우리는 다낭성 신장 질환의 가능한 제브라피시 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 신장 구조를 시각화하기 위해 Tg(wt1b:GFP) 물고기를 사용했습니다. wnt5a의 넉다운은 모르폴리노 주입에 의해 이루어졌습니다. wnt5a 녹다운 후 Pronephric 낭종 형성이 이 GFP 형질전환 제브라피시에서 관찰되었습니다.
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방법 논문
다낭성 신장 질환의 가능한 제브라 피쉬 모델 :의 넉다운 wnt5a Zebrafish의 신장의 낭종 원인
이 논문에서
요약
초록
다낭성 신장 질환(PKD)은 치료법이 없는 파괴적인 질병인 말기 신장 질환의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. PKD에서 낭종 형성을 이끄는 분자 메커니즘은 다소 불분명하지만 많은 유전자가 관련되어 있는 것으로 생각됩니다. Wnt5a는 광범위한 발달 과정을 조절하는 비정준 당단백질입니다. Wnt5a는 신장 세뇨관 세포 신장 동안 방향성 세포 분열을 조절하는 평면 세포 극성(PCP) 경로를 통해 작동합니다. PCP 경로의 결함은 신장 낭종 형성을 유발하는 것으로 밝혀졌습니다. 본 논문은 wnt5a 안티센스 모르폴리노(MO) 올리고뉴클레오티드를 이용하여 wnt5a 유전자를 knockdown하여 제브라피시 낭포성 신장 질환 모델을 개발하는 방법을 설명합니다. Tg(wt1b:GFP) 형질전환 제브라피시를 사용하여 wnt5a 녹다운 후 신장 구조와 신장 낭종을 시각화했습니다. 두 개의 뚜렷한 안티센스 MO(AUG - 및 스플라이스 부위)가 사용되었으며 둘 다 wnt5a 넉다운 후 곱슬 꼬리 아래 표현형 및 낭종 형성을 초래했습니다. 1차 염기쌍 구조의 차이로 인해 MO에 내성이 있는 마우스 Wnt5a mRNA를 주입하여 비정상적인 표현형을 구출하여 표현형이 모르폴리노의 "off-target" 효과에 기인하지 않음을 입증했습니다. 이 연구는 제브라피시 모델을 사용하여 신장의 wnt5a 기능을 연구하는 것의 타당성을 뒷받침합니다.
서론
제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 배아 신장 널리 개발 다낭성 신장 질환을 연구 모델로서 이용되어왔다. 가지 동물 모델로서 지브라 피쉬를 사용하는 많은 장점 : 유전 결합 연구의 타당성은, 단백질 녹다운 대한 안티센스 morpholinos (MO)를 사용하는 능력은, 기회 신속 배아 다수를 분석하는, 그리고 오르간 표현형을 쉽게 볼 애벌레 한 생활. pronephros는 척추 동물에서 개발 한 최초의 신장과 애벌레 제브라 피쉬 2에서 작동합니다. pronephros 지브라 피쉬의 구조는 포유류 metanephros 비교적 간단한 비교되고, 마지막 세 번째 신장 포유류 개발. 네프론 어려운 네프론 단일 구조를 관찰 할 수있어 네프론 500,000-1,000,000 3,4- 약 13,000 네프론 (5)를 각각 갖는 마우스 신장 사이 각각 함유 인간 신장과 신장의 작업 단위 In은 인간 또는 마우스 신장. 제브라 피쉬는 두 개의 네프론을 가지고 있으며, 각각의 제브라 피쉬 네프론은 사구체와 생쥐와 인간 (6)와 유사한 전문 신장 세포 유형의 세관에있는 모든 주요 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이 닫힌 시스템 (7)을 가지고 있기 때문에 이러한
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프로토콜
참고 : 윤리 선언문 : 모든 제브라 피쉬 실험 동부 버지니아 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 모르 폴리 노 준비
- (그림 1A) 제조업체의 지침에 따라 관심의 유전자에 대한 설계 및 합성 번역 차단 ((behavior)을 증대) 및 스플 라이스 억제 (Splice-) 안티센스 모르 폴리 노 (MO) 올리고 뉴클레오티드. 표 1에서 제조업체의 정보를 참조하십시오.
참고 : 수법의 살인은 유리 병에 동결 건조 된 주식으로 제공됩니다. - 25 ㎍ / μL의 최종 농도 수법의 살인을 다시 중단 유리 병에 고급 멸균 물을 추가합니다. 올리고 뉴클레오티드가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다. 일부 고체 남아있는 경우, 5 짧게 분 소용돌이 (10)에 65 ° C에서 주식 올리고 뉴클레오티드 솔루션을 포함하는 유리 병을 가열한다.
- RT에서 MO 주식 솔루션을 저장합니다. 4 ° C 또는 -20 ℃에서 보관하지 마십시오; C 낮은 온도는 MO 올리고 뉴클레오티드가 용기 벽에 바인딩하는 원인이 될 수 있기 때문이다. 분광 광도계를 사용하여 원액의 농도를 측정 새로운 MO의 원액 때마다 (표 1 참조)....
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결과
Wnt5a 노크 번역 MO 차단을 도입하여 달성되었다 (AUG-MO) 또는 하나의 셀 단계에서 제브라 피쉬 배아에 엑손 / 인트론 경계 스플 라이스 MO (스플 라이스-MO). 월 - MO 따라서, 두 모자 접합체 wnt5a 메시지를 억제, 개시 코돈을 대상으로합니다. MO-접합부는 제 스플 라이스 공여 부위를 표적으로 wnt5a (도 1A)만을 전사 접합체를 억제한다. (behavior)을 증대하고 splice- morphants 곱슬 꼬리를 아래로 몸 축과 심낭 부종 (그림 1B)를 포함, 여러 결함이 서로 phenocopied. 마우스 Wnt5a mRNA를 부분적으로 표현형 오프 대상 효과로 인해 아니라는 것을 보여주는 morphant 표현형 (그림 4B)을 구출. (TG wt1b : GFP)는 GFP wt1b의 내인성 발현을 되풀이되도록 wt1b 프로모터에 의해 구동.......
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토론
다낭성 신장 질환 (PKD)는 인간에서 말기 신장 질환의 주된 원인 중 하나이며, 프로그레시브 낭종 형성, 신장 확대 및 비정상적인 세관 (14)에 의해 발전을 특징으로한다. 상 염색체 우성 PKD (ADPKD)은 유전 질환 인 중 하나 PKD1의 돌연변이, polycystin-1 (PC1), 또는 PKD2를 인코딩 polycystin-2 (PC2)를 인코딩, 다낭성 신장의 결과. 다른 많은 유전자, 차 섬모에있는 단백질을 코딩 특히는, 신장 낭종의 개발에 관여하는 것으로 생각하고, 지금까지이 유전자를 선별하는 이상적인 도구가되지 않습니다. 우리는 zebrafish의 유전자 최저 후 신장 낭종 형성을 관찰하는 빠르고 쉬운 방법을 설명합니다. 이 방법은 다른 가능성 PKD 후보 유전자를 스크리닝하기 위해 사용될 수있다.
이 기술의 장점 중 하나는 단순하다. Tg는 (wt1b : GFP)에서 제브라 피쉬, GFP의 발현은 특정을 만드는, 사구체.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 (LH하는 DK093625 및 DK069909 및 DK047757 JHL에) NIH에서 지원하고, VA (우수상 JHL에 I01BX000820). 우리는 필수적인 지원을 제공하기 위해 펜실베니아 Zebrafish의 핵심 대학에서 박사 마이클 팩 박사 지에 그에게 감사의 말씀을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.5 % Phenol-Red | Sigma | P0290 | 주입 용 색상 표시기 |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (맞춤형) | 관심 유전자에 맞게 맞춤 설계 |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | 많은 양의 바늘이 필요한 경우 바늘 풀러를 구입하여 실험실에서 바늘을 준비 할 수도 |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | 구조 실험을 위한 캡핑된 mRNA를 만들기 위한 시험관 전사 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | 멜라닌화 예방을 위한 |
| Tricaine | Sigma | A5040 | 또한 에틸 3-aminobenzoate라고도 하며, 제브라피쉬 마취를 위한 |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | 제브라피쉬의 위치 |
| QIAquick PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | 캡 RNA 합성을 위한 PCR 산물의 정제용. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | PCR |
| 태그 DNA 중합효소 | Invitrogen | 10342-053 | PCR |
| NanoDrop 분광 광도계 | Thermo Scientific | ND-1000 | morpholino 및 RNA 농도 측정 |
| 공기 압축기 | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | 주입 용 공기 소스 |
| 피코 마이크로 분사 펌프 | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | 다른 유형의 미세 주입 시스템을 사용할 수 있습니다. |
| 마이크로 제조 World | Precision Instruments Inc | MMJR | 오른손잡이용 (MMJL은 왼손잡이용) |
| 바늘 홀더 | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | 미세 조작용 바늘을 잡기 위해 |
| Dumont 핀셋 | 미세 수술 도구 | 11253-20 | 바늘 끝을 끊기 위한 |
| 부 현미경 | Leica M205C | 제브라피쉬 배아 관찰 및 이미징용 | |
| 형광 현미경 | Zeiss Axio Obserer D1m | 제브라피시 프로네프로스 이미징용 | |
| 모세관 (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | 주입된 각 방울의 부피 측정용 |
참고문헌
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn
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재인쇄 및 허가
