이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

13.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52139

⸱

2015년 1월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

초록

Discs large (Dlg)는 막과 관련된 guanylate kinase family의 보존 구성원이며 Drosophila의 유충 신경근 접합부 (NMJ)에서 주요 골격 단백질 역할을합니다. 이전 연구에서는 유충 NMJ에서 Dlg의 시냅스후 분포가 포유류 유류의 상동체인 Hu-li tai shao(Hts)의 분포와 겹친다는 것을 보여주었습니다. 또한, Dlg와 Hts는 전체 성체 파리 용해물을 포함하는 공동 면역침전 실험을 기반으로 서로 복합체를 형성하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나 이러한 실험의 특성으로 인해 이 복합체가 유충 발달 중 NMJ에 특이적으로 존재하는지 여부는 알 수 없었습니다.

Proximity Ligation Assay(PLA)는 현장에서 단백질-단백질 상호 작용을 감지할 수 있는 세포 및 조직 배양에 주로 사용되는 최근에 개발된 기술입니다. 이 분석에서 샘플은 표준 면역조직화학 절차를 사용하여 관심 있는 두 단백질에 대한 1차 항체와 함께 배양됩니다. 그런 다음 1차 항체는 PLA 프로브라고 하는 특별히 설계된 올리고뉴클레오티드 접합 2차 항체 쌍으로 검출되며, 이 항체는 두 프로브가 서로 근접하게 결합된 경우에만 신호를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 복합체에 있는 단백질을 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 PLA를 사용하여 초파리 유충 NMJ에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 유충 체벽 근육 준비에 대해 수행되어 Dlg와 Hts 사이의 복합체가 NMJ의 시냅스후 영역에 실제로 존재한다는 것을 보여줍니다.

서론

큰 초파리 디스크 (굴림)은 세포막의 특정 사이트에서 큰 단백질 복합체의 조립을 조율 도움이 단백질 비계의 막 관련 구 아닐 키나제 가족의 보존 회원입니다. 종양 억제 단백질, 굴림은 상피 apicobasal 극성 1,2,3를 결정하는 중요한 역할로 원래 확인했다. 굴림 또한 유생 4시 글루타메이트 운동 신경의 신경 근육 접합 (NMJ)에서 중요한 발판 모듈 역할을한다. DLG는 애벌레 NMJ에서 다양한 역할을 수행하고, 그 pleiotropism 여러 단백질 5,6와 연결하는 능력에 의존한다. 하나는 이러한 단백질은 후진타오 - 리 타이 샤오 (HTS), 주로 7 골격 액틴 스펙 트린을 조절하는 역할에 관해서 설명 된 포유류 adducins에 상동입니다. 이것은 이전과 굴림 HTS 시험관에 기초하여 서로 착체를 형성 할 수 있음을 보여왔다 전체 성인 플라이 해물 (8)을 포함하는 공동 면역 침전 실험. 이러한 결과의 단점 중 하나는, 그러나, 그들이 어디에이 복잡한 형태를 나타내지 않는다는 것이다. 면역 조직 화학 염색의 사용으로, 굴림과 HTS의 분포는 애벌레 NMJs의 시냅스 막에 겹쳐 관찰되지만,이 지역 8 복잡한에? 최근에 보여 여기에서 더 자세히 설명, 근접 내고 분석 (PLA)는 애벌레 NMJ 27 구체적으로 굴림과 HTS 사이의 현장 연관을 찾기 위해 사용됩니다.

PLA는 주로 9 동일계 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 세포 및 조직 배양에 사용되는 비교적 새로운 기술이다. 이 분석에서, 관심의 단백질에 대해 두 일차 항체 종 특이 이차 항체의 쌍의 검출 올리고 뉴클레오타이드에 접합되는 프로브를 PLA, 명명 (도 1A, B). 두 단백질의 경우S는 첨부 PLA 프로브 사이의 거리가 두 개의 추가 커넥터 올리고 뉴클레오티드 (도 1C)의 하이브리드 화를 통해 가교 될 수있다 (수십 나노 미터 내의 IE) 서로 근접하게된다. 이 형태에서, 올리고 뉴클레오티드 커넥터의 자유 단부가 서로 접촉 할 정도로 가까운 및 닫힌 원형 DNA 분자가 라이 게이션 동일계에서 (도 1D)에 형성 될 수있다. 원형 DNA 분자는 PLA 프로브 (그림 1E)에 결합 올리고 뉴클레오티드 중 하나에 의해 준비가 끝났다 현장에서 롤링 원 증폭을위한 템플릿 역할을합니다. 그 결과 증폭, concatemeric DNA 제품 내에서 시퀀스는 다음 형광 표지, 보완 올리고 뉴클레오티드 프로브 (그림 1 층)로 시각화 할 수 있습니다. 증폭 된 DNA는 PLA 프로브 중 하나, 단백질 - 단백질 상호 작용 withi의 세포 내 위치 파악에 부착되는 방식 때문에NA 조직을 용이하게 확인 될 수있다.

여러 가지 방법이 일반적으로, 이러한 공동 면역 침전 등의 체외 기술을 포함하여 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 (-풀다운 분석 및 효모 두 하이브리드 심사, 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 및 생체 분자 형광 보완 등의 생체 기술에 사용됩니다 BiFC). 시험 관내 기법 함정 상호 내생 발생되는 경우에, 상기 생체 기술 내인성 대응의 기본 동작을 반영하지 않을 융합 단백질의 인공 표현을 수반하면서 이들이 식별하지 않는다는 것이다. PLA의 하나의 주요 장점은 FR에 비교되는 신호를 생성하는 데 필요한의 근사 정도, 조직 내에서 서로 가까운 위치에 있고 가능성 착체를 형성 내인성 단백질 인터랙의 세포 내 위치 파악을 결정하는 능력이ET와 BiFC. PLA 인해 항체 인식 및 DNA 증폭의 결합에 높은 특이성과 민감도와의 상호 작용을 검출 할 수있다. 따라서, 분석은 상호 작용의 정확한 위치를 드러내 puncta의 형태의 이산, 밝은 신호를 생성 할 수있다. 또한, 부족하게 보이는 항원을 검출 할 수있다. 마지막으로, PLA는 수행 할 수있는 비교적 간단한 기술 없으며,이를 완료하는 데 표준 면역 절차보다 더 오래 걸립니다. 따라서, PLA는 종종 긴 준비 시간과 광범위한 문제 해결 퍼진 다른 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 통해 기술적 이점을 제공한다.

이 프로토콜은 PLA가 반응계 내에서 내인성 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 목적 초파리 애벌레 NMJ 어떻게 적용될 수 있는지를 보여준다. 여기에, PLA는 굴림과 HTS가 실제로 NMJs의 시냅스 부위에 복잡한에 존재하는 것으로 표시됩니다 애벌레 몸 벽 근육 준비에 수행. PLA는 이전에 애벌레 NMJ을 연구하는 데 사용되지 않은, 초파리의 조직이 분석을 사용한 출판 논문의 단지 소수는 현재이 있습니다. 그것은 초파리 사회에 PLA의 추가 노출이 다른, 더 일반적으로 사용되는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 보완하기 위해 추가 도구로 그 사용이 증가 될 것으로 기대된다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 몸 벽 준비

. 참고 : 이전에 브렌트 등 10 또는 라마 찬드 및 Budnik (11, 12)에 설명 된대로 (몸 벽 근육에 분포 NMJs의 연구를위한) 셋째 령 애벌레 몸 벽의 준비하지만 일부 수정을 수행했다.

  1. 해부
    1. 표준 절차 (13)를 사용하여 5~6일 25 ° C에서 플라이 주식과 십자가를 올립니다.
    2. 미세 집게를 사용하여 유리 병 또는 병에서 세번째 령 유충 크롤링을 선택합니다.
    3. 음식 입자를 제거하기 위해 인산 버퍼 식염수 (PBS)를 포함하는 작은 페트리 접시에 유충을 씻으십시오.
    4. 실 가드 디스크에 하나의 애벌레를 놓고 얼음처럼 차가운 PBS 몇 방울에 몰입. 얼음처럼 차가운 PBS는 조작하기 쉽게 만드는 유충 기절 도움이됩니다 사용. 해부 전반에 걸쳐 준비가 항상 건조되는 것을 방지하기 위해 PBS에 빠져들되어 있는지 확인합니다.
    5. 라의 위치를그 등쪽 두 기관 책자는 해부 현미경 (그림 2A)에서 볼 수 있습니다 너무 위로 향하게 RVA. 집게를 사용하면, minutien 핀을 파악 spiracles (그림 2B) 근처의 후방 끝 부분에 유충을 고정합니다. 다른 핀으로, 입 후크 근처 앞쪽 끝 부분에있는 표피 관통. 부드럽게 한 다음, 길이 유충을 스트레칭 (그림 2B)를 아래로 핀.
    6. 미세 절제 가위를 사용하여 작은 구멍을 만드 핀 근처 후단을 꼬집어. 절개는 표피를 통과 할만큼 피상적해야한다.
    7. 두 기관 책자 (그림 2C) 사이의 등쪽 정중선의 전체 길이를 따라 절단, 절개로 가위의 아래쪽 블레이드의 팁을 배치. 복부 몸 벽 근육 손상을 방지하기 위해 절단시 약간 위쪽으로 가위 블레이드를 가리 킵니다.
    8. 약간 포스트 앞쪽에 작은 수평 절개를합니다eriorly - 위치 핀 (그림 2C). 다른 유사한 절개 약간 전방-배치 핀 (그림 2C) 후부합니다. 절개는 표피를 통과해야한다.
      참고 : 유사합니다 결합 단계 1.1.7과 1.1.8에서 세 절개 " figure-protocol-1 완료 할 때 ", 즉, 애벌레 몸의 등 쪽의 왼손 및 오른손 플랩이 생성되어야한다.
    9. 조심스럽게 집게와 내부 장기를 청소. PBS의 몇 가지 강력한 방울을 추가하면, 애벌레 몸에서 장기를 대체하여 쉽게 제거 할 수있게 도와 줄 것입니다. 그것은 몸 벽 근육에 손상을 원인이됩니다 애벌레 몸을 파고하지 마십시오.
    10. 열린 애벌레 몸을 펼쳐라 아래 모서리 (그림 2D)를 핀. 피닝시 균일 텐션 사각형을 형성하도록 수평 및 수직 체벽 스트레칭 (SE전자 그림 모양에 대한 2G), 돌보는이 과정에서 몸 벽 근육이 찢어지지.
    11. 남아있는 내부 장기 (그림 2E)를 제거 완료.
  2. 고정 및 투과성으로
    1. 보우 인의 솔루션의 몇 방울에 고정 된 본체 벽을 담근다. 얼음에 15 분 동안 품어. 대안으로, 대안 고착성 등 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용한다; 30 분 동안 품어.
    2. 트리톤과 인산 버퍼 식염수 (PBT)로 3 회 씻어.
    3. 미세 핀셋으로 조심스럽게 핀을 제거하고 실리콘 화 0.65 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 그 모서리를 본체의 벽을 전송.
    4. PLA를 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 PBT의 몸 벽을 저장합니다. 최적의 결과를 얻으려면 하루 해부의 두 내 몸 벽을 면역 염색 시작합니다.
      참고 : 시약에 저장하고 신체의 모든 벽은 분석 기간 동안 동등하게 취급되도록, 다른 유전자형은 하나에 배치 할 수 있습니다튜브. 유전형 (예는도 2F 참조) 다르게 몸체 벽의 모서리를 절단함으로써 구별 될 수있다.

2. 면역 조직 화학

참고 :. 셋째 령 애벌레 몸 벽의 면역 염색은 이전 브렌트 등 14 라마 찬드 및 Budnik (11)에 설명 된대로 수행하지만, 일부 수정 11,14와했다.
참고 : 달리 명시되지 않는 실내 온도에서 교반과 함께 모든 단계를 수행합니다.

  1. 블로킹
    1. 10 분마다 PBT로 3 회 보디 벽을 씻는다.
    2. 1 시간 동안 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)로 차단합니다.
  2. 면역 염색
    1. 관심 두 단백질에 대해 마우스 및 토끼 일차 항체와 본체의 벽을 인큐베이션을 실온에서 2 시간 또는 밤새 39 ° C (1 %의 BSA에 희석). 250 토끼이 경우 1:10 마우스 항 굴림 및 1을 사용NTI-HTSM (15, 16). 하지 마우스 나 토끼에서 만들어진 마커에 대한 항체도 포함 할 수있다 - 예를 들어, 1을 사용 : 200 염소 항 - HRP는 신경 세포막을 윤곽을 그리다.
    2. 10 분마다 PBT로 3 회 세척 할 것.
    3. 실온에서 2 시간 또는 밤새 39 ° C (1 %의 BSA에 희석) 마커를 검출하기 위해 형광 접합 된 이차 항체와 함께 배양한다. HRP 염소 항 - 항체를 검출하기 위해 200-FITC 접합 항 - 염소 : 예 1을 사용 - PLA 신호 이후 적색 형광 가시화 된 바와 같이, 형광 물질은 다른 마커를 검출하기 위해 사용되어야한다. 때문에 빛에 민감한 시약의 사용, 이후이 시점에서 어둠 속에서 튜브를 유지.
      참고 : PLA는 공 초점 현미경 아래에서 빨강 채널에서 시각 신호와, 마우스 및 토끼에서 제기 된 주요 항체 사이에 수행 할 수에 사용되는 키트는 할 수 있습니다. 원하는 경우, 다른 키트는 분석이 주역으로 수행 할 수 있도록 그 사용할 수 있습니다RY 항체는 다른 종에서 발생하고, 신호는 다른 채널에 가시화.

3. 근접 내고 분석

참고 : 달리 명시되지 않는 실내 온도에서 교반과 함께 모든 단계를 수행합니다.

  1. PLA 프로브
    1. 10 분마다 PBT로 3 회 보디 벽을 씻는다.
    2. 37 ° C에서 2 시간 동안 (5 희석 1 % BSA 각 1) PLA의 프로브를 품어. 이 경우, 5-10 몸체 벽의 적당한 침지 및 혼합을 보장하기 PLA 프로브 항 - 마우스 마이너스 40 μL, PLA 프로브 항 - 토끼 PLUS 40 μL와 1 % BSA 120 μl를 사용한다. PLA 프로브 1시 25분 희석율 여전히 (이 실험 예) 적절한 신호 대 잡음 비율을 초래할 수있다.
  2. 결찰
    1. 5 분 각각에 대해 두 번 세척 버퍼와 신체 벽을 씻으십시오.
    2. 1 시간에 대한 연결 용액 (결찰 완충액 리가 아제 1시 40분 희석)과 인큐베이션t 37 ° C의. 이 경우, 본체 5-10 벽의 적절한 혼합 및 침지를 위해 리가 아제 5 μL, 5 결찰 완충액 40 μL 및 고순도의 물 155 μl를 사용한다.
  3. 확대
    1. 2 분 각각에 대해 두 번 세척 버퍼와 신체 벽을 씻으십시오.
    2. 37 ° C에서 2 시간 동안 증폭 용액 (증폭 완충액 폴리머 라제 1:80 희석)으로 배양한다. 이 경우, 본체 5-10 벽의 적절한 혼합 및 침지를 위해 폴리머 라제 2.5 μL, 5 증폭 완충액 40 μL 및 고순도 157.5 μL의 물을 사용한다.
  4. 이미징을위한 준비
    1. 10 분 각각에 대해 두 번 세척 버퍼 B와 몸 벽을 씻으십시오.
    2. 1 분에 대해 한 번 0.01x 워시 버퍼 B 씻으시오.
    3. 장착하기 전에 적어도 30 분 동안 장착 솔루션의 몇 방울의 평형, 또는 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다.
    4. 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 플랫폼 슬라이드 w에 몸 벽을 전송i 번째 자신의 손톱이 아래를 향. 행과 mountant의 하락 또는 두 내에서 같은 방향으로 몸 벽을 배치합니다. 다음 투명 매니큐어와 슬라이드를 밀봉, 공기 방울을 발생하지 않도록 준비를 돌보는 동안 22mm X 40mm coverslip에 배치합니다.
    5. 공 초점 이미징을위한 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

야생 형의 제 3 령 애벌레 NMJs에서 굴림은 주로 유형의 종말보다 굴림 면역 수준이 형 IB의 종말에서 더 두드러 인 상태, I 형 글루타메이트 종말의 시냅스 막에서 발견된다 (그림 3A) 4. HTS는 근육에 걸쳐 존재하지만 HTS 면역 수준이 두 유형 I 종말 동일 표시와 시냅스 부위에 집중하고, 또한 (그림 3A ') 8,17 시냅스 발견된다. 굴림과 HTS의 분포가 크게 시냅스 영역 (그림 3A '') 8시에 중복 있습니다.

굴림과 HTS는 NMJ에서 복잡한에 존재하는지 확인하려면, PLA는 두 단백질 사이에 애벌레 몸 벽 근육 준비에 실시 하였다. 이 분석, N 말단 및 토끼 항 HTSM 항체에서 제 PDZ 도메인을 검출하는 마우스 항 통해 Dlg 항체즉, C 말단 MARCKS 상동 도메인 (15, 16)를...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 보고서는 PLA가 초파리 애벌레 NMJ에 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 분석은 본 NMJ에서 내인성 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 목적 유생 체벽 근육 제제에 대해 수행된다. 이 기술로, 굴림 및 HTS 서로 매우 밀접, 따라서 구체적으로 시냅스 영역 (27)에서, 복합체에 존재하는 것으로 도시된다. 이 결과의 지원으로, 이전의 연구는 다음과 같은 데이터와의 연관성의 증거 제공하고있다 : 굴림과 HTS의 면역 분포 애벌레 NMJs의 시냅스 부위에 겹쳐 1), 2) 굴림과 HTS는 공동 기반으로하는 복합체를 형성 면역 전체 성인 해물 비행과 관련된 실험, 3) 굴림과 HTS는 상피와 시냅스 접합 8 모두에서 상호 작용한다. 시냅스 지역에서 PLA 신호도 굴림와 박세리, 이전에 다른 연구에서 확인 된 상호 작용 사이에 관찰하여 더 크리 디를 제공NMJ 15,20,21에서이 분석을 사용 NCE. 흥미롭게도, 박과를 Wg 사이의 PLA는 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는 플라이 주식을 제공하기위한 블루밍턴 초파리 증권 센터 감사합니다. 우리는 또한 항체를 제공하기 위해 발달 연구 하이 브리 도마 은행과 박사 린 쿨리 (예일 대학) 감사합니다. 특별한 감사는 원고에 그녀의 도움을 AhHyun 유 간다. 이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (크리거), 윌리엄과 에이다 이사벨 스틸 기금 (크리거) 및 건강 연구의 캐나다 연구소 (강화)에서 보조금에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
집게(파인 #5)AlmedicA10-704
Sylgard DiscWorld Precision InstrumentsSYLG184엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합합니다. 30분으로 설정합니다. 금형에 붓습니다(예: 12웰 세포 배양 플레이트 사용). 적어도 24 시간 동안 치료하십시오. 해부할 때 60 x 15mm 페트리 접시 뚜껑의 뚜껑을 부착하십시오.
Minutien 핀(0.0125  mm 팁 직경)Fine Science Tools26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)Fine Science Tools15200-00
Platform Slides접착제 두 개의 22 x 22 mm2 커버슬립을 투명한 네일 폴리시가 있는 현미경 슬라이드에 놓아, < 시료 장착을 위한 20mm 간격.
w1118Bloomington Drosophila Stock Center3605
hts01103Bloomington Drosophila Stock Center10989스톡은 GFP 밸런서를 통해 재조정되어 GFP 신호의 부재를 기반으로 동형접합 돌연변이를 선택할 수 있습니다.
1x PBS (인산염 완충 식염수) : 3  mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7.0NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin의 솔루션Sigma-AldrichHT10132
4% PFA (파라포름알데히드) : 4x PBS의 1% PFAPFA(아나케미아 사이언스 - 66194-300). 솔루션을 만드는 방법에 대한 지침은 doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006을 참조하십시오.
[헤더]
1x PBT (트리톤이 함유된 인산염 완충 식염수): 0.01% 트리톤트리톤 X-100이 포함된 1x PBS (시그마-알드리치 - T8787)
1% BSA (소 혈청 알부민): 1x PBTBSA (Bioshop Canada - ALB001)에 1% BSA. 4 °C에 보관하십시오.
mouse anti-Dlg (Discs large)Developmental Studies Hybridoma Bank4F31% BSA에서 1:10 희석으로 사용합니다.
토끼 안티 HtsM (Hu-li tai shao)Dr. Lynn Cooley (Yale University) 제공. 1% BSA에서 1:250 희석으로 사용하십시오.
토끼 항박(p21-활성화 키나아제)제공:Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). 1% BSA에 1:500 희석하여 사용하십시오.
마우스 anti-Wg (Wingless)Developmental Studies Hybridoma Bank4D41% BSA에서 1:5 희석으로 사용합니다.
염소 anti-Hrp (Horseradish peroxidase)Jackson                          ImmunoResearch123-065-0211% BSA에 1:200 희석하여 사용하십시오.
FITC-conjugated 당나귀 안티 염소잭슨                        ImmunoResearch705-095-0031% BSA에 1:200 희석하여 사용하십시오.
Duolink In Situ PLA 프로브 안티-마우스 MINUSSigma-AldrichDUO92004
Duolink In Situ PLA 프로브 안티-래빗 PLUSSigma-AldrichDUO92002
Duolink 현장 검출 시약 레드Sigma-Aldrich DUO92008
1x 세척 버퍼 A: 0.01  M 트리스, 0.15  M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x 세척 버퍼 B: 0.2  M 트리스, 0.1  M NaCl, pH 7.5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x 세척 버퍼 B: 2  mM 트리스, 1  mM NaCl, pH 7.5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Sigma-AldrichDUO82040사용한 Duolink In Situ Mounting Medium
DAPI 를

참고문헌

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

초파리 유충 신경근 접합부단백질-단백질 상호작용공초점 현미경 검사면역형광법시냅스 후 막Dlg Hts 복합체PLA 프로브롤링 서클 증폭체벽 표본 제작
검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.