줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

요약

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

초록

55세 이상 노인의 시력 상실의 주요 원인인 노화 관련 황반변성(AMD)에 대한 치료법은 발견되지 않았습니다. AMD는 원인을 알 수 없는 복합적인 다인성 질환이지만, 주로 망막의 기저에 있는 세포의 단층인 망막 색소 상피(RPE)의 사멸 또는 기능 장애로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. RPE 세포 대체 전략은 대다수의 AMD 환자에게 치료 완화를 제공할 수 있는 큰 가능성을 가질 수 있으며, 일차 인간 세포(hRPE)와 매우 유사한 RPE 세포는 당사의 실험실을 포함한 여러 독립 실험실에서 생성되었습니다. 또한 iPS-RPE의 용도는 세포 기반 치료에 국한되지 않고 RPE 질환을 모델링하는 데에도 사용되었습니다. 이러한 유형의 연구는 질병의 분자 기반을 규명할 수 있을 뿐만 아니라 신약을 개발하고 테스트하기 위한 귀중한 도구 역할을 할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 직접 분화하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 니코틴아미드와 특정 시점에서 그 효과를 모방하는 작은 분자인 Activin A 또는 IDE-1을 추가하면 RPE 세포의 수율이 크게 향상됩니다. 이 기술을 사용하면 빠르면 3개월 이내에 많은 수의 저계대 RPE를 도출할 수 있습니다.

서론

망막을 차지하는 다양한 세포 유형은 기능적 아키텍처로 구성되어 있습니다. 망막 뒤쪽에 있는 광수용체(photoreceptor)는 광전달(phototransduction)을 통해 빛을 전기 충격으로 변환하는 역할을 합니다. 그러나 광형질전환은 뮐러 신경교세포(Mueller glia 및 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포를 포함한 다른 인접 세포 유형의 조정된 노력 없이는 발생할 수 없습니다. RPE 세포의 단층은 광수용체의 주요 혈액 공급원인 맥락모혈관(choriocapillaris)의 감각 망막을 분할하며, 광수용체 항상성에 중요한 여러 기능을 제어하는 데 이상적인 위치에 있습니다. 사실, RPE와 광수용체는 상호 의존적이어서 하나의 단일 기능 단위로 널리 간주됩니다. (RPE의 다양한 기능에 대한 검토는 Strauss, 2005,¹ 참조) 망막 색소 상피 세포의 사멸 또는 기능 장애는 선진국에서 영구적인 시력 상실의 주요 원인인 노화 관련 황반 변성(AMD)을 유발할 수 있습니다^2-4.

AMD는 RPE, 광수용체, 맥락막 혈관 구조의 복합성 질환이며, 위험 요인은 다양하며 환경 및 유전적 영향의 조합을 포함합니다^5,6. AMD에 대한 치료법은 매우 제한적이지만, 유망한 잠재적 치료법 중 하나는 RPE 세포 치환^7,8입니다. 결과는 엇갈렸지만, AMD 환자(및 다른 망막 변성 환자)와 망막 변성의 설치류 모델에서 RPE 세포를 이식하면 유의미한 광수용체 위축을 일시적으로 예방할 수 있는 잠재력이 있습니다^9-23. (이 연구에 일반적으로 사용되는 동물 모델은 MerTK 유전자에 돌연변이를 가지고 있는 RCS(Royal College of Surgeons) 쥐입니다. 이 돌연변이는 RPE 세포가 광수용체 외분절을 식세포화할 수 없게 만들고 망막 변성을 촉진한다²⁴.) RCS 쥐와 마우스의 망막하 공간에 이식된 RPE의 보고된 생존율은 크게 다르지만 몇 개월 또는 몇 년 동안 생존할 가능성이 있습니다^9,10,12,20.

RPE 세포는 만능 줄기 세포^9-14,25-28에서 유도하여 이식에 충분한 수를 얻을 수 있습니다. 여러 독립적인 그룹은 이러한 세포가 체세포 세포와 유사한 방식으로 기능한다는 것을 입증했으며, 장기간의 연구에 따르면 쥐 및 쥐 질병 모델^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}에 이식하면 안전하다고 제안합니다. 배아 줄기세포 대신 유도만능줄기세포를 사용하면 동종 RPE와 관련된 윤리적 문제 및 면역학적 문제를 피할 수 있기 때문에 유리할 수 있다^33,34. iPS 기술의 또 다른 흥미로운 응용 분야는 질병 모델링³⁵입니다. RPE 질환 환자에서 유래한 많은 수의 RPE 세포를 조사할 수 있는 능력은 분자 기반을 이해하는 데 매우 중요할 수 있습니다. 이러한 유형의 연구는 최근 Best disease patient RPE를 대상으로 수행되었으며, 유전성 황반병증에 대한 유사한 연구의 길을 열 수 있다³⁶.

줄기세포에서 RPE를 추출하는 것은 비교적 간단한 과정이며 완전히 이종이 없는 조건에서 수행할 수 있습니다. 가장 간단한 전략은 RPE 세포의 단층을 자발적으로 유도하는 것이지만, 유도된 분화 기술을 사용하여 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 비용이 많이 들고 종종 박테리아 또는 기타 인간이 아닌 소스에서 생성될 수 있는 외인성 단백질 인자의 사용을 포함합니다^10,12,37. 본 연구에서는 니코틴아미드(nicotinamide)와 액티브빈(Activin) A를 활용하는 확립된 프로토콜¹⁰을 따랐는데, 이는 RPE 사양³⁸에 충분한 것으로 밝혀진 신호전달 인자이다. 여기에서는 소분자 IDE-1이 Activin A를 적절하게 대체할 수 있음을 입증하여 비용을 절감하고 재조합 단백질³⁹의 사용과 관련된 우려를 완화할 수 있습니다. 또한, 당사는 xeno-free 혈청 대체물을 활용하고, 합성 xeno-free 기질에서 분화 RPE 세포를 배양합니다. RPE 세포는 이전에 이 접근법을 사용하여 매우 효과적으로 분화하는 것으로 나타났습니다⁴⁰.

단층으로 분화하면 빠르면 5주 후에 RPE 세포를 포함하는 색소 콜로니를 시각화할 수 있습니다¹². 충분한 크기에 도달하면 수동으로 절제하고 확장을 위해 다른 접시로 옮길 수 있습니다. RPE 세포는 각 계대에서 역분화되는 것으로 악명이 높으며, 5개 이상의 계대는 사용하지 않아야 합니다(동물 모델에서 특성 분석 및 이식을 위한 충분한 수의 세포는 2개 또는 3개의 계대 후에 쉽게 생성될 수 있음). 완전히 분화되면 여러 기술을 사용하여 세포를 해부학적으로나 기능적으로 특성화하여 질병이 있는 RPE를 적절하게 대체하는 역할을 할 수 있도록 합니다. 이러한 기술에 대한 설명 및 설치류의 망막하 공간에 iPS-RPE를 이식하기 위한 프로토콜은 이 방법 논문의 범위를 벗어나며 이전에 발표된 바 있습니다^12,32,41.

iPS-RPE의 효과적인 유도를 위한 표준화된 프로토콜을 개발하는 것이 임상에 분명히 중요하지만, 동물 모델에서 여전히 수행해야 할 중요한 전임상 작업이 있습니다. iPS 유래 세포의 면역원성에 대한 우려가 있으며, 인공 기질에 세포를 이식하는 것을 포함한 여러 가지 다른 이식 기술이 연구되고 있습니다^42,43. 이러한 이유로, 우리는 표준화된 프로토콜의 발표가 임상 및 전임상 연구를 모두 촉진하는 데 유익하다고 생각합니다. 특히 다른 연구 그룹이 다른 실험실에서 파생된 iPS-RPE 세포를 직접 비교하는 경우.

프로토콜

줄기 세포 유래 망막 색소 상피 1. 감독 차별화

주 : 모든 인큐베이션 단계는 5 % CO _2에서 37 ℃에서 수행

1. 유지 보수 미디어 (; 표 1 MM)의 배아 줄기 또는 엉덩이 라인 (매일 공급)를 유지한다. 라인이 품질 관리 기준을 충분히 도달했으면, 마우스 배아 피더 세포의 층에이를 유지 보수 (MEFs에)은 250,000의 밀도 / 웰의 여섯 웰 플레이트에 시딩. 제노없는 배양 또한 터커 외. ^(40)에 의해 확립 된 프로토콜은 다음 생성 될 수있다.
2. 줄기 세포 식민지 포화 상태에 도달 할 수 있습니다.
3. 니코틴 아미드 (; 표 1 DM / NIC)와 차별화 미디어로 전환; 매일 공급.
4. RPE 차별화를 강화하기 위해, 문화 삼주 후, 니코틴 및 중 하나를 Activin-A 또는 IDE-1 (표 1 DM / NIC / AA 또는 DM / NIC / IDE1)와 차별화 미디어로 전환합니다.
5. 문화 오주 후, DM / NIC로 전환. 매일 먹이를 더 이상 공급 후 노란색 하루를 돌려 미디어 정지의 pH를 표시 한 번 필요하지 않습니다.
6. (그림 2D-F와 3A 참조)만큼 잘라 제거 할 큰이 나타나는 색소 세포의 섬 기다립니다.

2. 분리 안료 독도

1. 외투 세포 자연 환경 (이종이없는 것이 바람직하다) 본뜬 매트릭스 24- 웰 플레이트의 웰.
   참고 : 각막 블레이드 날카로운, 뾰족한 집게 따기위한 매우 유용합니다. 따기 동안 분화 된 세포의 전체 시트를 분리 할 수​​ 있습니다. 신중하게 작업하고 처음에 접시의 중앙에 식민지를 선택하여이 피하십시오.
2. (; 표 1 DM) 필요에 따라 차별화 미디어를 24 웰 플레이트의 많은 우물을 입력합니다. 착색 된 콜로니의 수에 의존 할 것이다 이러한 결정수집.
3. 해부와 세포 배양 후드에서 수동으로 착색 된 섬을 잘라. 약 2-6 조각으로 메스를 사용하여 원래 판의 맨 아래에 각각의 섬을 잘라 날카로운 집게로 착색 된 부분을 잡아.
4. 각 24 웰에 1-2 착색 된 조각을 전송합니다.
5. 세포가 준수 할 때까지 3~5일을 위해 미디어를 변경하지 마십시오, 다음 미디어에게 일주일에 세 번 변경 시작합니다. (그들은이 시간 이후 준수하지 않는 경우, 가능성은 결코 좋은입니다).
6. (; 표 1 DM) - 전형적인 문화의 이미지가 그림 3b에 도시되어 차별화 미디어 3-4 주 동안 세포를 확장합니다. 세포는 여전히 전체를 잘 채울 수 있지만 더 이상 기다리는 것은 해결 될 수 없다. 일주일에 세포를 세 번 피드.
7. 약 3 주 후, 수동 날카로운 집게로 필요한 경우 대단히 짧은 흰색 세포의 클러스터를 제거합니다. 필요한 경우가 아니면이 단계를 수행하지 마십시오 - 그것은 오염 물질을 소개하기 쉽습니다. 그것은에 이상적입니다단계 1.6 원래 색소 식민지에서 RPE의 순수한 인구를 얻으려고.

3.과 Passaging 줄기 세포 유래 망막 색소 상피

1. 세포 해리 용액 200 μL를 가진 세포를 분리하여 37 ℃에서 5-8 분 동안 (바람직 희석 바람직하다 통하여 불 활성화 될 수있는 시약의 트립신 생략), 및 DM 희석하여 비활성화. 모든 세포를 씻어하고 (두 24 우물에서 세포를 풀링을 고려, 몇 세포가 포함되어 잘 선택한 경우)을 재현 탁하기 위해 200 μL 피펫을 사용합니다.
2. 원심 분리기 (5 분 800 XG)는, 3 ㎖의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다.
3. 다시 플레이트 세포 하나 (또는​​ 2) 잘 당 DM의 3 ㎖ 한 매트릭스 코팅 6 자에 24 우물에서 (1 : 5 확장).
4. 세포가 ~ 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 1~2주 대한 확대; 완전히 차별화 된 순수 문화의 이미지는 그림 3C에 표시됩니다.
5. 1 ml의 세포 D와 세포를 분리37 ° C에서 약 5-8 분 issociation 솔루션은, DM 희석하여 비활성화 모든 세포를 씻어 1,000 μL 피펫을 사용하고이를 재현 탁.
6. (5 분 800 XG) 스핀 다운 18 ML의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다.
7. (6 팽창 1) 또는 ⁽²⁾ 75cm 플라스크 하나가 코팅 된 (1 : 7.5 확장) 여섯 매트릭스로 한 각 6- 웰 플레이트에서 다시 셀 웰 당 3 ㎖ DM 6- 웰 코팅.
8. 충분한 세포를 얻을 때까지 반복 3.4-3.8 필요한 단계를 반복합니다.
   참고 : 오히려 각 통로 RPE의 탈분화를 유도하기 때문에 계대를 통해 문화를 증폭 계획보다 확장 가능한 한 많은 식민지를 수집하려고합니다.

결과

도 1에 도시 된 바와 같이,이 논문에서 설명하는 단계는, 이전에보고 된 바와 같이 ^{(10, 12)를} 용이하게 줄기 세포에서 RPE를 생성하는데 사용될 수있다. 몇 주 동안 만능 줄기 라인을 유지 한 후, 색소 식민지 5-7주 (7 주 된 문화가 그림 2A-C에 나와 있습니다) 후 식민지에서 나타나기 시작. 이러한 식민지 문화가 유지 될 때 주 동안 계속 증가 할 수 있습니다. 도 3a에 도시 된 바와 같이,도 2D-F (8 주령 배양)에 나타내는 바와 같이, 충분한 크기에 도달하면, 이들은 수동으로 절개 할 수있다. 주의 절제 크게 충분히 순수 RPE 문화 (그림 3B-C)의 생성을 촉진 할 것이다 비 망막 색소 상피 세포의 오염을 방지 할 수 있습니다.

토론

이 논문에서 우리는 효율적으로 순수 만능 줄기-RPE 문화의 큰 숫자를 생성하는 단계를 설명합니다. 우리는 우리가 강하게 transcriptomics, 단백질 체학, 대사 체학 및 기능에 따라 hRPE 유사 만능 줄기-RPE를 생성 할 수 있습니다를 Activin이 감독 분화 프로토콜을 사용하여 이전에 보여 주었다 및 RCS 쥐 ^12,31,32를 이식 할 때 그들은 망막 변성을 지연하는 것이 . 만능-RPE를 생성하는 과정은 시간이 많이 소요 아니라 고된 (도 1)이다. 만능 문화 포화 상태에 도달하면 그들은 매일 차별화 매체를 공급해야합니다. 우리를 Activin A 또는 덜 비싼 작은 분자 IDE-1 중 하나와 미디어를 보완하고, 일반적으로 5-7주 (그림 2A-C) 후 나타나는 색소 만능 줄기-RPE 식민지의 문화를 모니터링하면서 2 주 동안 먹이를 계속합니다. 일단 충분한 크기에 도달하기 (도 2D 및

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
각막 칼	Surgipro	SPOI-070	나이프 x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 1X w/out Ca 또는 Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) 재조합 Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µ g x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-글루타민 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM 비필수 아미노산 용액 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
니코틴아미드	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
재조합 인간/쥐/쥐 Activin A	PeproTech	120-14E	10 &마이크로; g x 2
Synthemax-T 표면 6 웰 플레이트	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), 페놀 레드 없음	라이프 테크놀로지	12604-021	500 ml x 1
진공 필터 / 저장 병 시스템, 0.1µ M 모공, 500ml	코닝	431475	케이스(12) x 1