방법 논문

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

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⸱

DOI:

10.3791/52158

⸱

2014년 11월 26일

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

이 논문에서

요약

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 렌티 기반 재 프로그래밍 방법론으로 생성 될 수있다. 그러나, 게놈의 적극적 전사 영역에 남아있는 잠재적 발암 유전자의 흔적은 인간의 치료 응용 프로그램 (1)에 사용하기 위해 자신의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 또한, 치료 학적으로 중요한 유도체 줄기 세포 분화 또는 재 프로그래밍 유래의 비 - 인간 항원 인간 임상이 문맥에서 사용되는 이러한 hiPSCs는 배제. 이 비디오에서는, 우리는 재 프로그래밍 및 외래 유전자의 무료 요인이없는 hiPSCs를 분석하는 절차를 제시한다. 이러한 hiPSCs이어서 렌티 바이러스를 포함하는 특정 인트론 유전자 발현의 이상에 대해 분석 할 수있다. 이러한 분석은 이전에 유전자 발현의 차이 (3)를 검출하는 데 덜 민감한 기술 위에 이점을 갖는다 민감한 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 수행 될 수있다. 로 전체 변환임상 등급의 우수 제조 기준 (GMP) 조건, 인간의 임상 적 관련성을 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 제공하는 또 다른 방법이 제공하는 현재의 안전 항구 기준이 확장 인간의 치료 응용 프로그램-을 위해 만기가 인간이 아닌 항원에 어떤 면역 원성의 위험을 제거해야한다 GMP 수준의 hiPSCs를 유도하는 요인이없는 특성화 된 hiPSC 기반의 파생 상품을 포함 할 것이다. 이 프로토콜은 모든 유형의 세포로 재 프로그램 렌티 폭넓게 적용되며, GMP 수준의 조건으로 세포를 재 프로그램을 변환하기위한 재생 가능한 방법을 제공한다.

서론

성인 인간 세포는 4가지 주요 전사 인자의 렌티바이러스 기반 발현의 결과로 후성유전학적 리모델링 및 재프로그래밍을 거칠 수 있는 것으로 나타났습니다4,5. 리프로그래밍(reprogramming) 분야의 중요한 발전은 단백질 발현의 정확한 화학량론적 비율을 가능하게 하는 4개의 재프로그래밍 전사 인자(reprogramming transcription factor)를 모두 수용하는 단일 절제성 렌티바이러스 줄기세포 카세트(STEMCCA)를 사용한 것입니다6. 또한, 감염 범위의 특정 다중성에서 형질도입될 경우, STEMCCA는 재프로그래밍 과정 동안 주로 단일 게놈 통합 사건을 유발할 수 있습니다7. 줄기세포주 유도 후 재프로그래밍 벡터를 절제하는 Cre/loxP 기술을 활용하는 절제 가능한 STEMCCA 버전의 도입으로 무인자 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC) 세포주를 유도할 수 있게 되었습니다8. 또한 hiPSC의 치료 적용을 강화하기 위해 이종 함유 조건에서 이종이 없는 조건으로 GMP(Good Manufacturing Practice) 등급 세포주 변환을 위한 새롭고 빠르며 쉽게 적용할 수 있는 방법론을 구현해야 했습니다. 여기에서는 특히 인트론(intron)에 통합되었을 때 통합된 유전자 발현 차이와 임상 등급의 세포가 추정되는 GMP 조건으로 전환되는 것을 보다 정확하게 평가하는 관련 방법론에 대해 논의합니다.

이전 연구에서는 STEMCCA 형질 도입3,9 후 통합 유전자의 유전자 발현 차이를 분석하기 위해 상대적으로 둔감한 마이크로어레이 전사 분석만 사용했습니다. 여기에서는 통합 유전자 발현 차이를 추가로 조사하기 위해 민감한 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석 방법론을 소개합니다. 중요한 점은, 현재의 세이프 하버 기준은 바이러스 통합을 가진 유전자를 가진 hiPSC를 폐기하여 다운스트림 인간 세포 치료제에 대한 이러한 세포의 적용 가능성을 제한한다는 것입니다9. 우리는 완전히 특성화되고 유전자 이식이 필요 없는 인트로닉 재프로그래밍된 hiPSC의 사용으로 현상 유지가 바뀔 수 있다고 제안합니다. 또한, 당사는 원래 이종 함유 조건10에서 파생된 다양한 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있는 강력한 GMP 등급 세포 변환 프로토콜을 소개합니다. 이는 인간 치료 관련성을 유지하기 위해 임상 등급의 조건을 필요로 하는 미래 세포 재프로그래밍 실험의 개발에 중요한 기회를 제공합니다.

이러한 방법론은 현재의 세이프 하버 기준을 확장하여 통합 인트론에서 STEMCCA 절제 후 정상적인 유전자 발현 프로파일을 유지하는 특성화된 STEMCCA 재프로그래밍된 hiPSC 라인을 포함할 수 있는 기반을 제공합니다. 또한 비인간 동물 항원이 없는 임상 등급 조건으로의 완전한 전환은 이전에 이종 함유 조건에서만 재프로그래밍되고 특성화되었던 더 많은 세포 유형을 통합하는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 방법론을 종합해 볼 때, 미국 식품의약국(FDA)은 제한적 승인을 인간 배아줄기세포(ESC) 기반 치료제에서 hiPSC 기반 치료제로 확대하는 것을 고려하고 있습니다11.

우리는 최근에 완전히 특성화되고 추정되는 임상 등급 조건으로 변환된 요인이 없는 hiPSC 라인의 유도에 대해 자세히 설명했습니다10. 여기에서는 STEMCCA 렌티바이러스를 활용하여 hiPSC 유도를 위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 그런 다음 이러한 줄기세포는 절제 과정을 거친 후 유전자 발현 특성화를 거칩니다. 마지막으로, hiPSC는 느린 변환 방법론에 의해 GMP 등급 조건으로 변환됩니다.

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프로토콜

주 :.이 방법은 경외 등 (10)에보고 된 연구에 사용 하였다.

STEMCCA 1. 재 프로그래밍 성인 인간 피부 섬유 아세포

  1. 해동 성인 피부 인간 섬유 아세포 (한국 외대), 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 통로 (4) 이하, 물을 유리 병의 상단 잠수함 않도록주의.
  2. 15 ML 원뿔 유리 병에 인간 섬유 아세포의 1 ml의 슬러리를 놓고 천천히 드롭 현명한 방식으로, 37 ° C로 미리 예열 표준 HUF 미디어, 4 ml의 배치, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 밖으로 희석하기 다시 중단 세포를.
  3. 실온에서 10 분 동안 200 XG에서 바이알을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 / ㎖ 100,000 세포 현탁액을 만들 매체의 적절한 볼륨에서 셀을 다시 중단하고 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 2를 가하여, 0.2 % 젤라틴으로 20 분 동안 미리 코팅.
    참고 : 라인과 조건에 따라 세포의 동일한 수의 잘 자매 fo를 접종해야R 셀 카운팅 / 감염 (MOI) 계산의 다양성.
  4. 세포를 균일하게 분배하는 전후 좌우하고 판측 락. 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 밤새 인큐베이션.
  5. 전달의 날, 세포 자매의 수 (들) 잘 초기 HUF 도금 후 (들) 약 24 시간을 구하십시오.
  6. 2 × 10 8 TU 또는 이와 동등한, 렌티 바이러스 농축 (STEMCCA)을 밖으로 해동 HUF 미디어 1 × 10 8 TU / ㎖로 희석.
  7. 8 ㎍ / ㎖의 트랜 스펙 션 제로 보충 HUF 배지에서 10 MOI 비율로 세포를 형질 도입. 균등 형질 우물을 혼합하고 가습 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 밤새 품어.
  8. 렌티 바이러스 전달 후 약 24 시간은 표준 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 매체에 HUF 매체를 전환합니다.
  9. 일 2 ~ 6 일, 인간의 PSC 매체 매일 미디어를 변경합니다.
  10. 하루 6 일, 두 0.2 % 젤라틴 코팅 10 cm 판을 판HUF 미디어 12 CF1 마우스에서 파생 된 1.5 10 × 1.75 6 MEFs에.
  11. 7 일에, 조심 사이에 균등하게 세포를 도금, 1시 16분 비율로 6 웰 플레이트 및 통로의 한 우물에서 7 일 다시 프로그램 섬유 아세포를 들어 올릴 때는 100 개 이상의 XG, 사용 실온 트립신을 원심 분리하지 전날 MEFs에 도금 된 신선한 인간의 PSC 미디어, 두 10cm 플레이트. 37 ° C에서 시계 방향으로 나선형 운동과 장소에 세포 집합체를 배포, 5 % CO 2 하룻밤 인큐베이터를 가습.
  12. 약 48 시간 이후 MEFs에 매일에 재 프로그램 세포를 파종 한 후, 신선한 매체와 소비 인간의 PSC 미디어를 변경합니다.
  13. 3~4주 후, 21 게이지 바늘 형태처럼 전형적인 ESC 개별 콜로니를 선택하고 0.2 % 젤라틴 - 코팅 된 개별 웰에 특정 콜로니 약 8-10 개별적인 조각을 배치하여 24 웰 플레이트 아웃 서브 클로닝 24 웰 플레이트 전 씨인간의 PSC 매체 CF1 마우스에서 파생 된 MEFs에와 에드.
    주 : 촬상 콜로니 전개 후, 콜로니를 단백질 수준에서 배아 체 형성 및 다 능성 마커의 발현 분석에 의하여 다 능성 특징으로 할 수있다.

2. 벡터 통합 사이트 분석 및 STEMCCA 절제술

  1. 10 바와 같은 비 제한적인 선형 PCR에 의해 증폭 STEMCCA 통합 사이트를 분석한다.
  2. 오래된 인간의 ESC 매체를 흡입하여 게놈, 소비세 STEMCCA의 원하는 영역으로 하나의 통합을 보장하기 위해 시금 후. 그 후, 24 시간 동안 표준 PSC 미디어 3 ㎖ 8 ㎍ / ㎖의 트랜 스펙 션 제로 농축 아데노 - 치운다 PuroR 바이러스의 45 μl를 결합한다.
  3. 24 시간의 잠복기 후, 혼합 바이러스 뜨는을 대기음과 인간의 PSC 미디어로 두 번 세포를 씻으십시오. 5 일 동안 2 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신과 함께 신선한 인간의 PSC 매체를 놓고 미디어 매일 재치 변경시간 신선한 매체와 항생제.
  4. 오일 후 서브 클론 12- 웰 플레이트에서 0.2 % 젤라틴 - 코팅 된 웰에 21 게이지 바늘을 가진 콜로니로부터 유도 된 잔류 CF1mice MEFs에 사전에 도포하고, 위에서 설명한 바와 같이 확장.
    참고 : 충분한 확장은 냉동 보관을 얻을 후, 공급이없는 상태로 변환이 필요합니다. 대부분의 세포가 성공적으로 형질 도입되지 않고 배양 오일 걸쳐 항생제에 굴복하는 바와 같이 95 % 이상의 줄기 세포 콜로니 사멸 예상된다. 아데노 Cre 호텔 - PuroR는 요인이없는 식민지의 샘플을 reexposing, 감염된 세포의 호스트 염색체에 0.001 %의 효율로 통합 있지만 더 통합 13 발생하지 확인합니다 100 % 세포 사멸을 보장하기 위해 퓨로 마이신합니다.
  5. 매트릭스가 액체가 될 때까지 약 2 시간 (제조자의 권고)에 걸쳐, 얼음에 사전 분취 기저막 매트릭스의 한 바이알을 해동하고 차가운 기저 매체 1:30 최종 농도로 희석 아웃. 공동물론 당 1 mL를 여섯 웰 플레이트에 웰 원하는 번호로. 실온에서 1 시간 동안 앉아 보자.
  6. 물론 이전에 MEFs에 코팅 30 식민지 적어도 20 (18 게이지 바늘, 또는 유리 또는 플라스틱 "팁"을 사용하여) 크로스 해치. MEF는 고양 줄이고 판에서 전송할주의하십시오.
    1. 멸균 플라스틱 피펫 팁의 간단한 사용법으로, 화염에, 더 복잡한 가열에서, 다른 접근 방법을 통해 유리 파스퇴르 피펫의 당김, 및 마무리를 해칭 장치를 생성하거나, 우리의 경우에서와 같이, 21- 및 / 또는 18 게이지 바늘.
  7. 코팅 잘 후 배양에서 행렬을 기음.
  8. 200 μL 피펫으로 이전 판에서 부드러운 스크랩하여 식민지의 조각을 제거하고 조심스럽게 매트릭스 코팅 접시에 신선한 결합 된 미디어 (1) 3 ㎖에 배치합니다. 37 ° C, 5 % CO 2 가습 배양기에서 하룻밤 품어. 미디어 변경, 48 시간 계대 후.
  9. 상업 DNA 추출 키트를 사용하여 80 % 이상의 포화 상태에, 절제 포스트 및 피더없는 변환 된 hiPSCs에서 게놈 DNA를 추출합니다.
  10. STEMCCA의 렌티 바이러스의 외생 적 통합을 위해 특정 프라이머와 적절한 절제에 대한 분석 : gDNA를-헨도-MycS 감기, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA를-hWPRE-역, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. 10 μM 원액을 PCR 등급 물을 동결 건조 된 프라이머를 복원합니다.
  11. 다음과 같은 5 단계 프로토콜 PCR을 실행하여 초기 변성을 3 분 동안 95 ° C에서; 15 초 동안 72 ° C에서 15 초, 및 확장을위한 62 ° C에서 20 초, 프라이머 어닐링 98 ° C에서 변성, 다음의 각 35주기 3 분 72 ° C에서 단일주기 최종 확장 하였다.
  12. 아가 로스를 1.5 g 칭량하고 50 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 - EDTA 버퍼에 배치하여 3 % 아가 로즈 젤을 확인. 아가로 오스 때까지 전자 레인지 용해 DNA 젤 얼룩의 장소는 p로퍼 희석, 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안 고화 겔 카세트에 적절한 양을 분배.
  13. PCR 산물의 부하 12 μl의 3 % 아가 로즈 겔에 로딩 염료 3 μL와 혼합 하였다. V. 80에서 30 분 동안 젤을 실행
  14. 적절한 절제를 나타내는 밴드의 부재에 대한 자외선 시각화.

사전 및 사후 적출 hiPSCs에서 정량 PCR을 이용한 유전자 발현의 차이 3. 정량

  1. 상업 RNA 추출 키트를 사용하여 절제 포스트 및 피더없는 변환 된 hiPSCs에서 총 RNA를 추출합니다.
  2. - 역 전사 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용하여 총 RNA 1 μg의 최대. 고정 - 올리고 (DT) (18) 임의 헥사 프라이머를 사용합니다.
    참고 : PCR 프로토콜은 4 KB보다보다 더 많은 이하의 유전자 성적 증명서에 맞게 조정되어 있는지 확인합니다. 특정 프라이머 중 유전자 STEMCCA 원래 통합 전을 위해 만든해야합니다NTO.
  3. 20 μM 원액을 PCR 등급 물을 동결 건조 된 프라이머를 복원합니다.
  4. 10 μM의 UPL 프로브로 구성되어 반응 20 μL, 2 배의 LightCycler 480 프로브 마스터 당 샘플의 5 NG를 사용하고, 앞으로 20 μM 및 역방향 프라이머.

GMP 수준의 조건으로 4. 변환

  1. GMP 수준의 조건을 통해 후 절제 hiPSCs를 전환의 첫 날, 결합 된 인간의 PSC로 구성된 미디어의 혼합을 미디어 1 (결합 된 미디어 1) 임상 성적 우수 제조 기준 (GMP) 호환 미디어 (결합 된 미디어 2 ) 80 : 20의 비율로.
  2. 대기음 오래 결합 매체 (1)과 80:20의 비율로 조합 된 새로운 매체 1 및 2, 예열 3 ㎖를 배치 오프. 이 특정 비율로 3 일 동안 매일 미디어를 변경합니다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
  3. 하루에 4 일, 50 : 50의 비율로 결​​합 된 미디어 (1)과 (2)를 확인합니다. 기존 매체와 REPLAC 대기음50 대 50의 비율로 결​​합 된 미디어 1과 2와 미리 예열 미디어와 전자. 이 특정 비율로 3 일 동안 미디어를 변경합니다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
  4. 7 일째, 20:80의 비율로 혼합 매체 1 및 2를 만든다. 대기음 기존 매체 오프와 20:80의 비율로 결​​합 된 미디어 1과 2, 예열 용지로 교체합니다. 이 특정 비율로 3 일 동안 미디어를 변경합니다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
  5. 100 비 : 10 일에, 0에 결합 된 미디어 1과 2를합니다. 대기음 기존 매체 끄고 0 결합 된 미디어 1과 2, 미리 예열 용지로 교체 : 100 비율. 이 특정 비율로 매일 미디어를 변경합니다. 세포는 완전히 정의 이종 무료 매체에있다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
    주 :이 전체 변환 프로세스 중, 18 게이지 바늘로는 적절한 루틴 계대 콜로니 크기 및 밀도를 유지하기 위해 필요하다. 페이지에 계획콜로니 크기, 포화 상태, 및 분화에 기초하여 모든 4~5일 세포 assaging.
  6. 제조업체에서 권장 정의 이종 무료 기판과 여섯 잘 플레이트에 잘 코트 하나.
  7. 기계적 통로 합류가 아니라, 이미 18 게이지 바늘 여섯 웰 플레이트에서, 이종없는 미디어 조건을 변환. 중요한 것은, 미디어를 조건을 사전에 계대 전에, 1 시간 동안 1 배 ROCK 억제제와 세포에 새로운 미디어 (결합 된 미디어 2)를 배치합니다.
  8. 세포로 전달되고 있다는 새로운 플레이트 오프 합성 기질 용액 기음. 이전 판에서 줄기 세포 덩어리를 포함하는 모든 용지를 제거하고 새로운 판에 전송합니다.
  9. (한 번 인큐베이터 내부, 직접 방식으로 접촉하지 않는 이상적 판) 다시 최소한의 물리적 방해 2 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포는 최대 첨부를 허용합니다.
    참고 : 세포는 매일 미디어를 변경해야합니다. 지속적인 passaging 4 일마다이 중요 할 것이다. 21 게이지 바늘, 최적의 ESC와 같은 형태 (높은 nucleocytoplasmic 비율)와 식민지의 통로 부분 만 사용. 이것은 잘 성장하고 결국 동질적인 식민지를 얻을 것입니다 적절한 hiPSC 식민지에 대한 선택을 보장합니다. 식민지 같은 ESC의 유도에 전체 시간은 초기 결합 된 미디어를 변경 한 후 15~20일 사이에있다.
  10. 18 게이지 바늘을 사용하여 첫 번째 크로스 해치에 의해 식민지를 모두 GMP 수준의 사후 적출 hiPSCs을 동결. 200 μL의 피펫을 사용하여 해제 모든 조각을 올리고 4 ℃에서 5 분 동안 200 XG에 15 ML 원뿔 유리 병 원심 분리기에 세포를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다.
  11. 세포를 원심 분리하는 동안 차가운 결합 매체 (2)의 같은 부피로 이루어진 7.5 %의 최종 DMSO 농도 매체 냉동 동결 매체를 만든다.
  12. 세포 펠렛 후, 기존 매체를 대기음 및 냉동 매체와 펠렛을 다시 일시 중지 현명한 놓습니다. 즉시 TR동결 튜브에 ansfer와 C의 냉동고 °에서 -80했습니다.

5. 특성화 GMP 수준의 사후 적출 hiPSCs

  1. 3 단계 QPCR 방법론에서 언급 한 다음 키 능성 마커 (SOX2, 인 Oct4, 및 NANOG) 같은 단계를 표 1에 프라이머를 사용하여의 발현을 정량화하는 QPCR를 사용 능성 마커 변환 후 적절한 표현을 보장하기 위해 3 단계에 나열된 같은 단계를 반복합니다.
  2. 사용 이전에 (10)이 발표 한 키트에 나열된 표준 약관에 따라 인간이 아닌 시알 산 Neu5Gc (N -glycolylneuraminic 산)을 감지하는 유동 세포 계측법.
  3. 부드럽게 1X 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 세포를 세포 배양 플레이트를 세척한다.
  4. 실온에서 5 분 동안 1X 해리 시약을 사용하여 콜로니를 떼어 놓다.
  5. 단계 5.4의 5 분의 배양 시간 동안에 설치된 차단 용액 (제조얼음 - 냉각 PBS로 차단제 0.5 %함으로써 키트).
  6. 유동 세포 계측법 분석을위한 튜브의 다음 세트 레이블 : 흠을; 4 ', 6- Diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) DAPI; 대조군 항체 1 : 200; 차 항체 1 : 200; 이차 항체 1 : 200 당나귀 안티 치킨의 IgG (H + L); 샘플 MEFs에; 매트릭스에 샘플 후 절제 세포; 및 샘플 합성 기판에 세포를 포스트 - 절제.
  7. 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브에 솔루션 및 전송 내용을 차단 2 ㎖를 추가하여 단​​계 5.4에서 세포 집합체을 제거. 4 ℃에서 5 분 80 XG에 원심 분리기.
  8. 단계 5.7에 명시된 솔루션과 원심 분리기를 차단로 두 번 세포를 씻으십시오.
  9. 부드럽게 각 해당 항체의 희석 부피 차단 용액 100 ㎕에 약 1 × 106 세포를 다시 일시. 부드러운 1 시간 동안 4 ° C에서 락을 함께 품어.
  10. 단계 5.8에서와 같이 세척을 세 번 반복합니다.
  11. 희석제 니어 400 μL의 세포 펠렛을 다시 일시ffer은 1 (키트에서) : 튜브 2, 6, 7 DAPI 100, 8 단계 5.6 아래에 나열된.
  12. 40 μm의 여과기를 통해 변형 세포와 사이토 흐름을 통해 실행합니다.

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결과

우리 STEMCCA의 렌티 기반 리 프로그래밍 방법을 사용하여 임상 등급 인자없는 hiPSCs를 유도 프로토콜을 제안한다.도 1a는 MEFs에의 층에 STEMCCA 방식으로 재 프로그래밍 후, 세 가지 사전 절개 hiPSC 라인의 대표 사진을 보여준다. STEMCCA 재 프로그래밍 접근 방법의 주요 장점은 다른 연구 그룹 및 위치에, 여러 과학자들에 의해 달성 일관된 재 프로그램의 성공에있다. 그림 1B는 포스트 절제 역전사 중합 효소 연쇄 반응 젤을 선물, 완전 무료입니다 하나의 특정 서브 클론 (2.3)를 표시 STEMCCA의 렌티 바이러스로부터, 특정 시퀀스 STEMCCA.도 2a ​​내인성 특정 앰플 리콘 대역의 부족에 의해 입증되는 바와 같이 합성 행렬에 행렬 및 포스트 절제 이종 프리 GMP 급 hiPSCs를 포함한 이종의 변환 전의 hiPSCs를 도시 . 표준 만능 관련 요인의 정량 (SOX2는 QPCR을 사...

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토론

우리는 인자없는 hiPSCs를 유도하고 미래의 인간 치료제 하류 세포 분화에 대한 GMP 수준의 조건으로 이들 세포를 변환하여이를 임상 적으로 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 종류의 세포에 광범위하게 적용 할 수 있지만, 우리는 인해 환자에서 추출의 용이성과 개인화 된 인간의 치료제에의 적용에 인간 피부 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하기로 결정했습니다. 제한이 임상 적으로 관련된 세포 유도체로 전체 분화로까지 해결할되면 GMP 수준의 조건으로 제시된 변환이 다른 다양한 종류의 세포에 더 많은 관련이 될 것이다, 걱정 (14)이다.

본 연구의 첫 번째 부분은 STEMCCA의 렌티 바이러스와 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그램이 포함됩니다. 이 기술은 인해 재현성, 상대적으로 높은 재 프로그래밍 효율 (0.02 %), 그리고 사람을 통해 재 프로그램하는 강력한 능력을 상당 부분에 선정되었다y를 다른 세포 유형 (10). 이 ...

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공개 사항

James A. Byrne(JAB)과 Agustin Vega-Crespo는 Fibrocell Science, Inc.로부터 연구 자금을 받습니다. JAB는 Fibrocell Science, Inc.의 과학 컨설턴트입니다. 다른 저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.

감사의 글

iPSC 유도 및 특성화 실험을 수행하는 데 도움을 주신 Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, Saravanan Karumbayaram(SK)에게 감사드립니다. iPSC 분석 실험을 수행한 Aaron Cooper; Vittorio Sebastiano와 Renee A. Reijo Pera는 초기 재프로그래밍 작업을 감독했습니다. SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack, Donald B. Kohn은 임상 등급 iPSC의 변환 및 특성화를 허용하는 UCLA GMP 시설의 설립을 지휘했습니다. Gustavo Mostoslavsky는 STEMCCA polycistronic reprogramming 벡터를 제공해 주었습니다. 이 연구는 안전한 맞춤형 세포 치료제를 개발하기 위해 Fibrocell Science 및 CIDMOD(Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives) 이니셔티브와의 연구 협력을 기반으로 합니다. 이 연구는 UCLA의 Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. 및 JAB에 대한 UCLA CTSI Scholar's Award의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
배지 및 시약
DMEM/F12 (basal media)Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)11330057
소 태아 혈청Invitrogen16000044
Minimum essential medium (MEM) 비필수 아미노산 (NEAA), 100xInvitrogen11140050
Glutamax, 100xInvitrogen35050-061
PenStrep, 페니실린-스트렙토마이신, 100xInvitrogen15140-1224°C에서 해동; C, 부분 표본 및 &마이너스에 저장; 20 > C
녹아웃 세럼 교체Invitrogen108280284°C에서 해동; C, 부분 표본 및 &마이너스에 저장; 20 > C
Trypsin/EDTA, 0.5%Invitrogen15400-0541x PBS에서 0.05%로 묽게 재고
GlobalStem (Rockville, MD, USA)GSR-200110 µ로 재구성; 0.1% 소 혈청 알부민에 있는 g/ml 주식은 1x PBS에서 용해되고 &마이너스에 저장한다; 80 > C
β-메르캅토에탄올Millipore (Billerica, MA, USA)ES-007-E
Matrigel (기저막 매트릭스)BD Biosciences (San Jose, CA, USA)35623110ml의 DMEM/F12로 10ml를 얼음 위에서 1:2 희석하여 원료 Matrigel 바이알을 희석합니다. 분취 및 &마이너스에 저장; 20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (Cambridge, MA, USA)04-0012-02
PuromycinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (Basel, Switzerland)4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing mediumLonza (Basel, Switzerland)12-769E
디메틸 설폭사이드시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)D8418
PBS인비트로젠14190-250
100 BP DNA 래더인비트로겐15628019
SYBR 안전 DNA 겔 염색 10,000x인비트로겐S33102
아가로스Bio-Rad Laboratories, Inc. (미국 캘리포니아주 헤라클레스)161-3101
돼지 껍질에서 추출한 젤라틴Sigma-AldrichG1890-100GPBS에서 0.2%로 재고를 만들고 오토클레이브하여 실온에서 보관하십시오.
mTeSR1StemCell Technologies (캐나다 BC 주 밴쿠버)5850보충제 5x를 기본 배지와 결합하고 분취 및 4 °C로 보관; C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다.
Stemedia NutriStem XF / FF 배양 매체줄기05-100-1A4 °C에서 해동; C O/N, 분취 및 4°C에 저장; C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다.
PrimocinInvivoGen (San Diego, CA, USA)ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent)InvitrogenA1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)703-546-155
Polybrene/transfection agentMilliporeTR-1003-G
Plasticware
12-well platesVWR (West Chester, PA, USA)29442-038
6-well platesVWR29442-042
10-cm platesSigma-AldrichZ688819
18-gauge needleFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)148265D
21-gauge needleFisher Scientific14-829-10D
Equipment
BD LSRII 유세포 분석기KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)BD
FACSDiva 버전 6.1.3 소프트웨어BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR KitKAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)KK2601
고순도 RNA 분리 키트Roche11828665001
전사자 First Strand cDNA Synthesis KitRoche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack KitSialix (Newton, MA, USA)Basic Pack
media
Combined media 1StemCell Technologies and Stemgent는 mTeSR1 및 Nutristem
결합 배지 2StemCell Technologies와 StemgentTeSR2 및 Nutristem
HUF 배지Dulbecco로 구성됩니다. s 변형 된 독수리' s medium/F12 [DMEM/F12]에는 10% 소 태아 혈청, 1x 비필수 아미노산, 1x 글루타맥스 및 1x 프리모신
인간 만능 줄기 세포 배지DMEM/F12에 20% 녹아웃 혈청 대체물, 1x 글루타맥스, 1x 비필수 아미노산, 1x 프리모신, 1x &베타;-메르캅토에탄올 및 10ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자.
DMEM/F12, 둘베코' s 변형 된 독수리' s 미디엄/F12; PBS, 인산염 완충 식염수.
는

참고문헌

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