용합니다. 각 그룹에서 세 마우스를 사용합니다.
  2. 젖은 70 % 에탄올을 사용하여 희생 마우스의 왼쪽 및 모피는 전방 및 후방 다리 사이의 중간에 대해, 마우스 왼쪽의 털을 절단. 체강을 오픈. 집게를 사용하여 비장을 제거합니다. RPMI와 페트리 접시에서 비장를 놓습니다.
  3. 항에있어서 CD11c 양성 자성 비드를 사용하여 비장의 수지상 세포를 분리제조업체의 지침.

2. 정제 OTII 제닉 마우스의 T 세포의 라벨링

  1. 순진한 OTII 마우스에서 수확 한 비장은 위의 단계 1.2에 설명 된 두 개의 슬라이드의 프로스트 끝 사이의 비장을 균질화있다. 14 ml의 RPMI 매체를 추가, 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 서스펜션은 5 분 동안 앉아서 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 13 ml의 전송 보자.
  2. 제조업체의 지시에 따라 CD4 + T 세포 단리 키트를 사용하여 비장 CD4 + T 세포를 분리.
  3. 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 전송 세포는 PBS로 두 번 세척 하였다. 재현 탁 된 1 ㎖ 당 1 × 106 세포를 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 PBS에서 세포 및 CFSE가 0.5 μmol / ㎖를 추가한다. 빛으로부터 보호 된 10 분, 37 ℃에서 배양한다.
  4. 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청 5 ml의 차가운 완전 배지 (RPMI-1640을 추가, 1/100 권항생제 / antimycotics, 1/100 권 L- 글루타민 및 1000 X 2- 머 캅토 에탄올의 1 / 1,000 권).
  5. 5 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 세척 된 세포는 PBS로 1 회, 2 % PFA로 0.2 × 10 6 표지 CD4 + T 세포를 고정하고 유세포에 취득. CFSE의 기초 수준을 결정하기 위해이 샘플을 사용하십시오. 완전 배지에서 표지화 된 세포의 나머지를 다시 일시.

웨스트 나일 바이러스에 감염된 쥐의 수지상 3. 공동 문화 OTII T 세포

  1. 문화 2 × 10 OTII 마우스의 5 정제 CD4 + T 세포 단독으로 또는 야생형 또는에서 MyD88의 정제 DC가와 - / - 또는 OVA 잔류 323-339없이 24 웰 플레이트에 마우스 (2 × 10 4) (1g 웰 당 1ml의 완전 배지에서 / ㎖).
  2. 5 일간 37 ℃에서 세포를 배양한다. 수확 세포는, (1 % FBS와 PBS) FACS 버퍼에 두 번 씻고 0.25 ml의 2 % PFA에 고정합니다. 소용돌이 즉시.

체외 4. 유동 세포 계측법 분석 </ EM> T 세포 프라이밍

  1. 인수를 들어, 이중 소프트웨어 아이콘 유동 세포 계측법을 클릭합니다. SSC-A에 20 만 FSC-A에 20 만 0 선형 FSC-A 대 선형 SSC-A의 밀도 플롯, 선택 채널 0하십시오. (; 그림 1A 참조 P2) 다음에 살아있는 세포에 게이트를 만들 수 있습니다.
  2. CFSE의 형광 강도를 분석하기 위해, FL1 채널에 대한 히스토그램을 열고 게이트 인구에 20,000 이벤트를 취득. 단독 배양 (그림 1A) OTII의 세포 샘플에 마커를 설정합니다.
  3. 야생형 수지상 세포 (도 1B)에서 MyD88 또는 함께 공 배양 OTII 셀들에 대한 샘플들을 획득 - / - 수지상 세포 (도 1C)을 유사한 방식.

5. 분리 및 사이토 카인 분석 실험에 대한 비장 세포의 자극

  1. STE에 기술 된 바와 같은 절차를 이용 WNV NS4B-P38G 돌연변이 생쥐 - / - B6 및 감염에서 MyD88P 1.1. 하루 30 후 감염에 다시 도전 일 8 차 감염 다음 21 이후 주 웨스트 나일 바이러스 감염이나 4 일에에서 야생형 웨스트 나일 바이러스 균주의 IP 2000 PFU와 생존 마우스는 비장의 수집을 위해 CO 2와 쥐를 안락사 .
    참고 : 우리는 각 시점에 대한 그룹 당 2 ~ 3 마우스를 사용했다.
  2. 단계 1.2 단계 2.2에서 상술 한 바와 같이 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 만들기. 혈구 및 사용하여 세포 개수 10 ml의 완전한 매체에서 그들을 다시를 일시 중지합니다.
  3. 2.5 × 106 세포 / ml로 완전 배지로 세포를 희석. 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 비장 세포의 1 ML을 추가합니다.
  4. DMSO에 1 ㎎ / ㎖로 WNV 특정 NS4B 및 E 펩티드 (SSVWNATTA 및 IALTFLAV)를, CD8 + T 세포를 시뮬레이션 희석. CD4 + T 세포의 자극, DMSO에 1 ㎎ / ㎖로 WNV 특정 NS3 및 E 펩티드 (RRWCFDGPRTNTILE 및 PVGRLVTVNPFVSVA)을 희석. followe 세포에 펩티드의 10 μl를 추가Brefeldin 용액 1 μL에 의해 개발. 컨트롤과 같은 펩타이드 처리없이 세포를 사용합니다. 세포를 섞는다.
  5. 튜브의 뚜껑에 18 G 바늘 두 개의 구멍을 뚫습니다. 5 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어.

6. 세포 내 사이토 카인 염색법

  1. 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브에 세포를 전송합니다. 300-400 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀과 상층 액을 붓는다. 300-400 XG에 1 ml의 FACS 버퍼, 스핀 5 분을 추가하고 120 μL FACS 버퍼를 피펫으로 세포를 일시 중지 다시.
  2. 2 μL의 Fc 차단제를 추가하고 실온에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 각각의 튜브에 1 ㎖의 FACS 버퍼를 추가합니다. 스핀 (300)에서 5 분 - 400 × g으로.
  3. 300 μL FACS 세포를 일시 중지 다시 버퍼와 세 개의 튜브 (튜브 당 약 0.8 × 10 6 세포)로 분할. 표 1에 나타낸 바와 같이, 쥐의 IgG-PE 염색 각 배양 조건의 제 1 튜브를 보유. 제 2 튜브의 경우, CD4의 안티 - CD4 APC의 3 μl를 추가 펩타이드를 처리 한 세포, 3 μCD8 펩타이드 처리 된 세포 또는 펩티드를 처리하지 않고 세포에 모두 항체 안티 CD8 FITC의 리터. 보상 염색에 대한 세 번째 튜브를 사용합니다. 각각의 배양 조건, APC - 복합 CD4, FITC - 복합 CD8 또는 FL1, FL2 및 FL4 채널에 대한 보상 컨트롤 등의 단독 PE- 표지 CD3 항체 (튜브 당 3 μL)로 염색 된 세포의 세 개의 튜브를 사용합니다.
  4. 잠시 소용돌이 세포. 20 분 동안 얼음에두고 빛으로부터 보호합니다. 1.4 ml의 FACS 버퍼를 추가합니다. 300-400 XG에서 5 분 스핀과 상층 액을 붓는다.
  5. 세포 펠릿 (또는 간단하게 소용돌이를) 혼란을 선동. 250 μL 고정 / 투과성으로의 solutionby 피펫의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하고 빛으로부터 보호한다.
  6. 1.2 ml의 FACS 버퍼를 추가합니다. 300 μL FACS 버퍼에 300 ~ 400 XG 및 재현 탁 세포에서 스핀 5 분.
    주 :이 시점에서, 세포는 각각 U 광으로부터 추가 처리 BL2 실험실로 전송하거나 저장하고 냉장고에서 보호 될 수있다삼일에 페이지.
  7. 500 μL FACS 버퍼를 추가합니다. 스핀 1X 투과성으로 / 세척 버퍼 500 μL에 300 ~ 400 XG 및 재현 탁 세포에서 5 분. 스핀 300 ~ 400 X g에서 5 분.
  8. 이전에 예약 된 튜브의 단계 6.3 및 3.5 ㎕를 쥐의 IgG-PE에서 CD4에 대한 항체 및 / 또는 CD8 T 세포 마커로 추가 된 튜브에 3.5 μL 안티 IFNγ-PE를 추가, 100 μL 1X 파마 / 워시 세포를 다시 일시 중지 얼음에 25 분 동안의 IgG 제어를 빛으로부터 보호합니다. 1 배 투과성으로 / 세척 버퍼의 1.4 ml를 추가하여 세포를 씻으십시오. 스핀 300 ~ 400 X g에서 5 분. 1.4 ㎖의 1X 투과성으로 / 세척 완충액을 첨가하여 세정 공정을 반복한다.
  9. 300-400 XG에서 5 분 스핀과 상층 액을 가만히 따르다. FACS 버퍼의 1.4 ml의 추가 및 최종 획득을위한 FACS 버퍼 400 μL에 re-중단에 의해 세포를 씻으십시오.

세포 내 사이토 카인 염색 7. 유동 세포 계측법 분석

  1. 단계 4.1에서와 동일한 인수 설정을 사용한다. 크레아TE 생균에 게이트 (P2는도 2a 참조). 각 그룹에 대한 보상 튜브를 사용하여 전압을 조정합니다.
  2. 오픈 두 가지 새로운 점 플롯, 하나는 대 FL1을 위해 수집 된 데이터를 표시합니다. FL2 (CD8 VS. IFN-γ) 및 다른 하나는 VS FL4 위해 수집 된 데이터를 표시하는 것이다. FL2 (CD4 대. IFN-γ). 각 샘플의 문이 인구 5 만 이벤트를 취득.

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결과

- / - OVA 펩티드의 존재 또는 부재 쥐 T 세포 프라이밍 분석에서, CFSE 표지 된 CD4 + T 세포는 NS4B-P38G 감염된 변이체 야생형에서 MyD88 정제 수지상에서 배양 하였다. 오일은 음성 대조군으로 사용 하였다 표지 T 세포 또는 OVA없이 단독으로 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 총 T 세포 FL1 채널상의 형광 강도의 분석을 위해 게이팅 하였다. 마커는 수지상 세포를 공동 배양없이 증식 속도를 결정하기 위해 제 0 일에 신선하게 표지 된 CD4 + T 세포에 기초하여 설정 하였다. 이 배양 조건 하에서 증식 속도 (1.6 %)의 낮은 수준이 있었다. : 1의 비율로 동일한 마커 (10)와 DCS의 공 배양 CD4 + T 세포의 증식 속도를 측정 하였다. 인해 공동 배양 높은 비율 및 증식 성질, T 세포는 추가 표현형 스테인레스없이 혼합 집단에 게이팅 될 수있다닝.

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토론

웨스트 나일 바이러스는 BL3 병원체이다. 때문에 안전 규정, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 샘플 면역 학적 분석은 종종 BL3 시설이나 수행이 더 길고 지루한에서 장비의 가용성에 의해 제한됩니다. 최근의 연구에서 우리는 웨스트 나일 바이러스 감염 5시 세포 매개 면역 반응을 연구하기 위해 두 개의 흐름 세포 계측법 기반의 방법을 사용했다. 모두 분석에서, 웨스트 나일 바이러스에 감염된 세포는 1 ~ 2 % PFA 직접 또는 4 % PFA를 포함하는 고정 / 투과성으로 용액으로 처리 하였다. 이 바이러스에 감염된 세포의 1 % PFA 고정 효율적으로 검출 한계 이하 12 감염성 입자의 수를 감소시킬 수 있다고 알려져있다. 따라서, 두 가지 방법이 크게 BL3 시설 내부 성능 시간을 단축했다. BrdU의 또는 방사성 티미 딘의 혼입을 통해 포함한 T 세포 증식을 측정하는 많은 확립 분석법이 있는데, 흐름 CFSE는 MOR를 제공 한 OTII T 세포를 표지하여 시험 관내 T...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

이 연구는 T.W.(R01AI072060 및 R01AI099123)에 대한 NIH 보조금의 지원을 받았습니다. G. Xie는 Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship의 지원을 받았습니다. MyD88–/– 마우스를 제공해 주신 Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven)과 Dr. Shizuo Akira(일본 오사카 대학)에게, OTII 형질전환 마우스를 제공해 주신 Dr. Y Cong (UTMB, Galveston)에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 1640Invitrogen1187537°C에서 예열; C
anti-CD11c 마그네틱 비드Miltenyi Biotec130-052-001제조사 따름 s 지침
CD4 방지 마그네틱 비드Miltenyi Biotec130-095-248제조업체를 따르십시오. s 지침
CFSEInvitrogenC34554
OVA 잔류물 323-339Genscript CorporationRP10610
펩타이드ProimmunePC0AD-D
Brefeldin A 솔루션BD Bioscience555029
Mouse Fc Blockere-Bioscience14-0161-85
APC-conjugated CD4e-Bioscience17-0041-81
FITC-conjugated CD8e-Bioscience11-0081-82
고정/투과화 용액BD-Bioscience554722
투과화/세척 완충액BD-Bioscience554723
anti-IFNγ-PEe-Bioscience12-7311-82
Accuri 유세포 분석기BD 생명
은

참고문헌

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