방법 논문

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

DOI:

10.3791/52184

⸱

2014년 12월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CREA, Diagnostics Department, Spedali Civili di Brescia

이 논문에서

요약

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여기에서는 T-세포 수용체 절제원(TREC)과 K-삭제 재조합 절제원(KREC)을 동시에 정량화하는 방법을 설명합니다. TREC/KREC 분석은 흉선 및 골수 배출량의 마커로 사용할 수 있습니다.

초록

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T-cell receptor excision circles (TREC) 및 K-deleting recombination excision circles (KREC)는 T-cell 및 B-cell receptor를 생성하는 재조합 과정에서 형성되는 원형화된 DNA 요소입니다. TREC과 KREC는 복제할 수 없기 때문에 각 세포 분열 후에 희석되어 세포에 남아 있습니다. 말초 혈액 내 이들의 양은 흉선 및 골수 배출량의 추정치로 간주될 수 있습니다. 잘 정립되고 일반적으로 사용되는 TREC 분석과 수정된 버전의 KREC 분석을 결합하여 단일 분석에서 새로 생성된 T 및 B 림프구를 모두 정량화할 수 있는 이중 정량 real-time PCR을 개발했습니다. TRECs 및 KREC의 수는 박테리아 플라스미드에 복제된 TREC 및 KREC 신호 관절을 참조 유전자 역할을 하는 T 세포 수용체 알파 상수 유전자 단편과 함께 연속으로 희석하여 준비된 표준 곡선을 사용하여 얻어집니다. 결과는 TRECs 및 KRECs/106 세포 수 또는 혈액 ml당 보고됩니다. 이러한 DNA 단편의 정량화는 소아와 성인 모두에서 골수 이식 후 면역 재구성을 모니터링하고, 면역 결핍의 특성을 개선하거나, 특정 면역 조절 약물 활성에 대한 이해를 개선하는 데 유용한 것으로 입증되었습니다.

서론

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T 세포 수용체 절제 원 (TRECs) 및 K-삭제 재조합 절제 원 (KRECs)는 게놈 DNA 재조합 과정 T- 각각 B-세포의 비율로 절제되어 작은 원형으로 DNA 요​​소이다 선도 매우 다양한 레퍼토리의 T- 및 B- 세포 수용체의 형성. 이들은 어떤 기능이 없지만, 그들이 안정되고 복제 될 수 없기 때문에, 따라서 그들은 단지 두 개의 딸 세포 중 하나로 지속 각 세포 분열 후에 희석된다. 따라서, 말초 혈액에서의 수준은 흉선 및 골수의 출력 추정값으로서 가정 될 수있다.

TREC 분석은 주로 흉선 출력의 정도를 평가하기 위해 지난 15 년 동안 사용되었지만, 초기에 개발 된 1 KREC 분석은 B 세포의 증식 및 건강과 질환에서의 B 세포의 항상성에 기여 2 측정 최근 골 m의 마커로서 제안되었다출력 화살표. 3,4 여기, 우리는 우리가 TRECs과 KRECs 모두의 동시 정량을 위해 개발 된 방법을 설명합니다. (4)

이 조합 된 방법으로, 실시간 PCR에 의해 DNA 정량 연관된 가변성 TRECs, KRECs 및 T 세포 수용체 알파 상수의 단편을 함유하는 트리플 삽입 플라스미드를 희석 한 고유의 ....

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프로토콜

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참고 : 윤리 문 :이 프로토콜은 우리의 기관, Spedali Civili 디 브레시아의 지침을 다음과

"트리플 삽입"플라스미드 1. 준비

  1. 선택 및 적절한 출발 물질의 제조 :
    1. 이러한 EDTA 튜브에 수집 젊은 건강한 피사체의 말초 혈액으로 PCR에 의해 검출 TRECs과 KRECs을 발생할 가능성이 매우 높습니다 세포를 포함하는 샘플을 얻습니다.
      주 : 원래 우리 KRECs위한 편도선 단편으로부터 TRECs 및 단핵 세포에 대한 흉선 세포를 이용하는 방법을 개발했지만, 정상인 보통 TRECs 및 PCR에 의해 그 검출을 허용하기에 충분한 양의 KRECs있다. 따라서, 말초 혈액 구하기과 함께 작동하도록 쉽게 유효한 대안이어야한다. 하지 않을 경우 TRECs는, 특히, 어린이, 젊은 성인에서 건강한 성인에서 연령, 말초 혈액으로 감소 점을 감안 좋습니다.
    2. 별도의 말초 혈액 mononuc표준 밀도 구배 분리법에 의해 리어 세포 (PBMC).
  2. DNA 추출 :
    1. 상업 DNA 혈액 미니 ​​키트를 사용 PBMC에서 DNA를 추출합니다. 아래에 설명 된 몇 가지 수정을 제조업체의 지침을 따르십시오.
      1. 1,400 rpm에서 ....

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결과

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분석은 87 건강한 대조군의 대표 샘플에서 수행 하였다 : (42) 어린이는 0 세 - 17 (남성 / 여성 : 17분의 25)와 24 세 (45) 성인 - 60 (남성 / 여성 : 16분의 29)을. 결과를 계산 하였다 TRECs 10 6 PBMC 당 KRECs 후 혈액 1 ㎖ 당과 TRECs KRECs로서 수득 하였다.

4 년 - TRECs의 수는 인해 0-3 매우 날카로운 방식으로 특히 흉선 퇴화, 4 세 감소한다. 그것은 여성보다 남성에게 더 빠르게 감소하기 때문 성인에서, TREC 번호도 성별에 의존한다. (5)이, 연령 및 가능 성별에 기초하여 차별화 매우 정밀한 경우되어야 적절한 참고 범위를 설정하는 문제를 생성 할 수있다 정상의 추정이 필요하다.

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토론

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TREC 및 KREC 정량화는 몇 가지 주의 사항을 고려하는 경우 최근의 흉선 및 골수 출력에 대한 좋은 추정치로 간주될 수 있습니다. 표준 곡선을 사용하는 절대 정량 분석법은 Real-Time PCR 반응 플레이트에 더 많은 시약과 더 많은 공간이 필요하지만 알려진 양의 출발 물질을 기반으로 구축된 표준 곡선에서 알려지지 않은 샘플 양을 보간하기 때문에 매우 정확한 정량 결과를 보장합니다. 또한 이 방법은 적은 양의 표적을 감지하는 데 더 적합합니다. 방법론적 관점에서 중요한 점은 표준 곡선 점에 해당하는 냉동 플라스미드 희석액이 예상보다 빨리 분해될 수 있다는 것입니다. 이를 위해서는 각 실험 절차 전에 원래 저장된 플라스미드의 새로운 희석액, 특히 가장 희석된 플라스미드를 준비해야 합니다. 최종 계산에서 PBMC 양의 추정치로서 림프구와 단핵구 수 사이의 완전하지 않은 동등성은 106 당 표현된 값과 혈액 ml당 표현된 값 사이의 변환에 약간의 편향을 추가할 수 있습니다. 전혈에서 직접 추출한 알려진 양.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 인정하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Histopaque-1077Sigma Aldrich SRL10771-500 ML밀도 그라디언트 분리 방법
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)QIAGEN51106DNA 추출
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba 시약 S.r.l 동결건조된 생성물을 100 pmol/µ로 재현탁; l
AmpliTaq DNA 중합효소: 10x Buffer II 및 25 mM MgCl2Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)포함Applied Biosystems/Life-TechnologiesN8080261
Topo TA 클로닝 키트for Subcloning Invitrogen/Life-TechnologiesK4500-01
XL1-Blue 서브클로닝 등급 역량 세포Stratagene200130
PureYield 플라스미드 미니프렙 시스템PromegaA1223
SpeI 500U뉴잉글랜드 바이오랩스R0133S
HindIII-HF 10,000 U뉴잉글랜드 바이오랩스R3104S
퓨어일드 플라스미드 미디프렙 시스템프로메가A2492
XhoI 5,000 U뉴잉글랜드 바이오랩스R0146S
TRIS UtrapureSigma Aldrich SRLT1503
EDTA Sigma Aldrich SRLE5134
TE 완충액 (1 mM TRIS 및 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems/Life-Technologies4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmolEurofins MWG Operon/Carlo Erba 시약 S.r.l 동결건조된 생성물을 100 pmol/µ로 재현탁; l
NanoDrop 2000c 분광 광도계ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerApplied Biosystems/Life-Technologies4359659
Fast 7500 Real-Time PCR systemApplied Biosystems/Life-Technologies
SDS 염기서열 검출 소프트웨어 1.4Applied Biosystems/Life-Technologies

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
  2. Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication hist....

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재인쇄 및 허가

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TREC KREC QuantificationReal time PCR AssayT cell Receptor Excision CirclesK deleting Recombination Excision CirclesThymic Bone Marrow OutputDuplex Quantitative PCRStandard Curve PreparationPeripheral Blood Mononuclear CellsTCR Alpha Constant GeneImmune Reconstitution Monitoring

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