우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기
이 논문에서
요약
초록
유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 렌티 기반 재 프로그래밍 방법론으로 생성 될 수있다. 그러나, 게놈의 적극적 전사 영역에 남아있는 잠재적 발암 유전자의 흔적은 인간의 치료 응용 프로그램 (1)에 사용하기 위해 자신의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 또한, 치료 학적으로 중요한 유도체 줄기 세포 분화 또는 재 프로그래밍 유래의 비 - 인간 항원 인간 임상이 문맥에서 사용되는 이러한 hiPSCs는 배제. 이 비디오에서는, 우리는 재 프로그래밍 및 외래 유전자의 무료 요인이없는 hiPSCs를 분석하는 절차를 제시한다. 이러한 hiPSCs이어서 렌티 바이러스를 포함하는 특정 인트론 유전자 발현의 이상에 대해 분석 할 수있다. 이러한 분석은 이전에 유전자 발현의 차이 (3)를 검출하는 데 덜 민감한 기술 위에 이점을 갖는다 민감한 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 수행 될 수있다. 로 전체 변환임상 등급의 우수 제조 기준 (GMP) 조건, 인간의 임상 적 관련성을 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 제공하는 또 다른 방법이 제공하는 현재의 안전 항구 기준이 확장 인간의 치료 응용 프로그램-을 위해 만기가 인간이 아닌 항원에 어떤 면역 원성의 위험을 제거해야한다 GMP 수준의 hiPSCs를 유도하는 요인이없는 특성화 된 hiPSC 기반의 파생 상품을 포함 할 것이다. 이 프로토콜은 모든 유형의 세포로 재 프로그램 렌티 폭넓게 적용되며, GMP 수준의 조건으로 세포를 재 프로그램을 변환하기위한 재생 가능한 방법을 제공한다.
서론
성인 인간 세포는 4가지 주요 전사 인자의 렌티바이러스 기반 발현의 결과로 후성유전학적 리모델링 및 재프로그래밍을 거칠 수 있는 것으로 나타났습니다4,5. 리프로그래밍(reprogramming) 분야의 중요한 발전은 단백질 발현의 정확한 화학량론적 비율을 가능하게 하는 4개의 재프로그래밍 전사 인자(reprogramming transcription factor)를 모두 수용하는 단일 절제성 렌티바이러스 줄기세포 카세트(STEMCCA)를 사용한 것입니다6. 또한, 감염 범위의 특정 다중성에서 형질도입될 경우, STEMCCA는 재프로그래밍 과정 동안 주로 단일 게놈 통합 사건을 유발할 수 있습니다7. 줄기세포주 유도 후 재프로그래밍 벡터를 절제하는 Cre/loxP 기술을 활용하는 절제 가능한 STEMCCA 버전의 도입으로 무인자 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC) 세포주를 유도할 수 있게 되었습니다8. 또한 hiPSC의 치료 적용을 강화하기 위해 이종 함유 조건에서 이종이 없는 조건으로 GMP(Good Manufacturing Practice) 등급 세포주 변환을 위한 새롭고 빠르며 쉽게 적용할 수 있는 방법론을 구현해야 했습니다. 여기에서는 특히 인트론(intron)에 통합되었을 때 통합된 유전자 발현 차이와 임상....
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프로토콜
주 :.이 방법은 경외 등 (10)에보고 된 연구에 사용 하였다.
STEMCCA 1. 재 프로그래밍 성인 인간 피부 섬유 아세포
- 해동 성인 피부 인간 섬유 아세포 (한국 외대), 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 통로 (4) 이하, 물을 유리 병의 상단 잠수함 않도록주의.
- 15 ML 원뿔 유리 병에 인간 섬유 아세포의 1 ml의 슬러리를 놓고 천천히 드롭 현명한 방식으로, 37 ° C로 미리 예열 표준 HUF 미디어, 4 ml의 배치, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 밖으로 희석하기 다시 중단 세포를.
- 실온에서 10 분 동안 200 XG에서 바이알을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 / ㎖ 100,000 세포 현탁액을 만들 매체의 적절한 볼륨에서 셀을 다시 중단하고 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 2를 가하여, 0.2 % 젤라틴으로 20 분 동안 미리 코팅.
참고 : 라인과 조건에 따라 세포의 동일한 수의 잘 자매 fo를 접종해야R 셀 카운팅 / 감염 (MOI) 계산의 다양성. - 세포를 균일하게 분배하는 전후 좌우하고 판측 락. 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 밤새 ....
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결과
우리 STEMCCA의 렌티 기반 리 프로그래밍 방법을 사용하여 임상 등급 인자없는 hiPSCs를 유도 프로토콜을 제안한다.도 1a는 MEFs에의 층에 STEMCCA 방식으로 재 프로그래밍 후, 세 가지 사전 절개 hiPSC 라인의 대표 사진을 보여준다. STEMCCA 재 프로그래밍 접근 방법의 주요 장점은 다른 연구 그룹 및 위치에, 여러 과학자들에 의해 달성 일관된 재 프로그램의 성공에있다. 그림 1B는 포스트 절제 역전사 중합 효소 연쇄 반응 젤을 선물, 완전 무료입니다 하나의 특정 서브 클론 (2.3)를 표시 STEMCCA의 렌티 바이러스로부터, 특정 시퀀스 STEMCCA.도 2a 내인성 특정 앰플 리콘 대역의 부족에 의해 입증되는 바와 같이 합성 행렬에 행렬 및 포스트 절제 이종 프리 GMP 급 hiPSCs를 포함한 이종의 변환 전의 hiPSCs를 도시 . 표준 만능 관련 요인의 정량 (SOX2는 QPCR을 사.......
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토론
우리는 인자없는 hiPSCs를 유도하고 미래의 인간 치료제 하류 세포 분화에 대한 GMP 수준의 조건으로 이들 세포를 변환하여이를 임상 적으로 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 종류의 세포에 광범위하게 적용 할 수 있지만, 우리는 인해 환자에서 추출의 용이성과 개인화 된 인간의 치료제에의 적용에 인간 피부 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하기로 결정했습니다. 제한이 임상 적으로 관련된 세포 유도체로 전체 분화로까지 해결할되면 GMP 수준의 조건으로 제시된 변환이 다른 다양한 종류의 세포에 더 많은 관련이 될 것이다, 걱정 (14)이다.
본 연구의 첫 번째 부분은 STEMCCA의 렌티 바이러스와 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그램이 포함됩니다. 이 기술은 인해 재현성, 상대적으로 높은 재 프로그래밍 효율 (0.02 %), 그리고 사람을 통해 재 프로그램하는 강력한 능력을 상당 부분에 선정되었다y를 다른 세포 유형 (10). 이 .......
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공개 사항
James A. Byrne(JAB)과 Agustin Vega-Crespo는 Fibrocell Science, Inc.로부터 연구 자금을 받습니다. JAB는 Fibrocell Science, Inc.의 과학 컨설턴트입니다. 다른 저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.
감사의 글
iPSC 유도 및 특성화 실험을 수행하는 데 도움을 주신 Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, Saravanan Karumbayaram(SK)에게 감사드립니다. iPSC 분석 실험을 수행한 Aaron Cooper; Vittorio Sebastiano와 Renee A. Reijo Pera는 초기 재프로그래밍 작업을 감독했습니다. SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack, Donald B. Kohn은 임상 등급 iPSC의 변환 및 특성화를 허용하는 UCLA GMP 시설의 설립을 지휘했습니다. Gustavo Mostoslavsky는 STEMCCA polycistronic reprogramming 벡터를 제공해 주었습니다. 이 연구는 안전한 맞춤형 세포 치료제를 개발하기 위해 Fibrocell Science 및 CIDMOD(Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives) 이니셔티브와의 연구 협력을 기반으로 합니다. 이 연구는 UCLA의 Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. 및 JAB에....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 배지 및 시약 | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| 소 태아 혈청 | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) 비필수 아미노산 (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, 페니실린-스트렙토마이신, 100x | Invitrogen | 15140-122 | 4°C에서 해동; C, 부분 표본 및 &마이너스에 저장; 20 > C |
| 녹아웃 세럼 교체 | Invitrogen | 10828028 | 4°C에서 해동; C, 부분 표본 및 &마이너스에 저장; 20 > C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | 1x PBS에서 0.05%로 묽게 재고 |
| GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | 10 µ로 재구성; 0.1% 소 혈청 알부민에 있는 g/ml 주식은 1x PBS에서 용해되고 &마이너스에 저장한다; 80 > C | |
| β-메르캅토에탄올 | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (기저막 매트릭스) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | 10ml의 DMEM/F12로 10ml를 얼음 위에서 1:2 희석하여 원료 Matrigel 바이알을 희석합니다. 분취 및 &마이너스에 저장; 20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스) | D8418 | |
| PBS | 인비트로젠 | 14190-250 | |
| 100 BP DNA 래더 | 인비트로겐 | 15628019 | |
| SYBR 안전 DNA 겔 염색 10,000x | 인비트로겐 | S33102 | |
| 아가로스 | Bio-Rad Laboratories, Inc. (미국 캘리포니아주 헤라클레스) | 161-3101 | |
| 돼지 껍질에서 추출한 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G1890-100G | PBS에서 0.2%로 재고를 만들고 오토클레이브하여 실온에서 보관하십시오. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (캐나다 BC 주 밴쿠버) | 5850 | 보충제 5x를 기본 배지와 결합하고 분취 및 4 °C로 보관; C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. |
| Stemedia NutriStem XF / FF 배양 매체 | 줄기 | 05-100-1A | 4 °C에서 해동; C O/N, 분취 및 4°C에 저장; C를 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII 유세포 분석기 | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)BD | ||
| FACSDiva 버전 6.1.3 소프트웨어 | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| 고순도 RNA 분리 키트 | Roche | 11828665001 | |
| 전사자 First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | 는 mTeSR1 및 Nutristem | |
| 결합 배지 2 | StemCell Technologies와 Stemgent | TeSR2 및 Nutristem | |
| HUF 배지 | Dulbecco로 구성됩니다. s 변형 된 독수리' s medium/F12 [DMEM/F12]에는 10% 소 태아 혈청, 1x 비필수 아미노산, 1x 글루타맥스 및 1x 프리모신 | ||
| 인간 만능 줄기 세포 배지 | DMEM/F12에 20% 녹아웃 혈청 대체물, 1x 글루타맥스, 1x 비필수 아미노산, 1x 프리모신, 1x &베타;-메르캅토에탄올 및 10ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자. | ||
| DMEM/F12, 둘베코' s 변형 된 독수리' s 미디엄/F12; PBS, 인산염 완충 식염수. |
참고문헌
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al.
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재인쇄 및 허가
