방법 논문

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

DOI:

10.3791/52182

⸱

2014년 11월 27일

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

이 논문에서

요약

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점막 수준에서의 병원체와 면역 방어의 생체 내 시공간 상호 작용은 기존 척추동물 숙주에서 쉽게 이미지화되지 않습니다. 여기에 제시된 방법은 어린 제브라피쉬의 부레를 감염 부위로 사용하여 살아있는 척추동물의 점막 칸디다증을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼을 설명합니다.

초록

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점막 병원균에 대한 초기 방어는 상피 장벽과 선천성 면역 세포로 구성됩니다. 모두의 immunocompetency, 그들의 상호는 감염에 대한 보호를 위해 매우 중요하다. 병원체와 상피 및 선천성 면역 세포의 상호 작용은 가장 복잡한 문제는 시간과 공간에 펼쳐지는 생체 내에서 조사하고 있습니다. 그러나, 기존 모델은 점막 수준에서 병원균과 전투의 쉬운 공간 - 시간 영상을 허용하지 않습니다.

여기에 개발 된 모델은 청소년 제브라 피쉬의 swimbladder에 곰팡이 병원균, 칸디다 알비 칸스의 직접 주입하여 점막 감염을 만듭니다. 얻어진 감염 질환의 점막 상피에 걸쳐 개발 및 선천성 면역 세포 행동의 고해상도 영상화를 가능하게한다. 이 방법의 다양성은 산도로 이어지는 면역 이벤트의 상세한 순서를 조사하기 위해 호스트의 심문을 허용agocyte 모집 특정 세포 유형과 보호 분자 경로의 역할을 조사하고. 또한, 면역 공격의 함수로서 병원체의 동작은 형광 단백질 발현을 C. 동시에 사용하여 묘화 될 수 알비 칸스. 호스트 병원체 상호 작용의 증가 된 공간 해상도는 설명 빠른 swimbladder 해부 기술을 사용하는 것도 가능하다.

여기에 기재된 점막 감염 모델은 점막 칸디다증의 연구를위한 가치있는 도구 만드는 간단하고 높은 재현성이다. 이 시스템은 또한 일반적으로 상피 표면을 통해 감염, 마이코 박테리아 세균 또는 바이러스 성 미생물로 다른 점막 병원균에 광범위하게 번역 될 수있다.

서론

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점막 감염은 병원체가 전신 환경에 접근할 수 있도록 하는 상피 장벽의 손상으로 인해 생명을 위협하는 혈류 감염으로 이어질 수 있습니다1,2. 또한 점막 감염은 외부에 격리되어 있더라도 심각한 면역 병리를 유발할 수 있습니다3-5. 공생 단세포 곰팡이 Candida albicans는 구강 및 기타 점막 부위의 대다수 개체군에 존재합니다6-9. 일반적으로 선천성 면역 및 적응 면역 반응에 의해 억제되지만, 선천성 면역 결함 및 의학적 개입은 심각한 점막 칸디다증으로 이어질 수 있습니다. 상피 장벽에 대한 공격은 면역 병리뿐만 아니라 생명을 위협하는 전파 질환의 위험을 증가시키며, 외음부-질 칸디다증의 경우, 추가로 C. albicans의 집락화는 폐 면역 항상성과 관련이 있습니다10,11. 파종성 칸디다증은 현재 중환자실12에서 네 번째로 흔한 혈류 감염이며 사망률이 40%에 달해 주요 우려 사항입니다. 자가면역 질환, 암 또는 장기 이식 환자에 대한 면역 조절 치료가 증가함에 따라 이 병원체와 점막 면역 구획 간의 상호 작용을 이해하는 것이 필수적입니다.

점막 수준에서 C. albicans-cell ....

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프로토콜

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참고 : 모든 제브라 피쉬의 치료 프로토콜과 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 A2012-11-03에서 NIH의 지침에 따라 수행되었다.

4 일 포스트 시비 1. Zebrafish의 양육

  1. 다른 동영상 34에 도시 된 바와 같이, 제 3 시간 포스트 시비 내에 AB 제브라 피쉬, 또는 다른 형질 전환 계통 모아서.
  2. (0.17 mM의 KCl을 0.33 mM의 염화칼슘이 0.33 mM의의 MgCl 2, 2 mM의 HEPES, pH가 6.8 5 mM의 NaCl을) 메틸렌 블루 (0.3 ㎍ / ml의 최종 E3 미디어 150 ㎖를 포함하는 15cm 페트리 접시에 120 알을 품어 12/12 / 암 광주와 33 ° C 배양기에서 농도).
  3. E3 + PTU (1- 페닐 -2- 티오, 10 ㎍ / ml의 최종 농도)와 6 시간 후 용지를 교체하고 죽은 계란을 제거합니다.
  4. 이일 후 신선한 E3 + PTU와 미디어를 교환, 33 ° C에서 4 일 동안 품어.

2.에서켜졌 마이크로 니들 준비

  1. 다음 설정을 사용하여 바늘 풀러를....

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결과

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후방 swimbladder에 미세 주입

여기에 제시된 실험 방법은 C의 일관된 용량의 주입을 설명 제브라 피쉬 DPF 4의 swimbladder에서 알비 칸스의 효모 세포. 침지 모델과 이전 작업 제안이 C.에 swimbladder 면역 반응 알비 칸스 (Candida albicans)는 포유류의 점막 칸디다증 (32)와 유사하다. 여기에서 우리는 더 간단 재현하고 빠르다 수정 감염 방법을 보여; 제브라 피쉬의 수백 주입하고 몇 시간 내에 검사를 할 수 있습니다.

swimbladder의 정확하고 재현성있는 감염은 미세 주입하여 기관의 후방 지역을 대상으로하여 수행됩니다. swimbladder에 주입 애벌레 또는 배아 제브라 피쉬 (예를 들어, 정맥 또는 후뇌 뇌실)에 대한 대부분의 다른 미세 주입 경로보다 배우기 쉽다. 주입 전에 .......

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토론

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swimbladder의 미세 주입 질환 모델의 발전과 한계

여기에 제시된 모델은 Gratacap 등에 설명 된 점막 칸디다증 침수 모델의 확장이다 (2013).; 이는 제어 된 감염 시간의 장점, 높은 재현성 감염 도즈, 따라서 효율 향상을 추가한다. 우리는 여기서 비 침습적 훌륭한 세부 사항에 감염 역학의 시간적 문서뿐만 아니라 swimbladder의 높은 해상도 생체 이미징을 허용하는 새로운 방법을 보여줍니다. 이러한 절차는 C의 연구를 촉진한다 알비 칸스 (Candida albicans)은 점막에 면역 체계의 상호 작용의 역 동성을 -innate. 점막 감염 모델의 제한된 수 제브라 설명되었지만, 모든 소화관 장해 / 감염 24,43 한정. 여기에 제시된 swimbladder 모델은 폐에 약간의 유사성을 공유하고 밀폐 된 사이트를 제공하는 기관에 감염의 사이트를 확장병원균 덜 .......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 아낌없이 α-catenin의를 제공하기 위해 박사 르 트린 박사 토빈 감사 : 황수정 물고기 라인과 빌 잭맨 우리 자신의 실험실에서 촬영을 할 수 있도록합니다. 저자는 자금 출처 국립 보건원 (보조금 5P20RR016463, 8P20GM103423 및 R15AI094406)과 USDA 인정 (프로젝트 # ME0-H-1-00517-13). 이 원고는 주요 농업 및 임업 실험 역 게시 번호 3371로 게시됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.7ml 튜브AxygenMCT-175-C
딥 페트리 접시Fisher Scientific89107-632
전사 피펫Fisher Scientific13-711-7M
효모 추출물VWR Scientific90000-726
펩톤VWR Scientific90000-264
포도당Fisher ScientificD16-1
한천VWR Scientific90000-760
파인 트위저 (Dumont Dumoxel #5)파인 사이언스 도구11251-30
나무 다웰VWR Scientific10805-018
저용융 아가로스VWR Scientific12001-722
플레이밍 브라운 마이크로피펫 풀러셔터 InstrumentsP-97
붕규산 모세관Sutter InstrumentsBF120-69-10
MPPI-3 주입 시스템응용 과학 계측MPPI-3
배압 장치응용 과학 계측BPU
마이크로 피펫 홀더 키트응용 과학 계측MPIP
풋 스위치응용 과학 계측FSW
Micromanipulator응용 과학 계측MM33
자기베이스응용 과학 계측마그네틱 베이스
트리카인 메탄 설포네이Western Chemical Inc.MS-222
해부 현미경올림푸스SZ61 상단 SZX-ILLB2-100 기본
컨포칼 현미경올림푸스IX-81 FV-1000 레이저 스캐닝 컨포칼 시스템
20X 현미경 대물올림푸스UPlanSApo 20x/0.75
롤러 드럼New Brunswick ScientificTC-7
마이크로로더 피펫 팁Eppendorf930001007
Glass culture tube (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (코닝)VWR ScientificBDH4520-500GP
어린이 점토 (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
메틸렌 블루VWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
페트리 접시Fisher ScientificFB0875712
혈구계 ( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
Type A immersion oilBlue Marble Products51935
CentrifugeEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
낚싯줄Stren
96 웰 이미징 플레이트(Sensoplate)Greiner Bio-One655892
고진공 그리스(다우코닝)VWR Scientific59344-055
마이크로슬라이드(25 x 75mm)VWR Scientific48300-025
커버 슬립(18 x 18mm), No 1.5VWR Scientific48366-045
15cm 페트리 접시(올림푸스 플라스틱)Genesee Scientific32-106
글리세롤(EMD 화학)VWR ScientificEMGX0185-5
24웰 배양 접시(올림푸스 플라스틱)Genesee Scientific25-107
웨이트 보트 (8.9 cm)VWR Scientific89106-766
트 렌즈

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the ....

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