우리는 근섬유아세포 표현형을 가진 쥐와 인간 식도 기질 세포의 1차 배양을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 배양된 세포는 방추체 모양의 형태를 가지고 있으며 α-SMA 및 비멘틴을 발현하며 상피, 조혈 및 내피 세포 표면 마커가 없습니다. 특성화된 기질 세포는 상피-기질 상호 작용의 기능적 연구에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
설치류와 인간의 식도 근육 섬유 모세포는 소화 효소를 통해 생성된다. 신생아 (8~12일 세) 쥐의 식도, 수확 다진, 세척하고, 25 분 동안 콜라게나 제와 디스 파제와 소화 효소 실시한다. 인간 식도 절제 표본 근층 고유 층과 외막의 벗겨, 나머지의 점막 다진되고, 최대 6 시간 동안 콜라게나 제와 디스 파제 및 소화 효소를 실시. 배양 된 세포는 α-SMA 및 멘틴 및 명시 최근 desmin 약하게 또는 전혀 표현한다. 배양 조건은 상피 세포, 조혈, 또는 내피 세포의 성장에 도움이되지 않습니다. 문화 순도는 또한 잠재적 오염 조혈 및 내피 세포의 세포 표면 마커의 발현을 유세포 평가에 의해 확인된다. 설명 된 기술은 간단하며 비 hematopoieitc 비 내피 간질 세포의 일관된 발생을 초래한다. 이 기술의 한계의 사용에 내재즉, 분자 생물학 연구의 주요 문화, 피할 수없는 변화는 다른 쥐 또는 인간 전반에 걸쳐 문화 사이에 발생했습니다. 그러나 차 배양 세포주에 비해 생체 상태의 대표성 반사된다. 이러한 방법은 연구자들에게 집단 간의 비교를 가능하게 분리 할 수있는 능력과 다른 임상 및 실험 조건에서 배양 기질 세포를 제공한다. 특성화 식도 기질 세포는 식도 상피의 질환 - 간질 상호 작용을 조사하는 연구에 사용될 수있다.
서론
상피 기질 상호 작용 재생 점막, 보수, 섬유증 및 발암 1,2- 포함한 위장관 다양한 기능의 조절에 관여한다. 이러한 상호 작용은 가장 작은 창자 및 결장에서 연구되었다 마찬가지로 식도 점막 질환 3에서 역할을 수행 할 수있다. 장과 대장 기질 세포라고 근육 섬유 모세포의 하위 집단은 조직 손상, 염증을 중재에 참여하고 4,5를 복구하는 입증되었다. 원위 위장관에서 이러한 스핀들 모양의 세포는 상피와 고유 층 사이의 계면에서 기저막에 인접하고, α-SMA 및 멘틴으로 정의 된 양,-팬 아세포 부정하고, 약한 양성 또는 최근 desmin 5 음.
식도 기질은 엄격하게 세포 또는 분자 수준에서 특징되지 않았습니다. 쥐의 식도에있는 우리의 작업은 취소했다monstrated의 α-SMA 편평 상피 6 때때로 밑의 식도 기질과 멘틴 세포. 상피 세포 - 기질 상호 작용 등의 위식도 중재 부상 (6)과 호산 구성 식도염 3과 식도 점막 질환에 연루되어있다. 섬유 성 협착은 위장 섬유증의 발병에 연루되어 식도 부상과 간질 세포의 알려진 합병증이다. 이러한 세포의 분리 미친 신호 전달 경로를 조사하는 데 필요한 연구를 수행하는 데 도움이됩니다.
이 제출는 이러한 상호 작용을 매개하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 기존의 격차가 해결 될 수 있도록 α-SMA 긍정적 인, 멘틴 긍정적 인 근육 섬유 모세포의 차 문화를 구축하는 데 필요한 기술을 제공합니다. 기재된 기술이 성공적 일차 결장 뮤린 근섬유 7 furthe를 확립 저자 사용되고R 6은 뮤린 및 인간 근섬유 같은 식도 기질 세포의 확립을위한 장치.
여기에서 우리는 설정하고 마우스 또는 미래의 기능 연구에 사용하기 전에 인간의 식도에서 설립이 문화를 특징 짓는 데 필요한 조건을 설명합니다. 배양액을 성장시키고, 그 최대 15 계대 이용 될 수있다. 아래에 설명 된 방법을 통해 분리 및 차 문화의 설립은 근섬유 표현형과 간질 세포를 생성; , vimentin에 양성하고, 약한 양성 또는 최근 desmin에 음성 및 아세포 네거티브 SMA를 α. 이 표현형은 주로 멘틴 양성 식도 섬유 아세포의 표현형, 음의 α-SMA 3 근층 점막 (6)의 α-SMA 양성, 멘틴 부정적인 표현형 구별된다.
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프로토콜
프로토콜은 동물 실험, 이론적 근거와 연구의 목적을 수행하기 위해, 남부 캘리포니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 제출하여 승인을했다.
취소 확인 된 인간의 식도 표본에서 차 문화의 설립을위한 프로토콜은 남부 캘리포니아 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학에 의해 승인되었다.
1. 마우스 또는 인간의 식도를 얻습니다
- 마우스 식도를 얻습니다
- 자궁 경부 전위 다음에 2 % 이소 플루 란 흡입 과다 복용으로 8-12 일 이전 마우스를 안락사.
- 아래로 향 배와 동물을 핀 및 70 % 에탄올로 복부 표면을 젖은. 핀셋으로 잡고 집게로 요도에 피부 앞쪽을 들어 올립니다. 턱 요도에서 복부 정중선을 따라 잘라 표준 바로 수술 가위를 사용합니다. 만 피부를 잘라주의하십시오.
- "Y"거꾸로 형성 동물 양쪽 무릎 하방 개구부로부터 요도 절개를. 흉곽 따라 동물의 양쪽에 다른 절개를합니다.
- 조심스럽게 기본 복막과 흉곽의 떨어져, 양쪽의 피부를 벗겨과 측면에 누워. 흉강과 복강을 덮는 복막 위에 놓인 흉곽을 검사합니다.
- 복부 내용에 대한 손상을 방지하기 위해 위쪽으로 가위를 가리키는 집게로 복막을 들어 올려 다이아 프램과 흉곽에 그것을 통해 잘라. 부드럽게, 간 좌엽을 들어 기본 위, 식도 - 위 접합부와 식도의 복부 부분을 노출.
- 자궁 거들까지의 중간 선을 따라 흉골과 흉곽 통해 잘라 멸균 수술 가위를 사용합니다. 포인트 가위 위로 흉부 내용의 손상을 방지합니다. 완전히의 내용을 노출측면에 갈비뼈를 잡아 당겨 흉강.
- 조심스럽게 심장과 폐의 두 엽을 제거합니다. Q-팁 초과 혈액을 흡수한다. 식도는 흉추에 기관 및 전방에 좁은 유연한 튜브 거짓말 후방입니다.
참고 : 식도는 쥐의 신생아 식별하기 어려울 수있다. 식도 - 위 접합부의 현지화 식도 식별이 간단합니다. - 조심스럽게 주위의 혈관, 지방을 해부, 위장에서 식도를 따라 자궁 경부 공동의 식도 기원까지 모든 방법을 장간막. 무딘 끝 외과 용 가위는이 목적을 위해 최선을 작동합니다.
- 후술하는 추가 처리를 위해 행크스 평형 염 용액 (HBSS)의 식도와 위의 전체 길이를 절제. 원하는 경우 방향을 위해 위의 일부를 제거합니다.
참고 : 작은 조직의 크기로 인해, 근육에서 근육 판의 고유 층의 분리점막 뮤린 신생아 식도에서 달성되지 않고, 전체 식도 후술 처리를 받게된다.
- 인간의 식도를 얻습니다
- HBSS와 식도 절제 표본 (일반적으로 5cm 이하) 세척 및 장착 된 결합 조직, 지방, 또는 혈관을 제거합니다.
- 시험편의 일부를 절제하고 필요하다면 향후 조직학 검사를 위해 포르말린에 놓는다.
- 날카로운 해부하여 기본 근육 판의 고유 층에 남아있는 점막을 분리합니다.
- 아래에 설명 된 프로토콜 서브 cm 조각으로 점막과 주제를 잘라.
NOTE : 인간 식도 절제술 후술 처리 전에 최대 6 시간 동안 PBS에 저장 될 수있다. 식도 표본의 자료는 표본 크기를 지시하고 실험실 의존한다.
2. 격리 설치류와 인간의 식도 기질 세포
- F 식도 기질 세포를 분리기계 및 소화 효소의 조합에 의해 롬 쥐와 인체 조직.
- 기계적으로 HBSS 가위 여러 세척과 조직을 닦지에 의해 소화. 효소 ml의 300 U / 콜라게나 제 XI 0.1 ㎎ / 25 분 (쥐의 조직)에 대한 ml의 디스 파제 또는 최대 6 시간 (인체 조직)의 조직 배양에 의해 소화. 닦지에 사용되는 악기는 멸균 및 살균되어 있는지 확인합니다.
참고 : 콜라게나 콜라겐, 함께 동물 조직을 유지하기위한 책임이 세포 외 기질 단백질 분해 효소이다. 콜라게나 제 XI 높은 콜라게나 제 활성을 가지고 있으며,이 격리 프로토콜의 성공을 보았다. 디스 파제는 세포막 활성을 유지하고 보조 효소로서 콜라게나 제와 병용되는 온화한 단백 분해 활성을 갖는 세균의 효소이다. - HBSS를 포함하는 1.7 ml의 마이크로 원심 분리기 또는 5 ml의 튜브에 마우스 나 인체 조직에서 얻은 점막 조각을 놓습니다. 말하다 조직 추가각각의 튜브에 맞는 오픈 팁 폭으로 가위를 사용하여 2-3mm 조각으로. 식도 점막 단편이 튜브 바닥에 침전하는 충분한 시간을 허용 할 수있다.
- 천천히 실수로 조직을 삭제하지 않도록주의, HBSS를 가만히 따르다. 신선한 HBSS는 부드러운 흔들림에 의해 다음과 같이 교체합니다. 또한, 1 ml의 피펫으로 HBSS를 제거합니다.
- 부드러운 식도 조각이 각 세척 사이에 침전을위한 시간을 허용 세척 사이에서 진탕이 방법으로 8 배의 총 조직을 씻으십시오.
참고 : 인간의 조직은 신생아 마우스 조직을 닦지 더 필요합니다.
- 기계적으로 HBSS 가위 여러 세척과 조직을 닦지에 의해 소화. 효소 ml의 300 U / 콜라게나 제 XI 0.1 ㎎ / 25 분 (쥐의 조직)에 대한 ml의 디스 파제 또는 최대 6 시간 (인체 조직)의 조직 배양에 의해 소화. 닦지에 사용되는 악기는 멸균 및 살균되어 있는지 확인합니다.
- ml의 300 U / 콜라게나 제 XI 실온에서 느린 속도로 설정 흔들 통에 25 분 0.1 ㎎ / ㎖ 디스 파제와 쥐의 조직을 품어.
- 실온에서 느린 속도로 설정 흔들 통에, 최대 6 시간 동안 300 U / ㎖의 XI 콜라게나 0.1 ㎎ / ㎖ 디스 파제 인간의 조직을 품어.
참고 : 인간 esopha의 가용성거스는 변수입니다. 인간의 식도 점막은 차 문화의 성공적인 세대에서 최대 6 시간의 결과를 효소로 배양 하였다.
- 실온에서 느린 속도로 설정 흔들 통에, 최대 6 시간 동안 300 U / ㎖의 XI 콜라게나 0.1 ㎎ / ㎖ 디스 파제 인간의 조직을 품어.
- 효소 소화 한 후, 10 분 동안 200 XG에 가위와 원심 분리기와 더 말하다 조직.
- 상층 액을 제거한다. 생존 할 세포 및 잔해를 제거하기 위해 2 % 소르비톨 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 5 회 5 ㎖ 튜브에 혼합 된 세포 현탁액으로 이루어진 펠릿을 전송하고 세척 하였다.
- 10 % 소 태아 혈청 DMEM 6- 웰 플레이트 및 배양 (FBS), 10 ㎎ / ㎖의 인슐린, 10 μg의 종자 세포 / ㎖ 트랜스페린, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 2 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF) . 진공 필터 (0.22 μm의) 여과 후 추가 할 수 있습니다 EGF를 제외한 모든 구성 요소. 절제의 크기에 따라 여러 6 웰 플레이트 사이에 인간의 절제 표본에서 얻은 세포를 배포합니다.
- 우물은 80 %의 합류가되면, T25에 통과 부착 세포는 우리를 플라스크보내고 0.05 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA). 400 x g에서 미디어와 스핀으로 중화.
- T25 플라스크에 6 잘 통로를 들어, 하나의 통로 세포 : 1의 비율. 2 또는 1 : 3 비율로 합류 T25 플라스크는 1 계대 배양 할 수있다. : 1 비율로 T75 플라스크에 T25 플라스크에서 통과하려면 1을 사용합니다. 2-3 일마다에 관계없이 선박의 변경 미디어.
- 위에서 설명한 근섬유 미디어의 가습 5 % CO 2 배양기와 문화에서 37 ºC에서 세포를 성장.
참고 : 상피 세포가 이러한 문화 또는 통과 조건에서 생존하지 않습니다. 특성화 및 후술 연구에 사용 된 세포는 통로 (5) 및 (15) 사이이다. - 근섬유 매체 10 % 디메틸 술폭 시드를 첨가하여 액체 N 2 세포는 냉동 보존 -.
3. 성격을 설치류와 인간의 식도 기질 세포
- 거꾸로 현미경으로 세포의 형태를 검사합니다. 스핀들 모양을 관찰부착 성 세포의 형태 (도 1).
- α-SMA, 멘틴, 최근 desmin 및 아세포 다음 골격 마커의 평가에 의해 배양 된 세포를 특성화. 근섬유 같은 표현형과 기질 세포는 α-SMA 및 멘틴 (그림 2) 세포 골격 근섬유 마커를 표현한다.
- 더욱 최근 desmin위한 발현 사이 근육 세포로부터 배양 기질 세포를 구별한다. 배양 된 세포에 면역 염색을 수행하려면, 4 잘 챔버 슬라이드에 1.5 × 10 4 세포를 판 24 시간 동안 근섬유 미디어에서 성장합니다. 근섬유 같은 표현형과 기질 세포는 약하거나 결석 최근 desmin 식을해야합니다. 간질 세포가 상피 마커 팬 아세포의 발현이 부족하다 (데이타는 나타내지 않음).
참고 : 문화의 평가가 유동 세포 계측법에 의해 면역 세포와 세포 표면 마커에 의한 세포 골격 마커의 평가를 포함한다. 면역 세포 화학은 전 같은 특성의 기본 방법으로 사용됩니다세포 골격 단백질의 Pression의 프로파일은 섬유 아세포, 근섬유 아세포 또는 근육 세포에 대해 고유하다. 유동 세포 계측법은 상피 세포, 내피 세포, 조혈 세포 마커의 세포 표면 발현을 평가하여 배양 순도를 확립한다. CD90는 인간 섬유 아세포와 근육 섬유 모세포에 모두 표현으로 인간의 기질 세포를 식별의 보조적인 방법으로 도움이됩니다. 그것은 또한 쥐 T 세포에 의해 표현되는 CD90는 뮤린 기질 세포의 특성 분석에 도움이되지 않는다.
- 더욱 최근 desmin위한 발현 사이 근육 세포로부터 배양 기질 세포를 구별한다. 배양 된 세포에 면역 염색을 수행하려면, 4 잘 챔버 슬라이드에 1.5 × 10 4 세포를 판 24 시간 동안 근섬유 미디어에서 성장합니다. 근섬유 같은 표현형과 기질 세포는 약하거나 결석 최근 desmin 식을해야합니다. 간질 세포가 상피 마커 팬 아세포의 발현이 부족하다 (데이타는 나타내지 않음).
- 세포가 60 % 합류에 도달 한 후, 인산 완충 식염수 (PBS)와 슬라이드를 씻어 메탄올로 고정한다. -20 ° C에서 10 분 동안 메탄올 세포를 품어, 다음 사용까지 4 ° C에서 PBS에 저장합니다.
- 표준 면역 염색 프로토콜을 따르십시오.
- 간략하게, 일차 항체를 적용하기 전에, PBS 중 5 %로 고정 goatserum 셀 블록. 뿐만 아니라 5 % 염소 혈청의 일차 및 이차 항체를 희석.
- α-SMA 및 멘틴의 검출을 위해 사용다음 항체 농도 : 마우스 단클론 항체는 α-SMA를하는 1 : 500 희석 : 1에서 멘틴 250 희석 토끼 PAB.
- , 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 일차 항체와 함께 품어 PBS로 3 회 씻어 1의 희석 로다 민 결합 염소 항 마우스 이차 항체를 추가 : 1 시간 동안 1,000 : 1의 희석에 200 CY2 결합 염소 항 토끼 실온에서 첨가 하였다.
- Counterstain과 핵 4 ', 1 분 동안 1 ㎍ / ml의 농도에서 6 Diamidino-2Phenylindole (DAPI) 다음 PBS로 세척한다. 거꾸로 현미경 슬라이드를 분석합니다.
- 조혈에 대한 쥐와 인간의 식도 세포 검사 (CD45) 및 유동 세포 계측법에 의한 내피 세포 (CD31) 세포 표면 마커 (그림 3)에 의해 문화의 순도를 설정합니다. 간질 세포 표면 마커 CD90의 발현에 의해 상기 인간 세포를 특성화.
주 : CD90은 T의 뮤린 CEL 같은 뮤린 간질 세포를 식별하기 위해 사용될 수 없다LS는 또한 CD90를 표현한다.- , 회 FACS 완충액으로 세척 카운트 관련 이소 타입 컨트롤 FITC-CD45 및 APC-CD31 염색, 10 분 동안 37 ℃에서 비 - 효소 적 세포 해리 용액으로 처리하여 배양 플라스크에서 배양 된 마우스 식도 간질 세포를 분리있어서 표준 염색 절차.
- 외과 팩스 칼리버를 사용하여 세포를 수집하고 FlowJo 소프트웨어와 데이터를 분석 할 수 있습니다. 세포 염색 전에, 항체 이소 타입을 최적화하고 제어 정상적인 마우스 비장 및 골수 세포를 이용하여 농도를 적정.
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결과
기계 및 소화 효소를 사용하여 격리 식도 기질 세포는 처음 도금 6 웰 플레이트에서 배양된다. 도금 시간 내에 거꾸로 현미경으로 세포의 시험은 판 바닥 (그림 1A)에 느슨하게 부착 혼합 세포 현탁액을 보여줍니다. 다음 24 시간에 걸쳐, 접시 바닥에 견고하게 부착 방추형 세포가 혼합 된 세포 현탁액 돋 셀 웰 오일 내에서의 전체 영역을 커버 및 형태 유지, 성공적으로 계대 수 .These (도 1b)에서 촬영 관찰 적어도 15 구절. 스핀들 모양의 접착 세포는 저밀도 (그림 1C) 때 거의 합류 (그림 1D)에서 관찰된다.
챔버 슬라이드에서 재배 식도 기질 세포의 차 문화의 면역 염색 (그림 α-SMA 및 멘틴 근섬유 아세포의 세포 골격 마커의 풍부한 표정을 보여줍니다우레 2), 최근 desmin의 약한 표현하고, 결석 아세...
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토론
조직의 크기에 적합한 닦지 소화 회 뮤린 또는 인체 조직을 사용할 때 차 배양 생성 기법은 일반적으로 유사하다. 뮤린 조직의 경험은 상술 한 방법을 사용하는 것이 일관되게 차 배양의 성공 확립 될 것을 제안한다. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 수술 장비의 살균 및 조직 문화의 표준 멸균 기술을 다음과 같습니다. 마우스의 나이는 중요한 단계입니다. 8~12일 된 신생아는 지속적으로 성공 차 문화를 얻을 수 있습니다. 이하 신생아로부터 단리 간질 세포가 성공적으로 생성되지되지 않았다. 이전 마우스에서 근섬유와 같은 기질 세포를 확립하려는 시도는 계속되고. 다른 사람들은 4 ~ 8 주 된 쥐 8 일부터 식도 섬유 아세포의 성공적인 세대를 신고되었습니다.
대장 근육 섬유 모세포의 설립과는 달리, 오염 전자에서 자주 문제입니다쥐의 근육 섬유 모세포의 문화 stablishment 항생제는 배양 배지에 포함되는 경우. 문화가 신생아 쥐에서 설립되어 있기 때문에, 제한 ...
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공개 사항
이 작품은 굿 생리학과 건강 (AS)와 라이트 재단 파일럿 상 (AS)에 NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), 건강의 AGA-제너럴 밀스 벨 연구소 및 영양 연구 학술 상에 의해 지원됩니다.
감사의 글
저자는 공개 할 것이 없습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 조직 배양 시약 | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| 소르비톨 | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| 표피 성장 인자 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 면역 염색용 시약 | |||
| 염소 혈청 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| 마우스 mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V 및 7AAD | BD Pharmigen 559763 | ||
| 마우스 Fc 블록 for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| 장비 | |||
| 5ml 튜브 | Eppendorf | 30108310 | |
| 도립 현미경 | Motic | AE31 | |
| 생물 안전 캐비닛 및 인큐베이터 | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4웰 챔버 슬라이드 | Thermo Scientific | 177437 | |
| 냉장 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus 진공 구동 필터 시스템 | Genesee Scientific | 25-227 | |
| 형광 현미경 | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6웰 플레이트 | Corning | 3516 | |
| T25 플라스크 | TRP | 90026 | |
| T75 플라스크 | Corning | 43064 | |
| 해부 가위 | |||
| 게 | |||
| 단일 팁 Q-팁 | Kendall | 540500 | |
| 소프트웨어 | |||
| Metamorph 소프트웨어 (분자 장치) | 분자 장치 | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience |
참고문헌
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
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- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
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- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
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재인쇄 및 허가
