IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

요약

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

초록

RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는​​ 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 ³² P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 "겔 위상차"또는 "bandshift"분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.

서론

EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 ^1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 ^3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에​​ 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 "젤 지연"또는 "bandshift"쉽게 모니터링 할 수 있습니다. ³² P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 ³² P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 ^4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이....

프로토콜

쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.

배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비

1. 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오.
2. 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요.
3. 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS.
4. 10 ⁷ 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫.
5. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션.
6. 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
7. 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오.
8. DET브래드 포드 분석 ^(23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도.
9. 사용할 때까지 -80 ° ....

결과

섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5'-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × ¹⁰⁹ CPM / μg의 RNA의이었다.

활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW264.7 대 식세포는 방치 또는 헤민 (철 공급원) 또는 desferrioxamine (철 킬 레이터)으로 처리 하였다. 용 해물을 제조하고 IRE 프로브 (8,000 CPM / μg의 단백질)와 EMSA에 의해 분석 하였다. 대표 데이터는 각각 좌측 및 우측 패널의 autoradiograms 짧고 긴 노출이,도 1에 도시되어있다. 쥐 IRE /.......

토론

여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생할 수 있습니다. 이 경우, RNAse가 T1 (단계 6.6)으로 처리함으로써 미 결합 RNA를 제거하는 것이 바람직하다. 프로브의 품질도 매우 중요하다. 최상의 결과를 새로 제조 된 방사성 동위 원소 표지 된 RNA를 얻을 수 있습니다. 겔 정제 ^(10)는 필요하지 않지만 (더 RNAse가 T1 소화 단계가 포함되지 않은 경우 등)을 검사 준비를위한 시험 관내 전사 반응이 조기 종료되는 제품을 산출하는 경우 EMSA의 외관을 향상시킬 수있다. 기본 겔 전기 영동.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
leupeptin	SIGMA	L2884
PMSF	SIGMA	78830
BioRad 단백질 분석	BIORAD	500-0006
T7 RNA 중합효소	Thermoscientific	EPO111
RNase Inhibitor	Invitrogen	15518-012
UTP [alpha-32P]	Perkin-Elmer
섬광 액체	Beckman Coulter	141349
heparin	SIGMA	H0777
Rnase T1	Thermoscientific	EN0541
장비
: 조직 파열판	Qiagen	9001271
섬광 카운터	Beckman Coulter	LS6500
Protean II xi Cell	BIORAD	165-1834
20웰 빗	BIORAD	165-1868	1.5mm 두께
1.5mm 스페이서	BIORAD	165-1849
PowerPac	BIORAD	164-5070

NEG507H이름