이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

21.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52199

⸱

2014년 12월 23일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University, 3Department of Exercise Science, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University

이 논문에서

요약

주기적 산 쉬프 염색은 조직의 다당류 함량을 시각화하는 기술입니다. 이 기사는 인간 정맥혈에서 정제된 말초 혈액 단핵 세포에 사용하도록 조정된 주기적인 산 Schiff 염색 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 샘플은 림프구와 면역 체계의 다른 백혈구를 위해 풍부합니다.

초록

PAS(Periodic acid Schiff) 염색은 근육 생검 및 혈액 샘플의 진단 도구로 사용되는 면역조직화학 기술입니다. 글리코겐(glycogen), 당단백질(glycoprotein), 당지질(glycolipids)과 같은 다당류는 밝은 자홍색으로 염색되어 조직 내 양성 세포와 음성 세포를 쉽게 열거할 수 있습니다. 근육 세포에서 PAS 염색은 다양한 유형의 근육 세포에서 글리코겐 함량을 측정하는 데 사용되며, 혈액 세포 샘플에서 PAS 염색은 다양한 상태에 대한 진단 도구로 연구되었습니다. 혈액에는 면역 체계에 속하는 백혈구의 비율이 포함되어 있습니다. 면역 체계의 세포가 글리코겐을 가지고 이를 에너지원으로 사용한다는 개념은 널리 연구되지 않았습니다. 여기에서는 인간 정맥혈의 말초 혈액 단핵 면역 세포에 적용할 수 있는 PAS 염색 프로토콜의 수정된 버전에 대해 설명합니다. PAS 양성 과립을 가진 작은 세포와 확산성 PAS 염색을 가진 더 큰 세포가 관찰되었습니다. 아밀라아제로 샘플을 처리하면 이러한 패턴이 제거되어 염색의 특이성을 확인할 수 있습니다. 효소 분해를 기반으로 한 대체 기술은 샘플에 글리코겐의 존재와 양을 확인했습니다. 이 프로토콜은 혈액 유래 림프구의 다당류 함량을 연구하는 혈액학자 또는 면역학자에게 유용합니다.

서론

요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 널리 근육 연구 및 진단에 사용되는 면역 조직 화학 기술이다. 또한, 혈액 샘플에 대한 진단 도구로서 이용된다. 기술은 무색 쉬프 시약함으로써 진한 색 마젠타 생성물을 생산하는 반응 생성 다당류 알데히드기 유닛 내에 샘플을 산화에 요오드 산 용액을 적용하여 작동한다. 이 절차의 단계는 그림 1에 나타내었다. 얼룩은 글리코겐, 당 단백질, 당지질, 점액, 또는 다당류 부분과 다른 분자를 포함하는 다당류 마젠타, 아무것도를 켭니다.

PAS 염색 종종 근육 섬유의 글리코겐 수준을 측정하기 위해 사용된다. 근육 조직 섹션은 단단히 슬라이드에 부착하고 여러 세척 및 염색 단계를 견딜로 기술에 이상적이다. 글리코겐은 높은 수요가 유형 II 근육 섬유, 빠른 트 위치에서 가장 존재최대 성능 1,2 글리코겐을 필요로하는 빠른 ATP 생산을위한. 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제 효소의 작용을 통해 무료 포도당으로 분해 될 수있는 포도당의 분 지형 중합체이다. 휴식과 영양 자족의 시대에, 글리코겐, glycogenesis의 과정을 통해 보충하는 동안 영양 부족 또는 고 에너지 수요의 시대; 글리코겐은 글리코겐 분해에 의해 포도당으로 분해된다. 혈액 샘플에 이른 1950의 임상의 과학자들이 탐험으로 PAS 염색에서 각종 질병 3-7 글리코겐 함량을 분석합니다. 예를 들어, 폼 페병 질환-진실한 글리코겐 저장 질환 -에 백혈구 건강한 대조군 (8)로부터 크게 다르다 글리코겐 대량 축적된다.

이 비디오 문서에는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC) 건강한 피험자에서의 정맥혈 샘플에 대한 사용 PAS 염색 적응 버전을 보여준다. PBMCS는 자연 살해 세포 및 단핵구와 같은 T 림프구와 B 림프구 가정뿐만 아니라 다른 면역 세포 림프구를 주로 함유한다. 제 정제 단계는 적혈구, 호중구 및 다른 과립구를 제거한다. 이 기술은 전체 혈액 도말하여 PAS에 비하여 양성 세포보다 강력한 열거 허용 림프구의 농축 비율에 데이터를 제공한다.

figure-introduction-1
도 1 :. PBMC에 PAS 염색 단계 방법에 의해 단계 (A) 우선, PBMC 단리는 피콜 구배 통해 이루어진다는, 왼쪽 패널 원심 분리 전에 제제를 도시 오른쪽 패널은 원심 분리 후를 도시 PBMC를 포함하는 버피 코트 관의 중심에서 관찰된다. (B)가 격리 된 PBMC 포르말린 - 에탄올 고착성을 사용 솔루 슬라이드에 고정되고기. 슬라이드 부드럽게 세척 플라스틱 병에서 증류수로 세정한다. (C)는 슬라이드 글리코겐 용해 아밀라제 용액으로 채워진 100 ㎖ 비이커 반쯤에 배치된다. 슬라이드 부드럽게 세정한다. (D)는 슬라이드 당류의 산화가 일어나는 요오드 산 용액으로 처리한다. 슬라이드 부드럽게 씻어 준다; 이는 과량의과 요오드 산을 제거하고 산화 공정을 중지한다. (E)을 쉬프 시약이 슬라이드에 첨가 될 때, 산화 단계 동안 만들어 알데히드와 반응 할 것이다. 이 무색 시약은 깊은 붉은 마젠타 제품에서 발생합니다. 슬라이드는 부드럽게 초과 쉬프 시약을 제거하기 위해 세척한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

인간의 혈액 샘플을 연구 콩 코디 아 대학 윤리 심의위원회, 인증서 번호 10000618.에 의해 콩 코디 아 대학 윤리 심의위원회, 인증서 번호 2010BERG에 의해 승인 된 마우스 근육에 작업을 승인했다.

전혈 1. PBMC 분리

참고 : 멸균 기술과 제조 소독 장비를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서이 절차를 수행합니다.

  1. 조심스럽게 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 헤파린 (항 응집제) 혈액 수집 튜브에서 전혈 10-15 mL에 붓는다. 작은 혈액 유출시 청소 조직을 사용 DDH 2 O 70 % EtOH로 닦아냅니다.
  2. 인산 버퍼 식염수 (PBS 1X) pH가 7.4 : 1의 비율로 1 원뿔 튜브에 혈액을 희석. 최대 총 용량은 30 ml를 초과하지 않는지 확인합니다.
  3. 부드럽게 거품을 방지 혈청 학적 피펫 총을 사용하여 섞는다.
    주 : 혈액을 방지하기 위해 튜브를 반전 혼합하지 마십시오원심 분리 동안 모자 및 후속 누출에 ccumulation.
  4. 새로운 50 ㎖ 용량 원뿔 관에, 피콜 - 페이크 13 ml에 (재료 및 장비 표 참조)를 추가합니다. 랙에 튜브를 수직으로 유지합니다.
  5. 전송 피펫을 사용하여, 희석 된 혈액을 상단에있는 튜브의 내부 벽에 전송 피펫 팁을 터치합니다. 느리고 일정한 압력으로 자당 층의 상부에 혈액 층을 형성하는 튜브의 내부 벽을 따라 혈액 옮긴다. 모든 혈액이 전송 될 때까지이 단계를 여러 번 수행합니다.
  6. 단단히 튜브 씌우고 5 매체 가속도 세트로 스윙 로터 700 XG에 실온에서 30 분 동안 튜브를 원심 분리하고, 감속은 제로로 설정.
  7. 천천히 튜브를 꺼내 레이어를 방해하지 않고, 바이오 안전성 캐비닛에 다시 걸릴.
  8. 조심스럽게 PBS / 플라즈마 사이에 배치 된 PBMC이있는 버피 코트 (얇은 흐린 흰색 층), 수집차 피콜 층은 전송 피펫을 사용하여. 자당 층 수집 피하고 적혈구 층을 방해하지 않는다.
  9. 새로운 50 ml의 멸균 원뿔 관에 버피 코트를 전송합니다. 그것은 모든 PBMC를 수집하는 단계 1.8을 반복 여러 번 걸릴 수 있습니다.
  10. PBMC와 튜브에 PBS 산도 7.4을 추가하고 45 ml의 표시로 채워. 철저하게 튜브를 흔들어. 소용돌이하지 마십시오.
  11. 워시 1 : 원심 분리기에서 15 분 동안 원추형 튜브의 하단의 한 PBMC 펠릿의 형성을 관찰 (9)에 설정된 최대 가속 및 감속 모두 480 XG에.
  12. 표백제 10 ㎖와 플라스틱 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오.
  13. 부드럽게 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대해 "랙"에 의해 세포 펠렛을 풉니 다. 소용돌이하지 마십시오.
  14. 튜브에 신선한 PBS 산도 7.4의 25 ML을 추가합니다. 하나 이상의 튜브가 처리되는 경우,이 단계에서 함께 펠렛을 풀링.
  15. 2 세척 : 원심 분리기에게 튜브를 12 분 동안 480 XG 위스콘신(9)에 설정된 최대 가속 및 감속 모두 토륨.
  16. 표백제의 스플래시와 플라스틱 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오.
  17. 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대한 조심스럽게 "랙". 소용돌이하지 마십시오.
  18. 튜브에 신선한 PBS의 25 ML을 추가합니다.
    1. 세포의 50 μl를 꺼내 생존 수에 대한 microcentrifuge 관에 전송합니다.
    2. 트리 판 블루 (생존 얼룩)와 피펫 최대의 동일한 양 (50 μl를) 추가하고 아래로 부드럽게 혼합.
  19. 10 μl를 꺼내 1 ㎖ 당 세포의 생존 능력을 확인하기 위해 혈구로 전송. 세포 / ml의 수를 기록한다.
  20. 세포의 원하는 금액을 가지고 9로 설정 최대 가속 및 감속 모두 480 XG에 12 분 동안 튜브를 원심 분리기.
  21. 표백제와 비커에 PBS (상층 액)을 폐기하십시오.
  22. 파상 표면 (즉, 빈 랙)에 대한 조심스럽게 "랙". 8 추가튜브에 PBS의 0 μL.

2. PBMC 슬라이드 만들기

  1. 현미경 슬라이드에 세포의 80 μl를 놓습니다. 다른 슬라이드의 도움으로 드롭 얼룩이나 슬라이드의 양쪽 끝에서 40 ㎕를 각 2 방울을 배치합니다.
  2. 건조 할 수있는 생물 안전 캐비닛에 슬라이드를 둡니다. 프로스트 측에 연필로 슬라이드 레이블.

3. 슬라이드에 샘플을 고정

  1. 4.5 ml의 99 % 에탄올 37 % 포름 알데히드 0.5 ㎖를 혼합하여 정착 솔루션을 준비합니다.
  2. 슬라이드가 건조 된 후, 갓 정착액 용액 2 ㎖를 꺼내 슬라이드의 전체 표면이 피복되도록 슬라이드에 붓는다.
  3. 1 분 동안 슬라이드에 솔루션을 남겨주세요. 수돗물로 1 분 동안 슬라이드를 씻어 공기 건조에 둡니다.

4. 음성 대조군의 아밀라아제 솔루션 만들기

  1. 아밀라아제 분말 0.25 g을 디 50ml에 용해잠잠 물. 깨끗한 100 비이커에 용액을 붓고.
  2. 슬라이드의 절반이 치료를 수신하고, 다른 절반은 미처리 유지 한 후, 실온 (도 1C)에서 15 분 동안 인큐베이션 비이커에 슬라이드 젖어.
  3. 슬라이드의 측면 아밀라아제 치료를 받고있는 메모를합니다. 치료 및 제어 사이의 경계를 나타내는 슬라이드 뒷면에 선을 그립니다.
  4. 아밀라아제 용액을 제거하고 공기 건조에 슬라이드를 떠나 DDH 2 O와 함께 슬라이드를 씻으십시오.

5. 요오드 산 쉬프 (PAS) 염색 및 이미지를 수행

주 : PAS는 시약 흡입 독성 및 부식성, 그래서 단계 화학 퓸 후드에서 수행해야하고, 노폐물을 적절히 기관 가이드 라인에 따라 처리되어야한다.

  1. 평평한 표면에 슬라이드를 삽입하고 샘플에 정기 산 용액의 1.50-2.00 ml에 붓는다. Incuba실온에서 5 분 동안 TE.
  2. 증류수의 여러 비용이 슬라이드를 씻어.
  3. 슬라이드에 쉬프의 시약의 1.50-2.00 ml에 붓고 실온에서 15 분 동안 그것을 품어.
  4. 5 분 동안 증류수로 슬라이드를 세척하고 건조 공기에 둡니다.
  5. 슬라이드에 10 μl의 설치 미디어를 적용하고 두 개의 작은 된 커버 커버, 또는 50 μl를 적용하고 하나의 큰 커버 슬립을 사용합니다.
  6. 커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 적용, 건조 하룻밤을 할 수 있습니다.

6. 100X 목표를 사용하여 쌍안 광학 현미경으로 이미지를 가져옵니다

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

시약 및 기본 기술의 유효성을 검증하기 위해, PAS 염색 마우스 가자미근 섹션에 제조업체의 지침에 따라 수행 하였다. 염색은 제물로 같은 날에 이루어졌다과 염색의 마지막 단계에서, 섹션 자일 렌에 의해 수정되었습니다. 가자미근은 ~ 35 % 글리코겐 양성 세포 구를 포함하는 것으로 알려져있다. 근육 세포 염색은 세포 내에서 두 개의 별개 PAS 양성 특징 - 점상 과립을 표시하고, 세포막 (도 2A)를 demarking 실선. 점상 과립의 존재는 글리코겐과 일치하고, 긍정적 인 근육 세포를 정의하는 데 사용 하였다. 아밀라아제와 샘플의 치료는 그들을 글리코겐 (그림 2B)을 인과 일치하는 점 모양의 입자를 제거했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 비디오 문서의 중요한 단계는 세포의 세척 및 아밀라아제 치료 중이었다. 슬라이드를 세척하는 동안, 키 단계는 플라스틱 짤 세척 병을 사용하고 물이 부드럽게 슬라이드에 샘플을 통해 실행시키는 및 샘플에 직접 목표로하지 않았다. 조금이라도 물을 직접 압력은 슬라이드를 나서야 세포를 일으킬 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 ± 아밀라아제 조건에 대해 동일한 슬라이드를 사용하는 것이 었습니다. PBMC를 상기 슬라이드에 부착 된 후에, 슬라이드는 신중히 스미어의 절반 만이 아밀라제 용액에 노출시켰다 비이커에 넣었다. 혈액 세포가 동일한 슬라이드에서 때문에이 단계 따라서 약간의 타이밍 변화로 인해 발생할 수있는 교란 변수를 최소화 강력한 제어를 제공한다. 세포 치료 없이도 잘 붙어 있으므로, 예를 들면 폴리 -L- 리신 또는 폴리에틸렌 글리콜 코팅과 관련된 추가 비용 및 시간이 보장되지 않을 것이다.

TR을 통해아밀라아제의 최적 활성을 oubleshooting 것이 결정되었다. 근...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NSERC Discovery 프로그램 보조금 번호 RGPIN 418522-2013의 보조금으로 지원되었습니다. 유익한 토론을 해주신 R. Kilgour님께 감사드리며, 마우스 근육 절편을 제공해 주신 Katelin Gresty님과 A. Berghdal 박사님께 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Periodic Acid Shiff Kitfigure-materials-1 Sigma-Aldrich395B사용 전 상온으로 맞추십시오. 본 키트의 물질은 독성이 있으며 유해합니다. 주의하여 사용하십시오.
α-Amylase from porcine pancreasfigure-materials-2 Sigma-AldrichA3176
쌍안 현미경Carl Zeiss MicroscopyAxio Lab A0
Glycogen Assay Kitfigure-materials-3 Sigma-AldrichMAK016
Ficoll-Paque PLUSfigure-materials-4 VWR, GE Healthcare17-1440-02비이온성 합성 자당 폴리머.
원심분리기PBMC 분리를 위해 스윙 버킷 로터를 사용하였습니다.

참고문헌

  1. Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
  2. Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).
  3. Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
  4. Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
  5. Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
  6. Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
  7. Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
  8. Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
  9. Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
  10. Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
  11. Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
  12. Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
  13. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
  14. Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
  15. Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
  16. Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: http://www.atlasofms.org (2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.