대식세포는 숙주 병원성에 관여하는 핵심 세포입니다. 대식세포는 단백질체 분석으로 분석하고 검출할 수 있는 표현형 및 기능적 다양성을 나타냅니다. 이 문서에서는 M1 또는 M2 표현형으로 분화된 인간 대식세포의 1차 배양에 대해 2D 전기영동을 수행하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에 설명된 2차원(2D) 전기영동 프로토콜의 목표는 인간 배양 대식세포의 표현형을 분석하는 방법을 보여주는 것입니다. 대식세포의 주요 역할은 염증성, 면역성 질환, 감염성 질환과 같은 다양한 병리학적 질환에서 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에서는 M1(전염증성) 또는 M2(항염증성) 표현형으로 구별할 수 있는 인간 단핵구 유래 대식세포의 1차 배양을 사용합니다. 이 시험관 내 모델은 M1 및 M2 대식세포의 생물학적 활성을 연구하고 단백질체학적 접근 방식에도 신뢰할 수 있습니다. 단백질체학 기법은 숙주 병원성 동안 M1 및 M2 대식세포의 표현형과 행동을 비교하는 데 유용합니다. 2D 겔 전기영동은 많은 수의 단백질 또는 폴리펩티드를 동시에 매핑하기 위한 강력한 단백질체학 기술입니다. 우리는 2D Differential Gel Electrophoresis(DIGE)라는 형광 염료를 사용하여 2D 전기영동 프로토콜을 설명합니다. M1와 M2 대식 세포 단백질은 첫번째 차원에 있는 그들의 등전 점, 및 두번째 차원에서 그들의 분자 질량에 따라, 등전 집중시키기에 의해 별거 전에 시아닌 염료로 레테르를 붙입니다. 그런 다음 분리된 단백질 또는 폴리펩티드 반점을 사용하여 단백질 또는 폴리펩티드 발현 수준의 차이를 감지합니다. 여기에 설명된 단백질체학 접근법을 통해 숙주 병원성 또는 미생물 독소와 같은 다양한 장애와 관련된 대식세포 단백질 변화를 조사할 수 있습니다.
서론
대 식세포는 별개의 기능 표현형을 획득 할 수있는 이기종 및 플라스틱 세포이다. 생체 내,이 세포가 미생물 제품, 사이토 카인 등. 1과 마이크로 환경 signalssuch의 큰 다양성에 응답합니다. 시험관, 염증성 표현형 (M1) 대 식세포의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 인터루킨 -4 (IL-4)와 같은 일부 사이토킨에 의해 항 염증 표현형 (M2)에 의해 유도 될 수있다. 또한, 대 식세포는 특정 신호 2에 따라, 반대로 M2 표현형에 활성화 된 M1에서 전환 할 수 있습니다.
표현형에 따라, 대 식세포는 다른 기능을해야합니다. M1 마크로파지는 미생물 또는 종양 세포 (3)를 죽이고, 종양 괴사 인자 α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인을 생산하는 세포이다. 반면, M2 식세포 안티 inflammator를 생성함으로써 상처 치유 및 섬유증과 같은 이러한 염증 반응을 방지3,4-을 TGF-β가 같은 Y 요인.
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프로토콜
이 프로토콜은 우리의 기관 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 건강한 사람의 기증자 버피 코트는 지역 수혈 센터 (릴, 프랑스)에서 얻었다. 버피 코트에서 얻은 샘플은 INSERM 컬렉션 (N ° DC2010-1209)로 선언됩니다.
1. 재료 및 문화 미디어 준비
- 1X PBS을 얻었다 멸균 증류수에 10 배의 인산 완충액 식염수 (PBS)에 희석.
- 와 10 % 풀링 된 인간 혈청이없는 겐타 마이신 (40 ㎍ / ㎖) 및 L- 글루타민 (2 mM)을 보충 RPMI 1640 배지를 확인합니다.
단핵구 유래 대 식세포의 2 차 문화 (MDM)
- 1X PBS와 buffycoat (25 ml)로 희석. 조심스럽게 실온에서 20 분 동안 1,600 XG에 피콜 / leucosep 튜브와 원심 분리기에로드.
- 새로운 튜브로 계면에서 단핵 세포를 수집합니다. 10 ml의 씻을 배는 PBS는 0.1 %의 에틸렌 디아민을 포함 1X1000 XG, 370 XG에 10 분간 각각 160 XG 다음 번 1X PBS 단독 160 XG에 10 분 동안의 연속적인 회 원심 의해 아세트산 (EDTA).
- 혈청 않고 ....
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결과
적절한 차동 프로테옴 분석을 수행하기 위해, 분석 할 시료의 처리를 확인해야합니다.
이전 5 공표 제시된 예에서, 대 식세포의 세포 배양 품질은 형태학 및 분자 양태 요구된다. 대 식세포에 단핵구의 분화와 문화의 동질성이 위상 현미경으로 하였다. 그림 1은 M1과 M2 대 식세포의 차 문화의 예를 보여 주었다. 도시 된 바와 같이, 우리는 M1 (그림 1A, B)과 M2 (그림 1C, D) 낮은에서 위상 현미경으로 문화의 날 (12)의 대 식세포의 아형 (그림 1A, C)와 높은 (그림 1B, D의 동질성을 확인 ) 확대. 분명히, 우리는 차 문화의 12 일 후 대 식세포 M1과 M2의 독특한 형태를 관찰했다. 이전에 출판 된, 우리는 RT-PCR에 의해 TNF와 IL1 코딩의 mRNA의 존재를 확인M2에 .......
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토론
본원에 기재된 프로토콜은 식세포, M1 (염증 유발)와 M2 (소염)의 두 아형의 다양한 자극의 영향을 분석하는 방법을 자세히. 이전에 7을 발표 한 M1과 M2 대 식세포의 차 문화는 단핵구의 분화에서 얻었다.
2D DIGE 겔 전기 영동 과정은를 Cy3 및 Cy5의 형광 용 스캐너 여기 / 발광 파장 두배 겔을 검사하기 위하여 SDS-PAGE 용 isoelectrofocusing 낮은 형광 플레이트 IEF 셀 같은 특수 재료 및 장비를 필요 및 2D 소프트웨어. 이 방법은 약간의 연습과 손재주를 필요로한다.
1) 단백질의 추출은 알부민이나 케라틴 등의 불순물이없는 환경에서 중요하며, 2) 어둠 라벨 및 전기 영동을 수행, 성공적 2D 겔 전기 영동에 대한 몇 가지 중요한 단계가있다. 피기술로서 용해 완충 용액에서 단백질 감소 DTT의 사용은 반응성 시아닌 염료 라벨링 전에 단백질의 펩티드 설파이드 결합.......
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공개 사항
선언된 이해 상충은 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Inserm의 지원을 받았습니다. Marion Bouvet는 프랑스 연구 기술부의 연구원입니다. Annie Turkieh는 유럽 연합 FP7 HOMAGE(305507)가 수여하는 펠로우입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| 겐타마이신 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| 인간 혈청 | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6웰 플레이트 PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| 지질다당류 | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| 필터 0.22 & 마이크로; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100ml 실린더 | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford 시약 | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-반응성 염료 | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG 스트립 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| 저융점 아가로스 | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix 시스템 | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE 이미저 스캐너 | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml 튜브 | 어떤 공급 업체 | 없음 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| 당신의é e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | 시그마-알드리치 | L3773 | |
| 브로모페놀 블루 | 시그마-알드리치 | 114391 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G6279 | |
| 아크릴아미드 40% | 바이오-라드 | 161-0148 | |
| 2D 클린 업 | GE 헬스케어 | 80-6454-51 | |
| 글리신 | 시그마-알드리치 | G7126 | |
| 희미&아큐트; 틸포름아미드 | 시그마-알드리치 | 22705-6 | |
| 전극 심지 | Bio-Rad | 165-4071 |
참고문헌
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al.
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