대식세포는 숙주 병원성에 관여하는 핵심 세포입니다. 대식세포는 단백질체 분석으로 분석하고 검출할 수 있는 표현형 및 기능적 다양성을 나타냅니다. 이 문서에서는 M1 또는 M2 표현형으로 분화된 인간 대식세포의 1차 배양에 대해 2D 전기영동을 수행하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
여기에 설명된 2차원(2D) 전기영동 프로토콜의 목표는 인간 배양 대식세포의 표현형을 분석하는 방법을 보여주는 것입니다. 대식세포의 주요 역할은 염증성, 면역성 질환, 감염성 질환과 같은 다양한 병리학적 질환에서 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에서는 M1(전염증성) 또는 M2(항염증성) 표현형으로 구별할 수 있는 인간 단핵구 유래 대식세포의 1차 배양을 사용합니다. 이 시험관 내 모델은 M1 및 M2 대식세포의 생물학적 활성을 연구하고 단백질체학적 접근 방식에도 신뢰할 수 있습니다. 단백질체학 기법은 숙주 병원성 동안 M1 및 M2 대식세포의 표현형과 행동을 비교하는 데 유용합니다. 2D 겔 전기영동은 많은 수의 단백질 또는 폴리펩티드를 동시에 매핑하기 위한 강력한 단백질체학 기술입니다. 우리는 2D Differential Gel Electrophoresis(DIGE)라는 형광 염료를 사용하여 2D 전기영동 프로토콜을 설명합니다. M1와 M2 대식 세포 단백질은 첫번째 차원에 있는 그들의 등전 점, 및 두번째 차원에서 그들의 분자 질량에 따라, 등전 집중시키기에 의해 별거 전에 시아닌 염료로 레테르를 붙입니다. 그런 다음 분리된 단백질 또는 폴리펩티드 반점을 사용하여 단백질 또는 폴리펩티드 발현 수준의 차이를 감지합니다. 여기에 설명된 단백질체학 접근법을 통해 숙주 병원성 또는 미생물 독소와 같은 다양한 장애와 관련된 대식세포 단백질 변화를 조사할 수 있습니다.
서론
대 식세포는 별개의 기능 표현형을 획득 할 수있는 이기종 및 플라스틱 세포이다. 생체 내,이 세포가 미생물 제품, 사이토 카인 등. 1과 마이크로 환경 signalssuch의 큰 다양성에 응답합니다. 시험관, 염증성 표현형 (M1) 대 식세포의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 인터루킨 -4 (IL-4)와 같은 일부 사이토킨에 의해 항 염증 표현형 (M2)에 의해 유도 될 수있다. 또한, 대 식세포는 특정 신호 2에 따라, 반대로 M2 표현형에 활성화 된 M1에서 전환 할 수 있습니다.
표현형에 따라, 대 식세포는 다른 기능을해야합니다. M1 마크로파지는 미생물 또는 종양 세포 (3)를 죽이고, 종양 괴사 인자 α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인을 생산하는 세포이다. 반면, M2 식세포 안티 inflammator를 생성함으로써 상처 치유 및 섬유증과 같은 이러한 염증 반응을 방지3,4-을 TGF-β가 같은 Y 요인.
이전 Boyum 6에서 적응 기술을 사용하여 5 바와 같이 건강한 기증자로부터 인간의 말초 혈 단핵 세포를 피콜 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리 하였다. 문화의 대 식세포는 차 문화 (7) 6 일 이후 M1 또는 M2 표현형로 분화 할 수있다.
단백질 발현 또는 숙주 병원성 미생물 또는 독소와 같은 다양한 제어되는 자극 하에서 식세포 두 아형 사이 단백질 변화 분석, 프로 및 소염 식세포의 기능을 해독하는데 도움이 될 것이다.
단백질 체학은 특히 업 또는 다양한 자극에 따라 인간 배양 된 대 식세포에서 아래로 조절되어 단백질의 직접 모니터링을위한 독특한 도구입니다. 형광 염료는 낮은 감도 및 이미지 분석 (8) 등의 2 차원 겔 전기 영동의 한계점을 해결 한 < / SUP>. 시스테인 잔기와 반응 염료는 리신 잔기 (9)와 반응에 비해 검출 감도가 증가하고있다. 이전의 연구에서는 고전 실버 염색 2 차원 전기 영동 (11)에 비해 부족한 시료 (10)의 분석을 위해 DIGE 포화 라벨링의 유용성을 입증 하였다. 이 기술은 빠른 속도로 대 식세포의 두 하위 유형 간 또는 동일한 하위 유형에서 치료 및 치료 대식 세포 사이의 단백질 변형을 분석하는 데 도움이됩니다.
이 단백질체 기술의 장점은 2D 겔 (12)을 분석하여 단백질의 크기 및 번역 후 변형의 정보에 대한 액세스를 가지고있다. 이 분석 될 수있는 샘플의 수를 제한하는, 이것이 높은 처리량 기법 아니다 고려되어야한다. 질량 분석을 기반으로 높은 처리량 분석의 개발 검토로는 최근에 13이을 향상시킬 수 있습니다.
_content "> 여기에서는 전기 영동 isoelectrofocusing의 과정을 통해 배양 된 대 식세포의 단백질 추출에서 2D DIGE 분석을 수행하는 방법을 제시하고, 적절한 2D 소프트웨어의 유용성에 대한 SDS-PAGE 정보뿐만 아니라.액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜은 우리의 기관 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 건강한 사람의 기증자 버피 코트는 지역 수혈 센터 (릴, 프랑스)에서 얻었다. 버피 코트에서 얻은 샘플은 INSERM 컬렉션 (N ° DC2010-1209)로 선언됩니다.
1. 재료 및 문화 미디어 준비
- 1X PBS을 얻었다 멸균 증류수에 10 배의 인산 완충액 식염수 (PBS)에 희석.
- 와 10 % 풀링 된 인간 혈청이없는 겐타 마이신 (40 ㎍ / ㎖) 및 L- 글루타민 (2 mM)을 보충 RPMI 1640 배지를 확인합니다.
단핵구 유래 대 식세포의 2 차 문화 (MDM)
- 1X PBS와 buffycoat (25 ml)로 희석. 조심스럽게 실온에서 20 분 동안 1,600 XG에 피콜 / leucosep 튜브와 원심 분리기에로드.
- 새로운 튜브로 계면에서 단핵 세포를 수집합니다. 10 ml의 씻을 배는 PBS는 0.1 %의 에틸렌 디아민을 포함 1X1000 XG, 370 XG에 10 분간 각각 160 XG 다음 번 1X PBS 단독 160 XG에 10 분 동안의 연속적인 회 원심 의해 아세트산 (EDTA).
- 혈청 않고 5 ml의 RPMI-1640 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 접시 당 1 × 106 세포의 밀도로 35mm 접시에서 세포를 시드.
- 배양기에서 90 분 동안 침전 후 비 부착 세포를 함유하는 상층 액을 제거한다. 1 ml의 PBS로, 단핵구의 3 배를 구성, 부착 세포를 씻으십시오; 그 이전에 혈청 무료 세포에 10 %를 포함하는 새로운 배지 (v / v)의 인간 혈청 1ml를 추가합니다.
- 배양 6 일 후에, 분화 된 대 식세포 대체 (M2)을 수득 재조합 인간 IL-4 (15 ng의 / ㎖)을 첨가 6 일 동안 유지한다. 그리고, M1 식세포를 수득 4 시간 동안 12 일째에 리포 폴리 사카 라이드 (100 NG / ml)로 분화 된 대 식세포를 치료.
2D 전기 영동을위한 M1과 M2 대식 세포 단백질의 3 추출
- 세척 macroph나이 25 mM 트리스, 30 mM 트리스 pH를 8, 4 % 3 포함하는 버퍼의 pH 7.4, 스크랩으로 3 회 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 (CHAPS), 2 M 티오 7 M 요소를.
- -20 ° C에서 얼음과 상점에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 적합한 혼합기를 사용하여 세포를 Lyse.
- 상업 브래드 포드 시약을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 단백질 100 ㎕ 분주을 저장합니다.
4. Isoelectrofocusing
참고 : 어둠 속에서 모든 라벨링 작업을 수행합니다.
- 37 ° C에서 1 시간 동안 2 mM 트리스 (2- 카복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)에 용해 버퍼와 9 μL로 조정 각각의 샘플 (M1 및 M2 대 식세포)의 5 μg의를 줄입니다.
- 0.8 nM의 / μg의 단백질 농도로 M1 및 M2 추출물의 설프 하이 드릴 - 반응성 염료 추출물 시아닌 3 (Cy3가)을 추가한다. M1로 시아닌 5 (Cy5에)를 첨가하고, M2는 0.8 nM의 / μg의 단백질 농도로 추출하여 부화37 ° C에서 30 분.
- 7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % CHAPS, 130 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 2 % pharmalytes 함유 시료 완충액의 동일한 부피의 첨가로 반응을 중지.
- 믹스 한 손으로 Cy5에 표지 M2 샘플과 M1 샘플을 Cy3에이 표지와 다른 손에 Cy5에 표지 M1 샘플과 M2 샘플을 Cy3에이 표지.
- 고정화의 pH 구배를 재수 (IPG) 스트립 (240mm, pH를 3-10 선형 구배) 7 M 우레아, 등전점에 2 M 티오 4 % CHAPS 초점을 포함하는 버퍼에 표시된 혼합 된 시료 450 μL와 (IEF) 전지 시스템 어떤 전류를 적용하지 않고 24 시간 동안.
- 3 시간, 3 시간 동안 마지막으로 8,000 V 8000 V에 그라데이션에서 6 시간 동안 1,000 V에 그라데이션에서 다음 3 시간 동안 300 볼트 (V)에서 초점을 수행합니다.
5. 두 번째 차원
참고 : 어둠 속에서 모든 전기 작업을 수행합니다.
- 평형 완충액에서 IPG 스트립 포함 부화10 분 동안 0.1 mM 트리스 - 염산 (pH를 8), 6 M 우레아, 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (/ V w) (SDS), 30 % (v / v) 글리세롤을 보내고.
- 12.5 %의 PAGE 젤에 두 번째 차원 (SDS 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE))에 대한 평형 IPG 스트립을 전송하고 아가 로스 로우 - 녹는 밀봉.
- 브로 모 페놀 블루 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 밤새 300 V이어서 70 V의 정전압 Ettan-Daltsix 시스템을 사용하여 20 ° C에서 전기 영동을 수행.
6. 이미지 인식 및 바이오 인포 매틱스 분석
- Cy5에 100 ㎛의 화소 크기로 이미지를 산출하기 위해 Cy3에 대한 580분의 532 nm 내지 670분의 633 나노 미터의 여기 / 방출 파장에서 DIGE 이미 저 스캐너 두 낮은 형광 유리판 사이에 캐스팅 스캔 젤.
- 이전에 (12)을 설명하는대로 상용 소프트웨어와 이미지 분석을 수행합니다.
- 계산하고 각 이미지에 자리 볼륨을 정상화. 소품으로 정규화 된 자리 볼륨을 할당각 지점의 총 가치의 ortion 젤에서 검출.
- 두 그룹 (M1 및 M2) 간의 정규화 스폿 볼륨 값을 비교하여 대 식세포의 각 유형에 대한 단백질 스폿 볼륨의 차이를 분석한다. 변화가 1.5 배 (p <0.05, 일방향 ANOVA 분석) 인 경우 상당한 것으로 스폿 볼륨 사이의 차이를 고려한다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
적절한 차동 프로테옴 분석을 수행하기 위해, 분석 할 시료의 처리를 확인해야합니다.
이전 5 공표 제시된 예에서, 대 식세포의 세포 배양 품질은 형태학 및 분자 양태 요구된다. 대 식세포에 단핵구의 분화와 문화의 동질성이 위상 현미경으로 하였다. 그림 1은 M1과 M2 대 식세포의 차 문화의 예를 보여 주었다. 도시 된 바와 같이, 우리는 M1 (그림 1A, B)과 M2 (그림 1C, D) 낮은에서 위상 현미경으로 문화의 날 (12)의 대 식세포의 아형 (그림 1A, C)와 높은 (그림 1B, D의 동질성을 확인 ) 확대. 분명히, 우리는 차 문화의 12 일 후 대 식세포 M1과 M2의 독특한 형태를 관찰했다. 이전에 출판 된, 우리는 RT-PCR에 의해 TNF와 IL1 코딩의 mRNA의 존재를 확인M2에 ...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본원에 기재된 프로토콜은 식세포, M1 (염증 유발)와 M2 (소염)의 두 아형의 다양한 자극의 영향을 분석하는 방법을 자세히. 이전에 7을 발표 한 M1과 M2 대 식세포의 차 문화는 단핵구의 분화에서 얻었다.
2D DIGE 겔 전기 영동 과정은를 Cy3 및 Cy5의 형광 용 스캐너 여기 / 발광 파장 두배 겔을 검사하기 위하여 SDS-PAGE 용 isoelectrofocusing 낮은 형광 플레이트 IEF 셀 같은 특수 재료 및 장비를 필요 및 2D 소프트웨어. 이 방법은 약간의 연습과 손재주를 필요로한다.
1) 단백질의 추출은 알부민이나 케라틴 등의 불순물이없는 환경에서 중요하며, 2) 어둠 라벨 및 전기 영동을 수행, 성공적 2D 겔 전기 영동에 대한 몇 가지 중요한 단계가있다. 피기술로서 용해 완충 용액에서 단백질 감소 DTT의 사용은 반응성 시아닌 염료 라벨링 전에 단백질의 펩티드 설파이드 결합...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
선언된 이해 상충은 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Inserm의 지원을 받았습니다. Marion Bouvet는 프랑스 연구 기술부의 연구원입니다. Annie Turkieh는 유럽 연합 FP7 HOMAGE(305507)가 수여하는 펠로우입니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| 겐타마이신 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| 인간 혈청 | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6웰 플레이트 PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| 지질다당류 | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| 필터 0.22 & 마이크로; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100ml 실린더 | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford 시약 | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-반응성 염료 | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG 스트립 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| 저융점 아가로스 | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix 시스템 | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE 이미저 스캐너 | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml 튜브 | 어떤 공급 업체 | 없음 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| 당신의é e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | 시그마-알드리치 | L3773 | |
| 브로모페놀 블루 | 시그마-알드리치 | 114391 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G6279 | |
| 아크릴아미드 40% | 바이오-라드 | 161-0148 | |
| 2D 클린 업 | GE 헬스케어 | 80-6454-51 | |
| 글리신 | 시그마-알드리치 | G7126 | |
| 희미&아큐트; 틸포름아미드 | 시그마-알드리치 | 22705-6 | |
| 전극 심지 | Bio-Rad | 165-4071 |
참고문헌
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
