방법 논문

지역 사회 기반의 설정에서 획득 샘플의 신속한 분별 및 전체 혈액 성분의 분리

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DOI:

10.3791/52227

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2015년 11월 30일

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1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

이 논문에서

요약

추가 분석을 위한 다양한 성분을 얻기 위해 전혈을 처리하는 방법론을 간략하게 설명합니다. 당사는 비임상 환경에서 전혈 샘플의 빠르고 높은 처리량의 동시 처리를 가능하게 하는 간소화된 프로토콜을 최적화했습니다.

초록

비 임상 설정에서 수집 및 전체 혈액 샘플의 처리와 기존 조건없이 모두 지역 사회에 거주하는 개인을 평가하는 독특한 기회를 제공합니다. 이들 샘플의 신속한 처리가 주요 세포 성분의 열화를 방지하는 것이 필수적이다. 동시에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), DNA에 대한 방법이 여기에 포함된다, RNA 및 처리와 대도시 지역에 걸쳐 참가자를 동의의 가정에서 수행 한 혈액 추첨에서 혈청 분리, 컬렉션의 2 시간 이내에 시작했다. 우리는 1,600 혈액 표본이어서 성공적인 DNA 메틸화, 유전자형, 유전자 발현에 이용하고 유동 세포 계측법 분석 한 항복 일관된 고품질의 재료를 처리하는 이러한 기술을 이용했다. 사용되는 방법 중 일부는 표준; 설명 된 방식으로 조합 그러나, 그들은 인구 문제 및 / 또는 참가자를 커뮤니티의 샘플의 효율적인 처리를 가능하게일반적으로 임상에서 평가되지 않는다 기반 연구. 따라서,이 프로토콜은 일반적인 인구의 대표적인 (후속 데이터) 샘플들을 획득 할 수있는 잠재력을 갖는다.

서론

여러 연구와 정신 (또는 다른) 1-4 질병없이 개인간 혈액 유전자 발현, DNA 메틸화 및 세포 서브셋의 차이를 특징으로하고있다. 이러한 연구는, 그러나, 질병 - 관련 차이 때문에 환자를 치료하고자하는 질병에 대해 일반적으로 더 심한 특성을 확대 할 수있는 임상에서 얻어졌다. 때문에 "오 믹스"접근 방법의 발전으로, 지난 십 질병 유병률의 인구 기반의 추정치를 제공하기 위해, 지역 사회 및 / 또는 역학적 설정 5-7에서 생물학적 샘플을 얻는에 대한 관심의 폭발과의 폭 넓은 사진을 보았다 이러한 정신적 / 육체적 질병의 환경 적 결정.

이에 대한 주요 과제는 수집 된 표본의 신속한 처리에 대한 요구이다. 단핵 세포, frequentl 아르 키 면역 시스템 구성 요소들의 열화Y는 개인의 건강, 수집 8-10의 2 시간 후 복구에 상당한 감소와 혈액 무승부를 즉시 시작 평가하는 데 사용됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 인간의 전체 혈액의 여러 구성 요소가 동시에 대도시 지역에 사는 주제의 가정에서 얻어진 샘플로부터 고립되는 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 우리의 컴파일 및 미래의 기술이 더 분리를 허용 이벤트에있는 모든 "추가"분수의 저장을 포함하여 현재 기술의 변경에 기반 / 분석한다. 다른 방법 또는 키트가 여기에 설명 된 각각의 방법, 그 윤곽의 장소에서 이용 될 수 있지만 높은 처리량 방법으로 샘플을 처리하기위한 안정적이고 효율적인 방법으로 증명되었다. 양질의 분획 (PBMC를는, DNA는 혈청 및 RNA) 신선한 혈액의 2 일 (도 1 내에서 이용 가능하다 (2)의 수집 시간과 모든 분석 준비 시험편 내에 제조 할 수있다).

이 프로토콜은 지역 사회 주거, 디트로이트 환경 건강 연구에서 테스트 디트로이트시의 성인 거주자에서 수집 된 샘플의 효율적인 처리를 가능하게하기 위해 개발되었다 (DNHS을, DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1)을, 인구​​ 기반 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) 및 기타 정신 질환의 사회적, 생물학적 결정 요인 연구. 디트로이트에서 외상 후 스트레스 장애의 유병률은 두 번 전국 평균 11, 12 이상입니다. 이 집단에서 PTSD의 생물학적 결정을 확인하는 것은이 도시의 인구 및 기타 위험이 높은 집단 (예를 들어, 군 참전 용사를 반환) 모두에서 장애 그 고통을 돕기 위해 적절한 약물 및 / 또는인지 행동 개입을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 디트로이트, 미시간 웨인 주립 대학에있는 우리의 실험은, 다양한에서 파생 된 신선한 조직 샘플을 처리하는 우리의 전문 지식을 기반으로 처리를 위해 선정되었다소스, 필요성이 컬렉션의 2 시간 이내에 샘플을 처리하기 시작하고, 수집 사이트에 우리의 근접. 손이 독특한 기회, 우리의 목표는 각 시료로부터 DNA, RNA, 혈청 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 최대 수율 (시편 컬렉션 5 파도 위에 N = 1,639 샘플의 합계)에 대한 처리를 최적화하는 것이다. 여기에 설명 된 절차에 따라서, 마이크로 어레이, 성적인, 실시간 RT-PCR을 포함하여 하류 다양한 응용을위한 재료 (평균 수율은 표 1 참조)을 출발 제조, 비 임상 환경에서 동시에 수행하고, 분석 유세포 수있다.

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그림 1. 전체 작업 흐름. 여기에 도시 된 전체적인 공정은 동의 partic 식별로부터 혈액 표본을 얻는 물류를 포함혈액에 ipants 자체를 그립니다. 고품질, 분획 (말초 혈액 단핵 세포; PBMC를, DNA, 혈청, 및 RNA) 신선한 전혈의 컬렉션의 2 시간 내에 제조 될 수 있고, 모든 분석 시료 준비 2 일 내에 사용할 수있다. 시료는 즉시 시험 될 수없는 경우 또한,이 방법에 의해 제조 된 분획은 장기간 저장에 적합하다. 여기에 설명 된 전체 타임 라인은 하루 (~ 5 시간의 합계)에 완료 될 수 있습니다. 그러나, 이와 같은 일이 특히 상당한 경험과 기술을 가진 단일 기술자 매우 노동 집약적 일 것이다. 따라서, 우리는 적어도 두 기술자 사이에 1 일의 절차를 나누고 일 2. RNA 처리를 완료 추천 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

디트로이트 환경 건강 연구 검토와 미시간의 임상 시험 심사위원회의 대학에 의해 승인되었다. 모든 참가자는 이전 연구에 참여에 동의 정보를 제공했다.

1. 개요

  1. 제대로 엔드 포인트 데이터의 분석을 통해 모집에서 모든 단계를 문서화합니다. 단계 전환과 시간이 허락으로 중복, 동시에 1 일에 프로토콜을 수행합니다. 단계의 시퀀스는 성능 효율을 최적화하기 위해 기록된다. (1) 전체의 처리의 개요를도.
    참고 : 용어 "참가자는"동의 개인으로부터 그린 드 확인 된 혈액 샘플을 나타 내기 위해 전반에 걸쳐 사용된다. 괄호 안의 시간은 아래의 실습 시간을 나타냅니다. 추적 시트 시험편 로그의 예는 각각 부가 테이블 S1과 S2에서 볼 수있다. 샘플은 가정에서 phlebotomists에 의해 수집(더 전처리 자세한 내용은 보충 정보 (SI 참조) 1) 택배로 연구 코디네이터에 의해 참가자를 동의 및 실험실로 운반로 식별 개인의.

2. 1 일 설치

  1. 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비합니다.
  2. 56 ºC에 열 블록을 예열.
  3. 그날의 배달 (참가자 당 2)에 대한 마이크로 원심 튜브의 적절한 수에 20 μl를 분취하여 단백질 분해 효소 (SI 2 참조) 준비합니다.
  4. 필요한 경우, 라벨에 표시된 바와 같이 100 % 에탄올을 첨가, 완충제 및 AW1 AW2 (DNA의 순도를 증가 DNA 분리 키트에 세척 버퍼)은 사용할 준비가되도록.
  5. 4 ℃로 냉장 원심 분리기를 냉각.
  6. 전송 SPI의 상단에있는 스크류 캡을 유지, 제공된 고무 격막 캡 1X PBS의 병 뚜껑을 교체하고 전송 스파이크와 고무 격막을 관통KE 증발을 방지한다. RNA 안정화 용액 병 반복한다.
  7. 완충제, 원심 분리기와 열 블록의 제조에 이어, 샘플 추적 시트 vacutainer 전달의 시간을 기록 (SI 표 참조).

3. 1 일 : DNA, PBMC를하고 백혈구 RNA에 대한 처리 항목의 혈액 샘플 (2 시간)

  1. 개요
    1. 채혈 및 처리 시작 시간 사이의 지연을 최소화하기 위해 충분한 시간을 할애. 적혈구 세포 오염의 증가 및 단핵 세포 회수의 감소를 방지하기 위해 채혈 2 시간 내에 함유 피콜 vacutainers의 처리를 시작한다.
    2. 피콜 젤 그라데이션을 포함하는 2 vacutainers, 2 K 2 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) vacutainers, 성인 참가자 당 1 혈청 vacutainer의 수집을 가정합니다. 실험실에 vacutainers 전달하면, 기술자가 샘플의 추적 시트 의미 수용에 서명. 빌다표본 로그에 vacutainer별로 기록 시작 시간 즉시 처리한다.
  2. 혈청 분리 1 단계 (1 분)
    1. 표본 로그 시작 시간을 기록 (SI 표 2 참조). 원심 분리기 에어로졸 모자와 스윙 버킷 회 사용 (참가자 당 1) 7.0 ㎖의 혈청 (빨간색) vacutainer (브레이크와 가속 OFF 포함) (바이오 안전성 레벨 2를, BSL2가 인증) 20 분, 1,300 XG, 4 ºC합니다.
  3. DNA 격리 1 단계 (15 분)
    참고 :이 격리 절차에 대한 자세한 내용은 제조업체의 프로토콜 13을 참조하십시오.
    1. 시작 시간을 문서화하십시오. BSL2 세포 배양 후드에서 다음 프로테아제의 두 20 μL 씩 (참가자 당 400 ㎕의 총)의 각각에 vacutainers 중 하나의 상부로부터 전혈 200 μL를 추가 피콜 겔 5 배를 함유 vacutainers 반전. 후드에 프로테아제 + 혈액의 microcentrifuge 튜브를 떠나, 센트리 계속단계 3.4.1에서 vacutainers를 포함하는 피콜의 fugation.
      참고 : 마음의 단계 3.4.1에 vacutainers 회전 할 때 (즉,이 두 vacutainers에서 각각 200 μl를 제거해야 할 수도 있습니다) 원심 분리기의 균형의 필요성을 유지, 가장 큰 컬렉션 볼륨과 vacutainer을 사용합니다. 또한, 청색 vacutainers 처리하는 동안 적절한 분리를 보장하기 위해, vacutainer에 잔류 혈액 수준은 피콜 층 위 2.5 인치 이하이어야한다.
  4. PBMC 격리 1 단계 (1 분)
    1. 시작 시간을 기록 vacutainers 8-10 번 함유 피콜 .Invert (적혈구 세포 오염의 증가 및 단핵 세포의 회수의 감소를 방지하기 위해 채혈 2 시간 내에 있어야한다). (브레이크와 가속 OFF)와 원심 분리기 30 분, 1,600 XG, 22 ° C에 대한 에어로졸 모자 (BSL2 인증)와 스윙 버킷 로터를 사용하여 vacutainers (참가자 당 2).
  5. 의 DNA 분리 2 단계 (20 분)
    1. 후드로 돌아가서 프로테아제 + 혈액의 microcentrifuge 튜브 (단계 3.3.1)에 각각 200 μL 버퍼 AL를 추가합니다. 모자, 후드에서 소용돌이 15 초 플래시 스핀을 제거합니다.
    2. 열 블록에서 56 ºC, 10 분을 품어.
    3. 열 블록에서 튜브를 제거합니다. 플래시 스핀. BSL2 후드로 돌아갑니다. 200 μL 100 % 에탄올을 추가합니다. 모자, 후드에서 소용돌이 15 초 플래시 스핀을 제거합니다. 나머지 단계는 후드 외부에서 완료 될 수있다.
    4. 해물을 적용 (2 ㎖의 수집 관) 레이블 스핀 컬럼 (단계 3.5.3의 30 분 이내). 에어로졸을 통해 교차 오염을 방지하기 위해 뚜껑을 닫습니다. 원심 분리기 6000 XG, 1 분.
    5. 여과 액을 포함 포집 관을 버리고 새로운 2 ㎖의 수집 관에 스핀 열을 배치합니다.
    6. 림 가습없이 열을 500 μL 버퍼 AW1 추가 뚜껑을 닫고, 원심 분리기 6000 XG, 1 분.
    7. FILTRA를 포함하는 수집 관을 폐기TE는 새로운 2 ㎖의 수집 관에 스핀 열을 배치하고.
    8. 림 가습없이 열을 500 μL 버퍼 AW2 추가 뚜껑을 닫고, 원심 분리기 20,000 XG, 3 분.
    9. 여과 액을 포함 포집 관을 버리고 새로운 1.5 ml의 포집 관 (안 키트에 포함)에 스핀 열을 배치하고, 원심 분리기 20,000 XG, 1 분.
    10. 여과 액을 포함 포집 관을 버리고 새로운 1.5 ml의 포집 관에서 스핀 컬럼을 배치 (키트에 포함되지 않음).
    11. 각 칼럼에 200 μL 버퍼 AE 또는 물을 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. 원심 분리기 6000 XG, 1 분.
    12. 동일한 수집 관에 용출 단계를 반복 3.5.11.
    13. 참가자 당 2 열에서 용출 된 DNA를 풀. 참가자 당 총 수율 ~ 800 μL.
    14. 시간이 허락 될 때, 분광 광도계를 사용하여 샘​​플을 계량.
    15. specime에 각각의 농도를 문서화, 2 ML의 크리오 바이알 (cryovial)에 원하는대로 나누어지는 DNA를N 로그. 전사는 장기 저장을 위해 -80 ℃에서 cryobox 제자리에 크리오 바이알 (cryovial). 냉장고의 시작 시간을 문서화하십시오.
  6. 백혈구 RNA 격리 1 단계 (30 분)
    참고 : 바이오 안전성 레벨 2 인증을 세포 배양 후드에서 수행합니다. 이 격리에 대한 자세한 내용은 제조업체의 지침 (15)을 참조하십시오.
    1. 전송 스파이크와 K 2 EDTA의 vacutainer의 고무 격막을 관통. 칼집을 유지하고 단계 3.6.11에 사용하기 위해 캡 나사. BSL2 표준 관행에 따라, 혈액 유래 병원균에 노출되지 않도록주의하십시오.
    2. 전송 스파이크의 상단에 흰색 슬립 커넥터를 연결합니다.
    3. 흰색 슬립 커넥터에 필터의 입구 (플레어 단부)을 연결 한 다음 대응하는 참가자 ID와 필터 레이블.
    4. 필터의 출구 (테이퍼 끝)에 끼 우고 25⅝ G 바늘을 연결합니다. 인도 전에 필터 조립체가 상당히 따라서 처리를 신속하게 제조필터, 후 피복 바늘을 추가하고 사용할 때까지 배양 튜브 랙에 어셈블리를 설정, 전송 스파이크에 흰색 슬립 커넥터를 부착하는 것이 좋습니다.
    5. K 2 EDTA 튜브 시스템의 어셈블리에 따라, 안전 (금속 주걱의 끝을 사용) 바늘을 칼집에서 뽑다. 빈 10 ml의 진공 혈액 수집 관 (혈청 수신기 튜브)에 바늘을 찔러 K 2 EDTA의 vacutainer / 필터 / 수신기 튜브 어셈블리를 반전. BSL2 표준 관행에 따라, 혈액 유래 병원균에 노출되지 않도록주의하십시오.
    6. 필터의 쐐기 모양의 섹션이 피를 해제 할 때까지 혈액을 통해 필터링 할 수 있습니다. 여과는 약 2 분 동안 취해 여과 테스트 튜브 랙에 배치 될 수있다.
    7. 어셈블리에서 필터를 제거합니다. 여과 액이 들어있는 튜브에 바늘을두고 날카로운 물건 용기에 전체 어셈블리를 폐기합니다.
    8. 에, 1X PBS의 병에 전송 스파이크로 5 ML의 주사기를 연결합니다병을 수직 및 3 ㎖를 철회.
    9. (3-5 초당 방울) 필터의 입구에 PBS로 주사기를 연결하고 필터를 세척합니다. 흐름을 통해 생물학적 폐기물 용기에 수거 할 것. 플런저를 철회하지 않고 필터에서 주사기를 분리합니다.
    10. 여과하고 PBS 세척 후에, 새로운 5 ㎖ 주사기 단계 3.6.8에 기술 된 방법을 사용하여 RNA 안정 화제 3 ㎖를 철회. 단계 3.6.9에서와 같이 필터를 세척합니다. RNA 안정 화제는 필터에 남아 있어야한다. 플런저를 철회하지 않고 필터에서 주사기를 분리합니다.
    11. RNA 안정화 제로 포화 된 필터를 떠나기 이전부터 스파이크 유지 외피와 스크류 캡이 필터 입구와 출구를 밀봉. 필터는이 시점에서 저장 될 수있다. 5.4.7 5.3 단계를 완료하는 데 시간이 허락 할 때까지 -80 ºC (~ 2 시간)에서 필터를 저장합니다.
      참고 : 수집 한 후 1 년까지 -80 ºC에 저장 필터 decrea없이 처리 된RNA 품질 SE.
  7. PBMC 분리 2 단계 (30 분)
    1. 원심 분리기 (단계 3.4.1)에서 피콜 포함 vacutainers를 제거하고 BSL2 후드에 계속. Vacutainers 그림 2에서와 같이 분리를 표시해야합니다. 표 2 참조하지 않는 경우.
    2. vacutainer가 BSL2 후드에 반환되면, 마개를 제거하고 단핵 (일반 / 흰색) 층에 가까운받지 않고 혈청 학적 피펫을 사용하여 위, 황색, 플라즈마 층 (그림 2)의 1.5 ml의 철회. (- 1 참가자 2 vacutainers에서 풀 -) cryovial 5 ml의 플라즈마를 전송합니다. 수집 된 볼륨을 로그인합니다. 저장에 관한 지시 사항 단계 3.7.6을 참조하십시오.
      참고 : 최고 분리 및 큰 PBMC 수익률은 이전에 혈액 수집에 적어도 12 시간을 금식 한 참가자에서 왔습니다.
    3. U - 나머지 플라즈마 및 희끄무레, 단핵 층 (그림 2 겔 층 위의 모든 것을) 이동하나의 원뿔형 튜브에 참가자 당 vacutainers 함유 두 피콜 각각으로부터 단핵 층을 풀링, 15ml의 원뿔형 튜브에, 혈청 피펫 노래.
    4. 15 ml의 원뿔 튜브의 전체 볼륨을 가지고 1X PBS를 추가합니다. 캡 튜브와 반전의 5 배. 15 분, 300 XG, 22 ° C (브레이크와 가속 OFF)와 원심 분리기.
    5. 후드 피콜 함유 vacutainers로 돌아가서 주위 소용돌이 피콜 겔 층의 외부를 풀고 가능한 경우이를 제거 5¾ "파스퇴르 피펫을 사용하여 적혈구 (적혈구)를 수집한다. 수집 cryovial 5 ml의 적혈구 (~ 4.5 ml)에 전송하는 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 수집 된 볼륨을 로그인합니다.
    6. 제어 속도 냉동 컨테이너 (단계 3.7.5 플라즈마 단계 3.7.2 및 적혈구) 모두 5 ml의 크리오 바이알 (cryovial)를 전송하고 그들이 cryobox로 전송하고 반환 할 수있는 시간 후 최소 24 시간 동안 -80 ºC에 넣어 장기 기억 -80 ºC.
    7. 공동 반환단계 3.7.4에서 원심 분리가 완료하고, 펠렛을 방해하지 않고 PBS 모든하지만 ~ 500 μl를 흡인 후드로 nical 튜브. PBS의 ~ 200 μL이 단계에서 펠렛 위에두면 PBMC 수율은​​ 크다.
    8. 10 ml의 볼륨을 가지고 신선한 1X PBS를 추가합니다. 부드럽게 펠렛을 재현 탁. 캡 튜브와 반전의 5 배. 10 분, 300 XG, 22 ° C (브레이크와 가속 OFF)와 원심 분리기.
  8. 혈청 분리 2 단계 (10 분)
    참고 : BSL2 후드에서 수행합니다.
    1. 원하는 2ml의 크리오 바이알 (cryovial)로 원심 분리한다 (단계 3.2.1) 다음, 혈청 vacutainer에서 혈청 상부 층을 나누어지는. 일반적인 수율은 2.5 ㎖ (표 1)입니다. 볼륨을 로그인합니다. 예를 들어, cryovial 1로 200 μl를 분취 4 크리오 바이알 (cryovial), cryovial 2에 1,000 μl를 사용하고 크리오 바이알 (cryovial) 3과 4에 나머지를 나눕니다.
    2. 장기 보관을 위해 -80 ºC에서 cryobox 장소 크리오 바이알 (cryovial)로 옮긴다. 냉장고의 시작을 문서화시간.
  9. PBMC 분리 3 단계 (15 분)
    1. 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 많이 뜨는 / PBS로 원심 분리 (단계 3.7.8)를 흡인 한 후, 후드로 돌아갑니다. 보통 1 냉동 2.5 ml의 PBMC에서 피펫으로 재현 탁 펠릿 (SI 2 참조).
    2. 단계 3.9.1의 셀 / 매체 솔루션에 중간 2 (SI 2 참조) 냉동 2.5 ml의 PBMC를 추가합니다. 소용돌이 부드럽게.
    3. 0.65 mL의 분취 량의 microcentrifuge 튜브에 세포 용액 10 μL (상기 희석이 필요할 수있다). 0.65 ㎖의 microcentrifuge 관에 0.4 % 트리 판 블루 염색의 10 μl를 추가하고 여러 번 피펫 팅하여 혼합한다. 자세한 내용은 제조업체의 사용 설명서 (16)를 참조하십시오.
    4. 피펫 혼합의 3 분 이내에 셀 카운터에 챔버 슬라이드 및 장소 슬라이드를 계산 셀에 혼합물의 10 μL. 확대하고 세포를 집중한다. PBMC 카운트 얻기 위해 "카운트 세포"를 누르십시오.
    5. 나누어지는, 가능한 경우크리오 바이알 (cryovial)에 원하는 및 3.9.9 단계로 계속 PBMC 번호, 밀리리터 당 300 만 셀 (MC / ㎖) 이상입니다. 적어도 3 MC / ㎖ 각각의 농도에서 최대 5 크리오 바이알 (cryovial)에 보관 된 PBMC.
    6. 가능한 PBMC 수가 3 미만이면 MC / ㎖, 5 ㎖에 의해 실행 가능한 MC / ㎖를 승산함으로써 세포의 총 수를 계산한다. 3 MC / ㎖와 적어도 하나의 관이 될 수 있도록 4, 3, 2, 1 ml로 그 번호를 나눕니다.
    7. 원심 분리기 (300) XG (제동 및 가속 OFF)에서 5 분 동안 세포 / 동결 배지 용액을 함유 원추형 튜브. 원심 분리 후, (4, 3, 2, 1 mL)을 상기 계산 된 부피를 떠나 냉동 배지 (상징액)의 적절한 부피를 대기음.
    8. cryovial / 1 ml의에서 크리오 바이알 (cryovial) (1-4)의 해당 번호에 남아있는 상층 액에서 펠렛과 나누어지는 적어도 3 MC / ㎖을 재현 탁. 최종 동결 배지는 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) / 20 % 소 태아 혈청 (FBS) / 70 % 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640.
    9. Documcryovial 당 세포 수를 ENT. 제어 속도 냉동 컨테이너에 크리오 바이알 (cryovial)를 전송하고 크리오 바이알 (cryovial)가 cryobox로 전송 및 장기 저장을위한 액체 질소 탱크 (기상)에 배치 될 수있는 시간 후 최소 24 시간 동안 -80 ºC에 넣어. 문서 냉동 시간을 시작합니다.

4 일 2 설치

  1. 열 블록에 80 ° C에 뉴 클레아없는 튜브에 뉴 클레아 무료로 0.1 mM의 EDTA의 나누어지는 (필터 당 220 μL)를 가열한다.
  2. 세척 용액 1 및 2 (SI 2 참조)를 제조 하였다.

5. 주 2 : 장기 샘플 보관 및 백혈구 필터 처리 (3 시간)

  1. 개요.
    1. 필터에 백혈구의 적용 6 개월 이내에이 절차를 수행합니다.
      주 : 전체적으로는 2 일째 처리는 약 3 시간 소요가 표시된 상태에서 "제 2 일,"핵심 요구 사항은 필터 처리 부가 일 때 수행되어야한다는 것이다실험실에서 발생에는 1 일 처리가 없습니다.
  2. 장기 샘플 저장소 (15 분)
    1. 이전에 1 일 처리를 위해 실험실에 새로운 vacutainers의 전달에, 매일이 절차를 수행합니다. 적절하게 레이블이 cryoboxes에 1 일에 제어 속도 냉동 용기에 O / N를 저장 한 크리오 바이알 (cryovial)를 전송하고 장기간 보관시 -80 ºC 또는 액체 질소 (기상)로 돌아갑니다. 종점 분석법 추적 샘플 위치를 신속하게 샘플 유형 (예, DNA, PBMC, 적혈구 등)에 기초 크리오 바이알 (cryovial)를 구성.
  3. 백혈구 RNA 필터 처리 (45 분).
    참고 :이 절차에 대한 자세한 내용은 제조업체의 지침 (17)를 참조하십시오.
    1. RT에 필터를 가지고 (약 5 분 동안 해동).
    2. 덮개를 제거하고 필터에서 캡 나사. 플런저 우울, 5 ㎖ 주사기의 플런저를 후퇴 필터의 입구 (플레어 단부)에 연결RNA 안정화 에이전트를 추방 생물학적 폐기물 용기에 포트로부터 필터.
    3. 표지 된 15ml의 원뿔형 튜브에 해물을 수집, 필터를 통해 용액을 세척하기 위해 플런저 우울, RNA 분리 용 페놀 및 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 용액을 4 ㎖의 새로운 5 ㎖ 주사기를로드하고 필터의 입구에 부착 (참가자 당 2).
    4. 플런저를 후퇴, 필터로부터 주사기를 분리 필터에 다시 부착하고, 동일한 15ml의 원뿔형 튜브에 필터 디스크에 갇혀 잔류 샘플을 배출하도록 플런저 우울. 필터 주사기를 폐기하십시오.
    5. , 원뿔 튜브에 800 μL BCP를 추가 단단히 튜브를 닫고 적극적으로 30 초 동안 준비를 흔들.
    6. 5 분 동안 실온에서 품어. 2,000 X g에서 10 분 동안 원심 분리기.
    7. 갓 표시 15 ML 원뿔 튜브 (~ 2.5 ㎖)로 수성 (위) 상을 전송합니다.
    8. 뉴 클레아 제 무 수분의 성상의 0.5 배 부피를 추가잘 섞는다 거라고. 이어서 100 % 에탄올 수용액 1.25 부피 추가하고 다시 혼합한다.
      참고 : 2.5 ml의 수성 볼륨의 경우, 뉴 클레아 무료 물 1.25를 가하여 혼합 한 후 4.7 ml의 100 % 에탄올 (2.5 ml의 X 0.5 = THEN 2.5 ml의 + 1.25 ml의 = 3.75 ml의 새로운 수성 볼륨 1.25 ml의 뉴 클레아 무료 물을 추가 그때 3.75 ml의 X 1.25 = 4.7 ml의 100 % 에탄올). 이 단계는 작은 RNA 분획을 포함하는 총 RNA의 분리 가능하다. 격리에서 작은 RNA를 생략하는 방법이 수동 17에서 찾을 수있다.
    9. 5 ML의 주사기에서 플런저를 제거하고 그 자리에 스핀 카트리지를 삽입합니다. 진공 매니 폴드에 카트리지 / 주사기 어셈블리를 연결합니다. 바닥과 1.5 ML의 microcentrifuge 관이 차단 내부의 진공 매니 폴드에보다 안전한 연결의 경우, 카트리지 / 주사기 어셈블리를 배치합니다.
    10. 이 카트리지를 당겨주의 깊게 더 많은 샘플을 추가,에 진공으로 천천히 스핀 카트리지 단계 5.3.8에서 샘플을 적용합니다.
      주 : 진공이없는 경우선물, http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf에서 원심 분리 방법을 참조하십시오.
    11. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스핀 카트리지를 전송하고 세척 1. 원심 분리기의 스핀 카트리지 / 튜브 어셈블리 (5) 750 μl를 추가 - 12,000 X g에서 10 초.
    12. 튜브에서 여과 액을 취소하고 같은 microcentrifuge 관에 스핀 카트리지를 반환합니다.
    13. 12,000 X g에서 10 초 - 5 워시 2 원심 분리기의 스핀 카트리지 / 튜브를 750 μl를 추가합니다. 단계 5.3.12에서와 같이 여과 액을 버린다. 같은 microcentrifuge 관에 스핀 카트리지를 돌려줍니다.
    14. 단계 5.3.13에서와 같이 세척 2, 원심 분리의 또 다른 750 μL로 반복합니다. 취소 여과 액. 같은 microcentrifuge 관에 스핀 카트리지를 돌려줍니다. 필터를 건조 1 분 동안 최대 속도로 스핀 카트리지 / 튜브를 원심 분리기.
    15. 신선한 스핀 카트리지를 이동, 1.5 μL microcentrifuge 관을 표시.
    16. 뉴 클레아없는 0.1 mM의 EDTA의 200 μl를 추가 (80 & #로 예열스핀 카트리지 필터 참가자 당 (2)의 중심 C) 176. 1 분 동안 실온에서 품어.
    17. RNA를 용출 12,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리기. 여과 액을 보관하십시오. 스핀 카트리지를 폐기하십시오.
    18. 신선한 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 라벨에 두, 100 μL 분취에 각 200 μL 여과 액을 분할하고 얼음에 보관하십시오. 이 시점에서, 참가자 당 2 필터로 시작하는 참가자 당 RNA의 네 100 μL 씩을 얻을 것입니다.
  4. DNase의 처리 (1 시간)
    참고 :이 치료에 대한 자세한 내용은 제조업체의 프로토콜 18을 참조하십시오.
    1. (오류를 피펫 팅을 설명하기 위해) 내가 나누어 + 1 당의 DNase I 버퍼의 10 μL 2 μL의 rDNase을 결합하여 마스터 믹스를 만듭니다.
      참고 : 4 개의 샘플의 경우, 100 μL 씩 50 μL의 DNase I 버퍼 + 10 μL의 rDNase (I)가 사용
    2. 나누어지는 12 단계 5.3.18에서 RNA 씩의 각 단계에 5.4.1의 마스터 믹스 μL 가볍게 섞는다. 37 품어열 블록에 30 분 동안 C를 °.
    3. DNase의 불 활성화 시약 와동 각 나누어지는 11.2 μl를 추가, 잘 섞는다. 배양하는 동안 2 ~ 3 번 텍싱 2 분 동안 실온에서 품어.
    4. 1.5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기.
    5. 신선한 1.5 ML 튜브에 뜨는 (RNA)를 전송합니다. 같은 참가자의 분취 량은 여기에 풀링 할 수있다.
    6. 농도를 얻을 수있는 분광 광도계에 각각의 샘플을 실행합니다. RNA의 품질 분석은 Bioanalyzer을 (단계 5.5 참조)를 사용하는 것이 좋습니다.
    7. 원하는대로 크리오 바이알 (cryovial)로 RNA를 나누어지는. Bioanalyzer 분석 이후 분석을 위해 마이크로 원심 튜브로 즉시 분취 샘플 1.5 μL를 수행하지 않을 경우. 농도 및 냉동고 시작 시간을 문서화. -80 ° C에서 보관 샘플.
  5. Bioanalyzer 분석 (1 시간)
    1. 제조업체의 프로토콜 19을 따르십시오. 실행이 완료되면, 데이터를 자동으로 저장되지만 w 다시 저장되고작고, 더 인식 파일 이름 번째. 예상 결과 (그림 3) : 사다리는 샘플 3 피크 (2 리보솜 피크 44 초, 50 초, 각각 25 초에서 1 초 마커 절정을)해야한다, 6 피크를해야한다.

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결과

이것은 전체적인 절차 유전자 마이크로 어레이와 RT-PCR 분석을 통해 발현 후성 변형을 검출하고, 셀 집합의 변화를 포함 하류 다수의 애플리케이션에서 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성하는 것이 필수적이다. 표 1은 물질의 평균 수율 및 품질을 나타내는 각 프로세스에서. 3 백혈구 RNA 분리 및 필터 처리 방법의 품질의 출력의 예를 그림. 도 3의 좌측 이미지는 모세관 전기 영동에 의한 겔 사진이다. 각 레인은 저하를 나타냅니다 최소한의 그림자와 함께 두 가지 밴드를 생산한다. 아래 겔 크로마토 그램의 피크의 위치와 크기에 기초하여 결정될 수있다 열화의 레벨 및 유형에 추가적인 모습을 제공한다. (; 저하 낮음)에 RNA 무결성 번호 (린) 1 범위 다른 품질 측정10 (높은 순수한, 좋은 품질의 RNA).

이러한 높은 처리량 방법은 가끔 오류로 빌려 준다,하지만 품질 관리를 보장하...

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토론

우리는 성공적으로 디트로이트 환경 건강 연구에 1,600 개 이상의 전체 혈액 샘플을 처리하기 위해 적용된 간소화 된 프로토콜을 설명했다. 이들 기술의 대부분은 기존 문헌에서 이용할 수 있지만, 각 단계 사이에 정확하게 타이밍 변화를 포함하여 단계별 편집, 성공적 하류 광범위한 응용으로 생물학적 시료의 종류를 생산 최적화 효율적인 프로토콜이 반영 DNA 메틸화, mRNA 발현과 면역 학적 분석을 포함. 이 시편은 이미 국가 회의 11,20,21,23,24,29에서 동료 검토 문헌에 출판 및 / 또는 제출 된 결과를있는 실험의 다양한 테스트되었습니다. 이 프로토콜은 따라서 DNHS 유사한 인구 기반 연구에서 생물 표본을 수집하고자하는 다른 연구자들의 관심을 끌 수있을 것입니다.

이러한 높은 throughp의 샘플을 처리 할 때UT 방식에서는, 모든 단계에서 정확한 기록을 유지하기 위해 매우 중요하다. 우리는 초기에 cryovial 모든 정보를 저장하는 데이터...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

우리는 세부 사항에 대한 귀중한 관심과 채혈 처리에 시간을 할애한 Henriette Mair-Meijers에게 감사드립니다. 나탈리 제임슨 키슬링(Natalie Jameson Kiesling)의 그래픽 디자인 전문 지식에 감사드립니다. 또한 여기에 언급된 제조업체(Qiagen(Valencia, CA), BD Biosciences(San Jose, CA), Life Technologies(Grand Island, NY))가 설명된 대로 제품 사용을 공개할 수 있도록 승인해 주셔서 감사합니다. 이 작업을 위한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 상 번호 DA022720, RC1MH088283 및 DA022720-05-S1에서 아낌없이 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
QIAamp DNA 혈액 미니 키트Qiagen511041일차: DNA 분리
인산염 완충 식염수(PBS)SigmaP5493-1L1일차: PBMC 분리
5 ¾ ” 파스퇴르 피펫Fisher13-678-6A1일차: PBMC 분리
태아 소 혈청 (FBS), 열 비활성화Life Technologies100821471일차: PBMC 분리
디메틸 설폭사이드 (DMSO)SigmaD8418-500ml1일차: PBMC 분리
RPMI Medium 1640, 액체Invitrogen118751191일차: PBMC 격리
0.4% 트리판 블루 염색;InvitrogenT102821일차: PBMC 분리
Countess 세포 계수 챔버InvitrogenC102831일차: PBMC 분리
Countess 자동 세포 계수기 또는 현미경 및 혈구계와 같은 세포 계수 장치InvitrogenC102811일차: PBMC 분리
LeukoLOCK 분획 및 안정화 키트 Ambion19331일차: 백혈구 RNA 분리
25  G x 5/8 인치 바늘Becton Dickinson305122Day 1: Leukocyte RNA 분리
주사기 (5  ml)Becton Dickinson309646Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation
Denaturing Lysis Solution Ambion8540G2일차: 백혈구 RNA 분리
5  M NaClLife Technologies247400112일차: 백혈구 RNA 분리
TRI 시약Ambion97382일차: 백혈구 RNA 분리
Bromo-3-chloro-propane (BCP)SigmaB-96732일차: 백혈구 RNA 분리
스핀 카트리지 Ambion10051G2일차: 백혈구 RNA 분리
0.1  mM EDTAAmbion99122일차: 백혈구 RNA 분리
DNA-free 키트AmbionAM19602일차: DNase
treament RNA 6000 Ladder Agilent5067-1529Day 2: 바이오분석기 분석
RNA 6000 Nano Series II 키트 Agilent5067-15112일차: 바이오분석기 분석
RNaseZAPAmbionAM87822일차: 바이오분석기 분석
에탄올 >99%SigmaE7023-500ml
이소프로판올 >99% SigmaI9516-500ml
뉴클레아제가 없는 초순수 Invitrogen9938
피펫 팁(뉴클레아제 무함유)Eppendorf22491253
Pipetter(혈청학)Eppendorf2223020-4
피펫터(1  ml)Eppendorf3120000-054
Pipettes (serological)Fisher13-678-27E
Controlled rate freezing containersNalgene5100-0001
Cryoboxes (to hold 2  ml 및 5  ml cryovials 및 1.5  ml 마이크로 원심분리기 튜브)Fisher03-395-464
시험관 랙Thermo Scientific14-804-134
15  ml 폴리프로필렌 튜브Fisher14-959-49D
1.5  ml 및 0.65 마이크로 원심분리기 튜브Fisher07-200-534 및 07-200-185
2  ml 및 5  ml cryovialsFisher10-500-26 및 10-269-88F 
8  ml CPT vacutainerBD Biosciences3627612 튜브
6  ml K2 EDTA vacutainerBD Biosciences3678632 튜브
8.5  ml SST vacutainerBD Biosciences3679881 튜브
VortexerFisher2215365
마이크로 원심분리기 튜브용 가열 블록이 있는 건식 수조 인큐베이터Fisher11-715-1250
세포 배양 후드 내에서 사용하기 위한 여과/진공 시스템Fisher01-257-87
에어로졸 밀폐 뚜껑이 있는 마이크로 원심분리기 튜브용 고정각 로터Eppendorf22637002
16 x 125 용 스윙 버킷 로터와 에어로졸 타이트 캡이 있는 냉장 원심분리기; mm vacutainers 및 15  ml 폴리프로필렌 튜브Eppendorf226281572, 냉장 할 필요가 없습니다
Nanodrop 2000 (소량의 정확성을 위해 권장) 또는 기타 분광 광도계 장치Fisher13-400-411
Agilent BioanalyzerAgilent TechnologiesG2940CA
액체 질소 탱크Thermo Scientific11-676-56
Sharps 용기Fisher22-037-970
생물학적 폐기물 용기Thermo Scientific1223P52
Biosafety Level 2  인증된 세포 배양 후드Thermo Scientific13-261-315

참고문헌

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  16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
  17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
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