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방법 논문

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

7.1K 조회수

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DOI:

10.3791/52224

⸱

2016년 9월 25일

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1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

이 논문에서

요약

지속적인 성장 조절 공급을 사용한 영양소 조절은 교반 현탁 생물 반응기에서 배양에 대한 간헐적 배치 공급에 비해 포유류 세포 스페로이드의 성장 속도를 향상시킵니다. 이 연구는 간단한 조정된 비율 공급 배양을 설정하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

초록

이 시연에서는 β-TC6 인슐리종 세포주에서 형성된 스페로이드를 포유류 섬 세포 제품 제조 모델로 배양하여 영양소 수준을 조절하면 세포 수율을 향상시킬 수 있는 방법을 보여주었습니다. 이전 연구에서 생물반응기는 정적 배양에 비해 배양량 증가를 촉진했지만 세포 수율의 증가는 관찰되지 않았습니다. 배치 수유 사이에 소비된 포도당과 같은 주요 영양소의 제한은 세포 증식의 제한으로 이어질 수 있습니다. 포도당 수치의 큰 변동은 매체에서 포도당 농도의 증가에도 불구하고 관찰되었습니다. 연속 공급 시스템을 사용하면 포도당 수치의 변동이 제거되고 배치 공급 정적 및 SSB 배양 방법과 비교할 때 세포 성장률이 향상되었습니다. 계산된 영양소 소비량에 따라 사료 비율을 조정함으로써 성장률의 추가 증가가 관찰되었으며, 이를 통해 배양에서 3주 동안 생리적 포도당을 유지할 수 있었습니다. 이 방법은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

서론

이식 가능한 기능적 인간 세포의 다수를 생성하기 위해, 배양 조건의 조절이 필수적이다. 3 - 신진 대사 폐기물의 축적과 함께 영양분의 고갈은 셀 제품 1의 품질이 저하 노화 및 대사 변화에 중요한 기여한다. 이 절차는 배양 기간에 걸쳐 생리 학적 범위 4 글루코스를 조절하는 조절 된 속도로 관류 공급 시스템과 결합 교반 생물 반응기를 사용 타원체의 포유 동물 세포 배양하는 방법을 보여준다. 이 연구의 목적은 생리적 인 범위는 100 내지 200 밀리그램 / DL로 정의 하였다. 동일한 방법이 다른 영양소 및 락 테이트 대사 폐기물을 조절하기 위해 사용될 수있다.

작은 볼륨의 정적 문화 (1-30 ml)을 일반적으로 experime에 대한 세포 라인을 유지하고 차별화하는 실험실 환경에서 사용되는ntal 목적. 세포 계대는 정기적으로 필요한 완전 배지 변경과 함께 수행된다. 대부분의 "기존의"문화 매체는 영양 제한의 위험없이 덜 자주 매체 변경을 허용하는 높은 포도당 농도 (이 연구에 사용 된 DMEM 450 밀리그램 / DL)가 있습니다. 그러나,이 배치 급지에있어서 여전히 빈번한 조작을 필요로하는 세포의 환경에서 변화를 도입하고, 5 오염의 위험이 증가한다 - 9. 교반 정지 생물 반응기는 (SSB)는 더 나은 혼합을 제공하고 3,10 취급 감소 - 20 만, 정적 문화처럼, 영양 및 폐기물 제품 수준의 잠재적 인 손상 변동에 기여 설명서 매체의 변화가 필요합니다. SSB 문화의 관류 공급 연속 주입 및 매체의 제거,하지만 인해 세포 성장에 영양 수준에서 큰 변화로 이러한 문제가 문제가 남아 줄일 수 있습니다. 조정 된 공급 라의 사용예상 셀 요구 사항에 따라 영양소 사용량 계산에서 TE는 세포 생존을 최적화하는데 필요한 안정적인 셀 환경을 제공하고, 21 작용할 수 - 24.

25 구체적으로 만능 세포의 배양 및 확장을위한 포유 동물 세포의 확장 SSB 문화에 대한 방법을 설명하는 문학의 큰 몸이있다 - 다른 사람과 (32), 섬 (베타) 세포 17,33,34에 초점을 맞춘이, 또는 생물 의약품 24의 생산, 35-38. 이러한 연구 세포 종류의 많은 구형 배양에서 성장 될 수 있고, 사용되는 세포 유형에 대한 구체적인 절차는 연속 공급 시스템을 구현하기 이전에 최적화되어야한다. 43 -이 예제에서, 관류 공급 방법은 교반 생물 반응기 (39) 회전 타원체로 성장 베타 세포주를 확장 하였다. 본원에 기재된 방법을 제공한다타겟 배양 조건을 달성하기 위해 오프라인 혈당 측정에 기초하여 조정 레이트 공급의 간단한 구현. 이 방법으로 공급 속도를 조절하는 생리적 포도당 수준이 증가 세포 수율에 표시됩니다 유지합니다. 포유 동물 세포는 에너지 생산을 위해 중요한 영양소, 포도당에 의존하므로,이 세포주의 사용은 많은 포유류 배양 세포 (44)의 모델을 나타낸다. 또한,이 라인은 포도당 45 만성 높은 수준에 민감한 베타 세포의 추가의 복잡성을 예시한다. 본 연구를 위해, β-TC6 세포는 생체 내에서 랑게르한스섬의 평균 크기는 대략 배양 타원체를 형성시켰다. 관류 생물 반응기 시스템 (17) - 소비 포도당 조정 된 공급 속도와 19,21,46은, 생존의 변화없이 생리 학적 조건과 높은 셀 수율을 유지하는 결과.

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프로토콜

1. 세포주 및 유지 관리

  1. 구하는 β-TC6 세포 (또는 다른 원하는 부착 포유 동물 세포 라인). 연구를위한 준비, 문화, 통로, 그리고에서 제공 지침에 따라 세포를 cryopreserve.

2. 연속 급지 시스템을 조립

주 - 19,21,47 - (49) 아래의 방법에 연속 공급 시스템 설계 문헌 17에 기술 된 것과 유사한 시스템을 기반으로한다. 여기에서 사용 된 시스템의 조립 이전 문헌 3에 상세히 설명한다.

  1. 중간 저수지, 연동 펌프, 교반 생물 반응기, 폐기물 저장소, 맞춤 설계 튜브 / 샘플링 세트 : 다섯 가지 주요 구성 요소로 이루어져 공급 시스템에 필요한 구성 요소를 수집합니다.
    1. 1 L 유리 병, 2 L의 유리 병을 사용하여 폐기물 저장조 및 stirre를 사용하여 저장 매체를 마련(선반 판 OFF) 250 ml의 유리제 반응기를 이용하여 D 생물 반응기.
    2. 매체 교환을 제어하는 ​​8 채널 펌프 헤드와 디지털 연동 펌프 또는 유사한 펌프를 사용합니다.
    3. 통과 포트 살균 필터를 통해 환기를 제공하고, 저수지 및 생물 반응기 사이의 매체 전송을 허용하는 스테인리스 파이프와 하드 및 오토 클레이브 플라스틱 저장 및 수정 된 생물 반응기 뚜껑을 생산하고 있습니다. 또한, 다양한 벤더의 흐름 포트가있는 전문 뚜껑을 구입할 수 있습니다.
      참고 : 생물 반응기 뚜껑은 선택 사항 계측 및 모니터링 프로브 (예를 들어, 산소 모니터)에 대한 추가 통과 포트를 포함 할 수있다.
    4. 40 [㎛] 내지 60의 평균 세공 크기의 범위가 다공질 유리 통기 튜브의 제조 유출 관 (OT) 및 개질 SSB 뚜껑 40 %의 기공 밀도를 첨부. 또한, 문화의 특정 요구 사항에 따라 다른 유출 튜브를 선택합니다.
      참고 : 선택OT 공경 (자세한 내용은 제 6 및 문헌 3에 기재된 바와 같이) 배양 세포 집합체를두고 중간 및 세포 파편을 제거한다.
  2. 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 튜브 커넥터 및 내구성 연동 펌프 호스에서 오토 클레이브 관류 튜브 세트를 조립합니다. 단면의 길이가 다른 구성 요소 사이의 거리에 의존한다.
    주 : 장기 실험 내구성과 신뢰성을 보장하기 위해 튜브의 다양한 선택할 때 특별한주의하십시오.
  3. 급전선, 폐 라인 및 샘플 라인 세 부분에서 설정 튜브를 조립한다.
    1. 두 튜브 직경 (L / S (14) L / S (13))를 사용하여, 급전선을 조립한다. 매체 저장소의 생물 반응기에서의 거리를 스팬하는 기본 튜브에 대한 L / S (14)를 사용하여 적절한 PVDF 어댑터를 사용하여 펌프 부에 대한 튜브의 길이의 중간에 / S 13 L의 짧은 길이를 삽입한다.
    2. 표준 PVDF 호스 철 TUBI를 사용하여NG 어댑터 짧은 펌프 부 (L / S 13) 튜브의 양측에 L / S (14) 튜브 두 조각 가입.
      주 : 달리, 튜브의 전체 길이는 더 작은 직경의 L / S (13) 튜브 일 수 있고, 펌프 부 무결성 문제의 경우는 전체 튜브 길이가 대체 될 수있다.
  4. 큰 직경 (L / S 16) 튜브를 사용하여 폐기물 제거에 대한 두 번째 튜브 섹션을 조립하고 펌핑 섹션에 대한 중간에 L / S (14) 튜브의 짧은 섹션을 삽입합니다. 급전선 어셈블리 PVDF 호스 - 철 어댑터를 사용하거나, 대안 적으로 원하는 펌프 호스 크기의 연속 길이를 사용하고, 필요에 따라 대체로서 이는 동일한 방식으로 수행된다.
    참고 : 동일한 펌프의 펌프 헤드를 공급 회로 및 폐 회로에 사용하는 경우, 폐기물 제거 튜브 라인 펌프 부는 공급 라인의 펌프 부보다 큰 직경이어야한다. 이 제거 펌프 속도는 이송 속도보다 빠르다는 것을 보장하고, 적정량을 피할배양 부피에 큰 변화를 IAL, 오버 플로우의 위험성을 감소시킨다.
  5. 샘플 수집 조립 : 튜브 세트의 마지막 구성 요소를 조립합니다.
    1. 이 절차는 포트 시스템을 샘플링 조립 사용자 정의를 설명; 대안으로, 멸균 샘플링 포트는 여러 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다.
    2. T 자 형 PVDF 커넥터와 함께 연결된 세 개의 짧은 (~ 6cm) L / S (14) 튜브 길이, 그리고 튜브 길이의 두에 두 개의 작은 호스 클램프에서 세트를 구축합니다.
    3. 클램핑 길이 중 하나에 가스 누출 용 멸균 가스 필터를 장착하고, 다른 하나는 멸균 샘플링 주사기에 연결하기 위해 사용된다 (살균 가스 필터만큼 살균 필터가없는 살균 다음 바이오 안전 캐비넷에 추가 될 필요가있다 오토 클레이브).
    4. 생물 반응기의 뚜껑에 부착 된 스테인레스 스틸 샘플 커넥터에 세 번째 끝을 연결합니다.
    5. 시작하기 전에 생물 반응기에 접속하는 동안 샘플링 어셈블리 압력솥실험 (아래 3 단계 참조).
    6. 연속 공급 과정을 방해하지 않고 필요에 따라 생물 반응기에서 무균 샘플을 수집하기 위해이 어셈블리를 사용합니다.

3. 압력솥 모든 자료

  1. 오토 클레이브 멸균에 대한 모든 생물 반응기 구성 요소를 준비합니다.
  2. 살균 개별 구성 요소를 수집합니다. (단계 2.1.1 조립) 중간 및 폐기물 저수지, (2.1.1 조립) 250 ml의 스피너 플라스크, 필요한 수정 뚜껑 (2.1.3 조립), (2.1.4에서 설명) 유출 관, 세 개의 튜브 세트 ( ) 연속 공급에 필요한 섹션 2.2 through2.5), 유출 관 (조립.
    1. 뚜껑의 상단에 사용자 정의 조립 샘플링 포트 (섹션 2.5), 기타 샘플링 포트를 모든 구성 요소와 스피너 플라스크를 조립하고 유출 튜브가 완전히 (섹션 2.1.4에서 설명) 스피너 플라스크 내부에 부착되어 있는지 확인하고, 연결 .
    2. 자동으로 전체 스피너 플라스크 어셈블리를 감싸테이프를 나타내는 클레이브 랩 재료 및 오토 클레이브. 랩은 밀폐 있는지 확인합니다. 주 : 언 래핑 때 배양기 내부 튜브 세트에 연결되지 않은 때, 알루미늄 박 또는 유사한 재료가 커넥터의 무균 상태를 유지하기 위해 생물 반응기 뚜껑의 각 액세스 포트의 각 단부를 커버하는 데 사용할 수 / 종료한다.
    3. 매체 및 폐기물 저수지의 수정 뚜껑을 조립 한 후 각각의 유리 병에 부착합니다. 알루미늄 박을 사용하여 커버 테이프를 나타내는 압력솥.
    4. 최종 조립을 지원하기 위해 오토 클레이브 포장 및 테이프 - 개별 튜브 세트 (2.5 절 2.2) 포장. 언 래핑시 알루미늄 호일 또는 유사한 재료가 커넥터의 무균 상태를 유지하기 위해 설정된 각 튜브의 각 단부를 래핑하는 데 사용될 수 / 종료한다.
    5. 표준 오토 클레이브에 건조 사이클을 사용하는 모든 항목을 감싸 압력솥 (예, "비티"~ 30 분 이상 121 ℃에서 15 psi의 설정).
      참고 : 멸균 연결하지 마십시오그들은이 확인되지 않는 한 이전 고압 증기 멸균에 필터는 오토 클레이브 안전합니다.

4. 회전 타원체 형성

참고 :이 기술은 문헌 17에 기술 된 것과 유사하다 - 다른 포유 동물 세포 배양을위한 52 - 19,21,50. 살균을 다음 모든 절차는 층류 후드에서 수행하고 세포 배양을위한 무균 조건을 유지하기 위해 멸균 장갑을 사용한다.

  1. 충분한 셀 수량까지 (공급 업체에 의해 기술) 표준 자기편 문화의 모든 조건, 문화, 확장 β-TC6 세포 생물 반응기의 수를 시드를 얻을 수있다.
    1. 도 1에 도시 된 제 2 항에 기술 된 바와 같이, 유출 관으로 연속 공급 생물 반응기를 조립하고, 샘플에 뚜껑 샘플링 포트를 연결한다. 주 : 유출 관 및 샘플링 포트 조립체는 bioreact 추가되어야연속 공급이 시작될 때까지 또는 사전 타원체 형성 지속적인 공급을 위해, 상기 배양 배지로부터 인상한다.
    2. 오토 클레이브에 의해 수정 된 SSB 어셈블리를 소독 (3 절에서 설명).
    3. 상기 스피너 플라스크의 뚜껑, 중간 및 폐기물 용기의 해당 위치에 멸균 통풍구 (0.22 ㎛ 이하 살균 필터)를 연결합니다.
      주 :이 증기 잠금을 방지하고, 인큐베이터 (5 % CO 2) 환경 생물 반응기 사이의 가스 교환을 허용하는 것이 중요하다. 가스 교환 중탄산 완충 매체를 사용할 때 정확한 pH를 유지하는 것이 필요하다.
  2. 이 기계적인 교반의 도움을 실온에서 (w / v)의 트립신 0.53 mM의 EDTA 용액 0.25 %를 사용하여 부드럽게 트립신 처리하여 세포를 수집 - 3 분, 약 1.3 × 106 세포 / ml의 밀도로 생물 반응기에 시드 200 ㎖의 배지이다.
    1. 인큐베이터에서 지정 플라스크를 이동바이오 안전 캐비넷에.
      주 : 모든 세포 배양 및 조작 적절한 무균 기술을 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
    2. 흡입에 의해 플라스크에서 배지를 제거합니다.
    3. 플라스크에 (++ ++ 칼슘 또는 마그네슘없이) 포스페이트 완충 염수 5 mL를 피펫 팅하고, 세포 표면에 걸쳐 세척하여 세포를 세척 한 후 PBS를 흡인.
    4. 수집 각 플라스크 (일반적으로 약 10 배 175cm이 T-플라스크)에 트립신 - EDTA 용액 3 ㎖를 추가합니다.
    5. 바이오 안전 캐비넷에서 3 분 - 수확 세포가 2 상온에서 부화 할 수 있습니다.
    6. 플라스크 표면으로부터 세포를 느슨하게 한 플라스크에 (혈청) 배지 6 ㎖에 첨가하여 세포를 수집하고, 50 ㎖ 튜브에 세포를 전송하기 위해 손으로 부드럽게 교반한다. 한 50 ㎖ 튜브가 가득 할 때 필요한 모든 세포가 수집 될 때까지, 다른 50 ㎖ 튜브를 사용하여 (약 50 ㎖ 튜브 매 5 T-175 플라스크에 필요한 것모은).
    7. 조심스럽게 원심 분리기 (약 50 X 중력) 수집 된 세포 현탁액은 세포 펠렛합니다.
    8. 그대로 펠렛을 떠나 남아있는 매체를 기음.
    9. 배양 배지 (혈청 포함)에 펠렛을 재 - 현탁 피펫을 사용하여 동일한 튜브에 모두 펠렛을 전송하여 단일 튜브 내에서의 모든 셀을 모은다.
    10. 문헌 53에 개시된 바와 같이 트리 판 블루 염색 표준 혈구를 이용하여 세포 밀도를 계산.
    11. 각 조건 (1.3 × 10 6 세포 / ml이 데모의 대상으로 시작 세포 밀도이었다)에 대한 SSB를 멸균하는 전체 세포의 원하는 번호를 추가합니다.
    12. (200 ㎖ 배양 용적이이 연구에 사용 된) 목표 전 배양 부피에 도달하는 피펫을 사용 SSB (이 경우에 우리는 생리 학적 범위 내에서 중간 포도당 레벨을 사용하여 원하는 글루코오스 농도) 배지를 추가한다.
      참고 : SSB는 용돈을 연구 이러한 지속적인 공급을 위해 ltures는 배지 (100 밀리그램 / DL)의 수정 된 "낮은 혈당"버전을 사용 시드 하였다. 이 배양 아니라 "고 포도당"중간에서 시작하여 글루코오스 소비는 공급을 시작 생리적 범위 아래로 글루코스 레벨을 가지고 대기보다 원하는 목표 글루코스 농도에서 시작시켰다. 이러한 연구에 공급하기위한 다른 모든 매체는 표준 "고 포도당"매체 (500 밀리그램 / DL)을 사용했다.
    13. 세포 배양 인큐베이터 내부에 교반 판에 세포와 SSB를 이동합니다.
  3. 스페 로이드를 형성 할 수 있도록, 5 % CO 2, 100 % 상대 습도 및 70 rpm의 교반 속도로 37 ℃에서 3 일간 먹이없이 생물 반응기에서 배양 세포.
    참고 : 심각한 확산이 삼일 회전 타원체의 형성 기간 동안 관찰 될 수 없습니다.
  4. 회전 타원체 형성 한 후, 원하는 배양 조건과 생물 반응기 사이에서 회전 타원체를 나눕니다.
제작 "> 5. 연속 급지 문화와 조정 이송 속도

  1. (- (4) 단계 2) 오토 클레이브 가스는 모든 성분을 살균 및 멸균 기술을 이용하여 생물 안전 캐비넷에 조립한다.
  2. 구형 형성 한 후, 배양기에서 SSB를 제거한 생물 안전 캐비넷에 연속 공급 시스템의 부품을 조립한다.
    1. 우선 원하는 배양 배지를 갖는 새로운 배지 저장조를 충전하고 급전선의 일측에 연결한다. 또한 새로운 배지 저수지가 제대로 살균 필터로 배출되어 있는지 확인합니다.
    2. 살균 방식으로 생물 반응기에 공급 물 유입구 급전선의 일측을 연결한다. 멸균 필터 급전선하고 생물 반응기에 들어가기 전에 매체를 필터링하는 생물 반응기 유입구 사이에 설치한다.
    3. 생물 반응기 유출 튜브와 매체 폐기물 저장소에 폐기물 라인을 연결하고 폐기물 저장소가 제대로 steril로 배출되어 있는지 확인전자 필터.
  3. (이것은 아마도 용기 및 배관을 모두 수행하기 위해 두 사람이 필요합니다) 생물 안전 캐비닛에서 어셈블리를 이동하고 장기 문화의 모든 구성 요소를 넣어.
    1. 구형 형성 (37 ° C, 5 % CO 2, 습도 100 %, 70 RPM)에 대해 동일한 배양 매개 변수를 사용하여 배양기 내부의 교반 플레이트 상 SSB을 넣어. 참고 : 선이 문 개스킷을 통해 오히려 밖으로보다 인큐베이터 옆에 구멍을 통해 실행해야 할 경우 일시적으로 생물 반응기에서 튜브 세그먼트를 분리 할 필요가있다. 이것을 알루미늄 박 고압 살균 전에 (단계 3)와 튜브 세트의 끝을 배치하고, 생물 반응기의 인큐베이터 안에까지 공급하고 폐기물 튜브 섹션의 바이오 리액터의 측면에 부착하는 대기에 의해 무균 방식으로 수행 될 수있다. 바이오 리액터에 튜브 라인 위치에 배치 될 수 있고, 알루미늄 포일은 인큐베이터 안에 제거 될 수 있고, 빨리 부착.
    2. 아웃 인큐베이터 액세스 포트를 통해 튜브 세트의 나머지 끝 (생물 반응기 뚜껑에 연결되지 않은 사람)를 실행 (스루 패스), 또는 인큐베이터 도어 개스킷의 한 단계를 통해.
    3. (근처의 바이오 안전성 캐비닛 가능한 경우)에 인큐베이터의 외부 신속하게 새로운 배지 저수지에 공급 라인 및 매체 폐기물 저장소에 폐기물 라인을 연결하고 폐기물 저장소가 제대로 살균 필터로 배출되어 있는지 확인합니다. 참고 : 무균 방식으로이 작업을 수행 (이 연결이 바이오 안전성 캐비닛의 외부에서 수행해야하는 경우 특히) 가능한 한 빨리 각 선박 배관 및 용기 커넥터에서 알루미늄 호일을 제거하고 연결합니다.
    4. 근처에 미니 냉장고 내부 (원하는 피드 매체 가득) 신선한 중간 저장을 넣습니다. 공급 및 폐기물 라인 인큐베이터를 종료하고 닫는 각 문을 방지하지 않고 냉장고를 입력 할 수 있는지 확인하십시오. 또한 급전 L 것이 중요아이 네스는 냉장고 또는 창업 보육 센터 중 하나의 문에 의해 폐쇄 끼되지 않습니다.
      참고 :이 연구에 사용되는 매체는이 셀 유형에 대한 공급 업체에서 권장하는 표준 높은 혈당 (500 밀리그램 / DL) 배지이었다. 상관 고 글루코스 배지를 배양되는 세포 유형의 특정 요구에 따라 이용 될 수있다. 급식 배지의 글루코스 농도가 상기 공급 시스템은 적절한 공급 속도를 유지하면서 배양에서 적절한 혈당 레벨을 유지하는 고 글루코스 배지의 공급 속도를 증가 의존으로 배양에서 원하는 농도보다 합리적으로 (2 배 이상) 더 높아야 .
    5. 다음으로, 폐기물 중간 저장소는 편리한 위치에 인큐베이터 외부 벤치 상단에 넣어 수 있습니다.
    6. 다음으로, 공급 라인은 SSB로 새로운 배지 저장소로부터 매체를 펌핑 할 수 있도록 적절한 방향을 보장 펌프 헤드에 공급하고 폐기물 라인 "펌프 부"및 폐액 라인 배치SSB에서와 폐기물 중간 저수지 중간 펌프됩니다.
  4. 원하는 이송 속도에 펌프를 켭니다.
    1. 문헌 3에서 아래 제공된 대표적인 결과 절에서 설명한 조정 된 공급 속도 식을 사용하여 이송 속도를 계산한다.
    2. 배양에서 원하는 혈당 농도를 유지하기 위해 필요한 공급량을 추정 성장 예측과 함께 가장 최근의 셀 개수 정보 (단계 5에 기재된 방법) 및 매체 혈당 측정을 사용한다.
      참고 : 세포 성장 속도와 포도당 소비율이 절차를 수행하기 전에 획득해야합니다.
    3. 계산 된 이송 속도를 기반으로 펌프 속도를 설정한다.
  5. (상술 한 방법 3 일)에 공급 속도 계산을 반복하고, 각 샘플링 점의 펌프 속도를 조절한다.

6. 세포 수, 생존, 그리고 포도당 농도 측정

<올>
  • 원하는 3 일, 또는 각 생물 반응기에서 샘플을 수집합니다.
  • 위에서 설명한 전문 샘플링 포트를 사용하여 연속적으로 공급 SSB 문화에서 문화 샘플을 가져 가라.
    1. 생물 반응기 내부에 연속적으로 공급 SSB를 떠나, 샘플링 포트 않은 필터링 연결로 (5 ㎖의 볼륨 주사기는이 연구에 사용 된) 멸균 주사기를 연결합니다.
    2. 배양 배지로 다운 샘플링 튜브를 이동합니다.
    3. 주사기가는 튜브 섹션을 클램핑 해제하고, 원하는 총 샘플 부피를 철회.
    4. 그것이 더 이상 배양에 침수되도록 샘플링 튜브 위로 이동하지 않고, 공기가 제거 될 때까지 주사기를 철회하는 것을 계속한다.
    5. 주사기를 공급 튜브를 클램프, 샘플이 들어있는 주사기를 분리하고 따로 설정합니다.
    6. 공기와 두 번째 신선한 멸균 주사기를 사전로드 샘플링 포트의 살균 필터 측에 연결합니다.
    7. 의 주사기 필터 측에가는 관을 언 클램프다음 샘플링 포트 및 부드럽게 멸균 주사기 필터를 통해 공기를 배출하기로 샘플링 포트를 제거. 이것은 샘플링 포트 잔여 매체 알 수있는 것을 보장한다.
    8. 튜브 필터에가는 다시 클램프, 멸균 주사기를 분리하고 폐기합니다.
  • 문화의 세포 샘플이 들어있는 주사기를 가지고, 그리고 10 ML 튜브로 추방. 알려진 볼륨의 하위 샘플이 튜브에서 직접 수행 할 수있다.
  • 세포 수의 경우, 세포의 알려진 볼륨을 제거하고 마이크로 원심 분리기 튜브로 전송하고, 부드럽게 1 원심 분리기 - 2 분 (약 50 X 중력).
  • 혈당 측정을위한 별도의 튜브에 상청을 전송하고, 트립신 EDTA 용액의 동일한 용적 펠렛 (0.25 % (w / v)의 트립신, 0.53 mM의 EDTA)를 다시 일시 및 표준 혈구를 사용 중으로 카운트 문헌 53에 개시된 바와 같이 청색 염색을 트리 판.
    1. 에 매체 (혈청) 추가필요에 따라 희석에 대한 샘플.
    2. 세포를 세어, 라이브 (염색) 세포를 기록하여 세포 생존율을 산출하고, 독립적으로 죽은 (염색) 세포 (생존 % = 살아있는 세포 / 총 세포).
  • 혈당 측정기와 일회용 테스트 스트립을 사용하여 삼중 중간 혈당치를 측정한다.
    1. 혈액 배양 배지를 대체 포도당 미터의 지시에 의해 설명 된 바와 같이 혈당 측정을 수행.
    2. (세 개의 복제가 권장) (위의 카운트 샘플에서 수집) 테스트 할 수있는 매체에 테스트 스트립을 찍어, 그리고 복제의 원하는 번호를 반복합니다.
    3. 포도당 농도에 대한 새로운 배지 및 폐기물 매체 모두를 테스트합니다.
      주 : 일부 미터를 들어, 측정 미만 20 밀리그램 / DL (미터의 검출 임계 값), 미터 출력 오류로 관찰 할 수있다.

    • 7. 회전 타원체 침강 속도 측정

    1. 그 CEL을 보장하기 위해L 개의 클러스터가 연속 공급 시스템에 의해 제거되지 않는, 직경이 큰 플라스틱 피펫 그들의 침강을 관찰하여 β-TC6 타원체의 침전 속도를 측정한다.
    2. 전술 한 바와 같이 SSB 생물 반응기에서 배양 β-TC6 세포는 타원체를 형성한다.
    3. 배양 3 일 후, 50 ㎖ 튜브에 회전 타원체 현탁액 장소 30ml의 샘플을 채취.
    4. 부드럽게 피펫 균일하게 정지에 배포하는 넓은 직경 25 ml를 피펫을 사용하여 아래로, 다음 피펫 (예를 들어, 20 ㎖ 마크)의 알려진 수준에서 현탁액으로 피펫을 중지 한 다음 회전 타원체의 모든 시간을 기록 5cm를 해결.
    5. 통계 신뢰를 얻기 위해이 절차를 충분히 번 반복 (일반적으로 N> 3).
      주 : 생물학적 연구를 위해, AP 값 0.05는 측정을 비교할 때 통계적으로 유의 한 것으로 간주된다. 평균의 표준 오차는 오류보고에 사용하고, 두 쌍의 않은 학생 t 테스트 꼬리제시된 데이터에 대한 조건과 비교하기 위해 사용되었다.

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    결과

    중간 포도당 수준 및 변동 표준 SSB 문화의 세포 확장을 제한

    포도당 수준은 배양 기간 3를 통해 정적 문화와 SSB 문화에 변동. 이러한 변동은 21 일의 배양 기간 동안 세포 수의 증가와 함께 강화하고 정적 배양 SSB 모두에서 거의 동일 하였다. 이러한 관찰은 이전 발행 3에 제시되어있다. 포도당 수준은 두 가지 방법의 배양 기간의 기간 동안 슈퍼 생리가 될 수 있습니다. 이 만성 노출은 세포 성장 억제 (54)가 있기 때문에, 연속 공급 시스템은 혈당 변동을 제거하고 구형의 배양 동안 영양소 제어를 개선하기 위해 개발되었다.

    회전 타원체 문화에 대한 지속적인 먹이 시스템

    지속적으로 새로운 배지를 추가하고 배양 기간 동안 오래된 매체를 제거단순 배지...

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    토론

    (58) - 생물학적 제제와 세포 치료에 대한 생산을위한 포유 동물 세포의 제품을 생성하는 대규모 (55)의 문화와 포유 동물 세포의 모니터링이 필요합니다. 또한,이 응용 프로그램은 정의되고 검증 된 배양 조건을 요구. 단순히 이러한 요건을 모두 만족하지 조사 기술을 사용하여 세포의 양을 증가시킨다. 영양분과 노폐물의 축적에 변동을 일으키는 설명서 매체의 변화는 세포의 품질, 생존 능력과 생산량을 줄일 수 있습니다. 생물 반응기의 사용은 잘 바이오 약학 애플리케이션 미생물 배양에 상용 확립 및 유사한 전략은 포유 동물 세포 배양에 적용 하였다. 환경과 포유 동물 세포의 복잡한 상호 작용은 세포의 확장 가능성을 최적화하기 위해 영양소 수준을 조절하는 특정 변경을 필요로한다.

    이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 straightfo 개발rward 방법은 가변 레이트 관류 공급기구와 교반 된 현탁액 생물 반응기에서 생리적 ...

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    공개 사항

    저자는 공개할 것이 없습니다.

    감사의 글

    저자는 도움이 되는 의견을 제시해 준 Michael Garwood와 Sam Stein, 그리고 원고 준비를 도와준 Kristen M. Maynard에게 감사를 표합니다.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    β TC-6 세포ATCC, Manassas, VACRL-11506마우스 인슐린종 세포주(부착 세포 유형)
    DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CA제품 번호는 아래를 참조하십시오 
    DMEM High Glucose (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM 저혈당 (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (이 매체는 이미 피루브산을 포함하고 있음)
    L-glutamineInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product
    Sodium PyruvateInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine SerumGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
    T-150 조직 배양 처리 플라스크Corning, Corning, NY430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    & categoryname=
    NuAire 세포 배양 인큐베이터프린스턴, 미네소타미국 자동 흐름. 모든 워터 재킷 CO2 조절 세포 배양 인큐베이터를 사용할 수 있습니다.
    원심분리기Sorvall RT 7 (유사한 탁상용 원심분리기를 사용할 수 있음)
    냉장고모든 실험실 냉장고를 사용할 수 있습니다(이 연구에는 작은 탁상용 버전이 사용됨)
    1 L Glass BottleCorning, Corning, NY1395-1L모든 공급업체를 사용할 수 있습니다. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    & categoryname=
    2 L 유리병Corning, Corning, NY1395-2L어떤 공급업체든지
    250 ml 교반 생물반응기를 사용할 수 있습니다 코닝, 코닝, NY4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(생명과학)
    & categoryname=
    젓는 접시Fisher Scientific11-496-104A어떤 인큐베이터든지 안전한 젓는 접시를 사용할 수 있으며, 어떤 공급업체든지
    조직 배양 접시 100 mm 지름Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다 (Fisher Sci를 통해 주문).
    FALCON 50 ml 원뿔형 튜브Falcon, San Jose, CA1256598모든 공급 업체가 사용할 수 있습니다
    Delran 플라스틱 사용자 정의 부품에 사용McMaster CarrVarious원하는 모든 재료를 사용할 수 있지만 Deran은 오토 클레이브 안전하고 반응성이 없으며 기계 가공이 쉽기 때문에 선택됩니다.
    http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac 맞춤형 뚜껑 용 스테인레스 스틸 파이프McMaster CarrVarious모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    연속 공급을 위한 맞춤형 수정 Delran Bioreactor 뚜껑맞춤형 유사한 제품을 생산하는 공급업체를 인식하지 못함
    연속 공급을 위한 맞춤형 수정 유리병 뚜껑맞춤 제작일부 공급업체(<예: , Fischer Sci, Corning)> 아래 링크에서 유사한 제품을 만듭니다.
    Masterflex 디지털 연동 펌프Cole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25모든 정밀 연동 펌프를 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF 튜빙 커넥터 (다양한)Cole Parmer, Vernon Hills, IL링크 참조모든 공급업체를 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT 튜빙 L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT 튜빙 L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14어떤 공급업체든 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13어떤 공급업체든 사용할 수 있습니다. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/ WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES 멤브레인 0.22 µ l 멸균 주사기 필터 (환기 및 매체 여과에 사용)Fisher ScientificSLGP033RS모든 공급 업체를 사용할 수 있습니다
    25 ml 눈금이 매겨진 피펫Fisher Scientific13-678-11모든 공급 업체를 사용할 수 있으며 다양한 크기를 사용할 수 있습니다
    PipetterFisher Scientific13-681-15E모든 공급 업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다
    혈구 측정기Fisher Scientific02-671-6모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다
    Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light MicroscopeLeica모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다
    One Touch Ultra Blood GlucoseMeter Fisher Scientific22-029-293어떤 공급업체나 유사한 제품도 사용할 수 있습니다 (예: , Bayer)
    One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 모든 공급업체 또는 유사한 제품을 사용할 수 있습니다(예: 예: , Bayer).

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