여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.
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방법 논문
생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석
이 논문에서
요약
초록
수초가 뉴런 및 신경교 세포 미엘린 형성을 모두 포함 복잡한 과정이며, 말초 신경계 (PNS)의 중추 신경계 (CNS) 및 희소 돌기 아교 세포에 슈반 세포. 우리는 시험 관내 수초 분석, 시험 관내에서 중추 신경계 수초를 연구하기위한 설립 된 모델을 사용하고 있습니다. 이를 위해서는, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 (개 OPC)는 myelinating 공동 배양을 형성하는 정제 된 차 설치류 후근 신경절 (DRG) 뉴런에 추가된다. 희소 돌기 아교 세포에 의해 발현 특정 단백질이 수초에 가하는 것을 구체적 역할을 심문하기 위해 우리는 선택적 DRG 뉴런 상에 파종 전에 야생형, 구성 적으로 활성 또는 우성 네거티브 단백질을 과발현하는 렌티 바이러스를 사용하여 OPC를 형질 도입 프로토콜을 개발했다. 이것은 우리가 구체적으로 수초를 조절하는 이러한 oligodendroglial 단백질의 역할을 심문 할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 OT의 연구에 적용 할 수있다그녀의 세포 유형은, 이와 같은 시그널링 및 보상 메커니즘의 연구를위한 표적 올리고 덴드로 사이트 등의 원하는 세포 유형에 의해 발현 된 단백질의 선택적 조작을 허용하는 방법을 제공한다. 결론적으로, 렌티 바이러스 감염과 OPC에 수초 관내 분석을 결합하는 수초 형성에 관여하는 분자 메커니즘의 분석을위한 전략적인 도구를 제공한다.
서론
축삭 수초는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 활동 전위의 신속하고 효율적인 전송을 위해 중요하다. 전문화 된 세포, 슈반 세포는 중추 신경계 및 말초 신경계에서 희소 돌기 아교 세포, 랩 어라운드 및 미엘린에 ensheathe 축삭 신경 효과적으로 절연막과 도약적인 도통 한 용이. 수초의 방법은 신경절 뉴런이 설계, 나노 파이버 3 또는 4 슈반 세포 또는 희소 돌기 아교 세포 중 5-7와 공 배양 후근 신경절 신경 세포를 사용하여 시험 관내에서 연구 될 수있다. 시험 관내 분석은 수초 신경계 수초 형성을 연구 확립 모델이며 생체 5-8에서 수초 동안 발생할 근본적인 많은 프로세스를 복제. 분석은 C에 대한 개 OPC와 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런의 정제 인구의 공 배양을, (포함NS의 수초) 또는 슈반 세포 (PNS의 수초 용). 특정 조건에서 이러한 myelinating 세포는 생체에 존재하는 수초 특정 단백질의 같은 보완을 표현 세포막을 절연의 주문, 매우 구조적으로 검증, 다중 층상 시트 DRG 축삭을 ensheathe.
시....
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프로토콜
참고 : 본 연구에 사용 된 모든 동물 혼합 성별이었고, 해부학 및 병리과의 동물 시설 및 멜버른 대학에서 신경 과학 및 정신 건강 연구의 플로리 연구소에서 사육. 모든 동물의 절차는 멜버른 대학에서 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다.
2K7 Lentivector 1. 복제
- 2K7의 렌티 바이러스 벡터에 목적 유전자를 클로닝하기 전에 표준 분자 기법을 사용하여 11 pENTR 벡터 (3637 BP, 카나마이신 내성)로 유전자를 서브 클로닝. 서브 클로닝의 EcoRI 및 SacII 제한 사이트를 사용합니다.
- 2K7 Lentivector의 증폭
- 부드럽게 적격 세포와 플라스미드 DNA 100 ng를 혼합함으로써 2K7의 lentivector의 DNA를 변화시키고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
- 열 충격은 DNA / 적격 세포를 90 초 동안 42 ° C에서 혼합 ampici 모두 포함하는 LB 한천 플레이트에 그 판형LLIN (100 ㎍ / ㎖), 16 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 클로람페니콜 (15 ㎍ / ㎖).
주 : 클로람페니콜이 긴 말단 반복간에 재결합을 방지하기 위해 사용된다. - ....
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결과
플래그 태그가 세포 외 신호 관련 키나제 1 (플래그-ERK1) 효소 2K7의 구조와 바이러스 생산에 필요한 포장 및 액세서리 구조를 모두 포함하여 사용하는 구조,의 소화 제한에 의해 확인 렌티 바이러스 생산에 사용되는 구조 (그림 3) .
그림 3 : DNA 구조 확인. 렌티 바이러스 생산을 위해 필요한 모든 DNA 작 제물은 세균 Stbl3 정제하고 제한 효소 다이제스트에 의해 확인되었다. 액세서리 및 패키징 벡터를 표시하고, 도련 플라스미드 (A)에 비하여,을 NcoI 및 EcoRI로 분해 하였다. 2K7-GFP를 SpeI와 SacII은 (A)로 절단 하였다........
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토론
축삭의 수초는 척추 동물의 중추 및 말초 신경계 양쪽의 최적의 기능을위한 중요한 과정이다. 유수 축삭의 생성 및 유지 보수와 세포 외 기질 단백질 (슈반 세포 나 희소 돌기 아교 세포)에서 분자 신경 세포 사이의 상호 작용, 아교를 포함하는 복잡하고 조정하는 과정입니다. 이 프로토콜의 의미 및 적용은 혼합 공 배양 설정 내의 하나의 특정 세포 유형에서 단백질의 조작을 허용한다는 것이다. 여러 세포 유형은 특정한 단백질의 활성을 차단하는 무딘 약리학 도구를 사용하여 생체 내 및 시험 관내 수초 분석에서 양쪽 수초에 관여 또는 신호 전달 경로 단백질은 하나의 연결에서 수초에 가하는 것을 영향에 대한 특정 정보를 제공 할 수없는 또는 신경교 관점 단백질 고유 한 세포 유형에 의해 발현되지 않는. 따라서, 시험 관내 수초로서oligodendroglial 단백질이 수초에 발휘하는 효과를 심문 할 수있게 해준다 구체적으로 OPC를 형질 도입하는 렌티 바이러스의 사용과 함께 말한다. 우리는 .......
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공개 사항
저자는 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회(NHMRC 펠로우십 #454330 to JX, 프로젝트 보조금 #628761 SM에, APP1058647 to JX), 다발성 경화증 연구 호주(MSRA #12070 to JX), 멜버른 대학교 연구 보조금 지원 제도 및 멜버른 연구 CI 펠로우십 JX에 대한 멜버른 연구 CI 펠로우십, HP 및 AF에 대한 호주 대학원 장학금의 지원을 받았습니다. 우리는 의 운영 인프라 계획에 감사드립니다. 호주 빅토리아 혁신, 산업 및 지역 개발부.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 2K7 렌티벡터 | Dr Suter의 친절한 선물9 | ||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100mg | |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG | Jackson Immunoresearch | 115545205 | |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG (H + L) | Life Technologies | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgG (H + L) | Life Technologies | A11005 | |
| Alexa Fluor 594 염소 안티-토끼 IgG (H+L) | Life Technologies | A11012 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518-5G | |
| B27 - NeuroCul SM1 뉴런 보충제 | 줄기세포 기술 | 5711 | |
| BDNF (Human) | Peprotech | PT450021000 | |
| Biotin (d-Biotin) | Sigma Aldrich | B4639 | |
| Bradford 시약 | Sigma Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | 시그마 Aldrich | A4161 | |
| 클로람페니콜 | 시그마-알드리치 | C0378-100G | |
| CNTF | Peprotech | 450-13020 | |
| DAKO 형광 장착 매체 | DAKO | S302380-2 | |
| DMEM, 고포도당, 피루브산, 글루타민 없음 | Life Technologies | 10313039 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-375KU | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| DPBS, 칼슘, 마그네슘 | Life Technologies | 14040182 | |
| EBSS | Life Technologies | 14155063 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101 | |
| 모터 및 관심 | |||
| 소 태아 혈청 | 시그마-알드리치 | 12003C | |
| 포스콜린 | Sigma Aldrich | F6886-50MG | |
| 글루코스 (D-글루코스) | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| 글리세롤 | 화학 공급 | GL010-500M | 재고 솔루션 보기 |
| 염소 안티-마우스 IgG | Jackson ImmunoResearch | 115005003 | |
| 염소 안티-마우스 IgM | Jackson ImmunoResearch | 115005020 | |
| Goat Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | 112005167 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Igepal | Sigma Aldrich | I3021-100ML | |
| 인슐린 | 시그마 알드리치 | I6634 | |
| 카나마이신 | 시그마-알드리치 | 60615 | |
| 라미닌 | Life Technologies | 23017015 | |
| LB Medium | 재고 솔루션 보기 | ||
| LB-Agar | 재고 솔루션 보기 | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-7477 | |
| Leibovitz의 L-15 Medium | Life Technologies | 11415064 | |
| L-글루타메이트 | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| L-글루타민- 200 mM (100x) 액체 | Life Technologies | 25030081 | |
| LR Clonase II Plus 효소 | Life Technologies | 12538-120 | |
| MEM, NEAA, 글루타민 | 없음 Life Technologies | 10370088 | |
| Mouse α β III 튜불린 | Promega | G7121 | |
| 마우스 & 알파; MBP (monoclonal) | Millipore | MAB381 | |
| Na 피루브산염 | Life Technologies | 11360-070 | |
| NAC | Sigma Aldrich | A8199 | |
| NcoI-HF | NEB | R3193S | |
| NEBuffer 4 | NEB | B7004S | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| NGF (마우스) | Alomone Labs | N-100 | |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | |
| O1 항체 - 마우스 anti-O1 | Millipore | MAB344 | O1 하이브리도마 세포를 사용할 수 없는 경우 대안 |
| O1 하이브리도마 세포 | O4 항체 면역에 사용되는 항-O1 항체를 함유한 조건화된 배지 | ||
| O4 항체 - 마우스 anti-O4 | Millipore | MAB345 | O4 하이브리도마 세포를 사용할 수 없는 경우 대안 |
| O4 하이브리도마 세포 | 판닝에 사용되는 항-O4 항체를 함유한 컨디셔닝 배지 | ||
| Life Technologies | A10460 | ||
| One Shot Stbl 유능 세포 | Life Technologies | C7373-03 | |
| Papain Suspension | Worthington/Cooper | LS003126 | |
| pBR8.91 | Dr Denham10 | ||
| PDGF-AA (Human) | Peprotech | PT10013A500 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 100x 솔루션 | Life Technologies | 15140122 | |
| pENTRY4IRES2GFP | Invitrogen | 11818-010 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| 폴리-D-라이신 | 시그마 | P6407-5MG | |
| 폴리에틸렌 (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727-100ML | |
| 폴리-L-오르니틴 | 시그마 알드리치 | P3655 | |
| 프로게스테론 | Sigma Aldrich | P8783 | |
| 프로테아제 억제제 정제 (완전한 미니) | Roche | 11836153001 | |
| Proteinase K | 클로나제 효소 | ||
| Putrescine | Sigma Aldrich | P-5780 | |
| Rabbit α 신경필라멘트 | Millipore | AB1987 | |
| 토끼 &알파; MBP (polyclonal) | Millipore | AB980 | |
| Ran2 하이브리도마 세포 | ATCC | TIB-119 | 면역 판닝에 사용되는 항-Ran2 항체를 함유한 조절 배지 |
| Rat anti CD140A/PDGFRa 항체 | BD Pharmingen | 558774 | |
| SacII | NEB | R0157 | |
| SOC 배지 | 유능한 박테리아 | ||
| 와 함께 공급셀렌산나트륨 | Sigma Aldrich | S5261 | |
| Spe I | NEB | R0133S | |
| T4 DNA 리가제 | NEB | M0202S | |
| T4 DNA 리가아제 버퍼 | NEB | B0202S | |
| TE 버퍼 pH8 | 재고 솔루션 보기 | ||
| TNE 용해 버퍼 | |||
| 트레이스 원소 B | Cellgro | 99-175-CI | |
| 트랜스페린 (apo-트랜스페린 인간) | 시그마-알드리치 | T1147 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T9284 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9201-1G | |
| Trypsin 억제제 닭 달걀 흰 | Roche | 10109878001 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 페놀 레드 (0.05%) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Unconjugated Griffonia Simplicifolia Lectin BSL-1 | Vector laboratories | L-1100 | |
| 우리딘 | 시그마-알드리치 | U3003-5G |
참고문헌
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelinati....
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재인쇄 및 허가
