Method Article

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

DOI:

10.3791/52241

⸱

December 18th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology, University of Freiburg, 3School of Life Sciences, Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS), University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 세포 유형에서 표면 항원 및/또는 세포 내 항원의 유세포 분석을 위한 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 신경생물학자가 이 강력한 기술을 활용할 수 있도록 실험 계획의 중요한 측면, 단계별 방법론적 절차 및 유세포 분석의 기본 원리를 설명합니다.

Abstract

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유세포 분석은 면역학, 혈액학 및 종양학에서 세포 집단을 정의하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 신경 세포 유형의 분화 클러스터(cluster of differentiation, CD) 표면 항원 및 세포 내 항원의 유세포 분석을 위한 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 방법론적 절차에 대한 단계별 설명에는 신경 체외 배양 수확, 선택적 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 라벨링 단계, 접합 CD 항체(예: CD24, CD54)를 사용한 표면 항원 염색, 1차/2차 항체 또는 형광 표지된 Fab 단편(Zenon 라벨링)을 통한 후속 세포 내 항원 검출이 포함됩니다. 이 비디오는 가장 중요한 단계를 보여줍니다. 또한, 유세포 분석에 대한 사전 지식이 제한적이거나 특정 교육을 받은 신경생물학자가 유세포 분석의 유용성을 평가하고 이 강력한 방법론을 더 잘 활용할 수 있도록 실험 계획의 원칙, 중요 대조군의 포함 및 유세포 분석의 기본 사항(표적 집단 식별 및 파편 제외, 게이팅 전략, 스펙트럼 중복에 대한 보상)을 간략하게 설명합니다.

Introduction

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유동 세포 계측법 광범위 고유의 분산 특성, 세포 표면 항원의 발현 및 기타 형광 매개 변수 1-3을 통해 세포 집단을 정의 할 수 면역학, 혈액학 및 종양학에 악용되고있다. 혈통 개발 및 질병에 우리의 통찰력은 초기 구현 4,5 후이 방법의 지속적인 정제 상당한 정도의 결과입니다. 흐름의 양적 및 전반적인 분석 가능성의 증가에 대한 인식은 세포 계측법 최근 줄기 세포 연구에서의 더 광범위한 사용을 권장하고 짧은 시간 프레임 (6)의 유사 깊은 진행을 가능하게 할 수있다. 그러나, 구체적으로는 신경 개체군을 분석 및 분리하는 유동 세포 계측법의 적용은 긴 도전로 인식되어왔다. 자연적 현탁액에 존재 조혈 세포와 대조적으로, 신경 세포 유형은 전형적 신경교 다양한 O를 포함 할 수있다 지나치게 복잡한 출처 수확거기는 주변 세포뿐만 아니라 공정 함유 신경 세포의 복잡한 네트워크. 따라서, 신경 생물학 매일 연구 루틴의 완전한 잠재력을 유동 세포 계측법의 다양성을 구현하기 위해 아직있다. 그러나 신경 생물학에서 분석 레퍼토리 중요한 요소로 간주 될 수있는 한 가능한 단일 세포 현탁액을 생성 할 수있다 (그리고 프로토콜 그 목적 7 고안 및 최적화 된)로 유동 세포 계측법, 형광 - 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 <....

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Protocol

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1. 신경 세포 수확

  1. 현미경에 의해 평가 :
    1. 실험을 개시하기 전에, 시야 또는 위상차 현미경으로 배양 상태를 확인한다.
      참고 : 해부에서 얻은 주 신경 조직이지만, 원칙적으로 동등하게 의무 유세포 분석 14,28 흐름에, 프로토콜의 초점은 체외 신경 세포 시스템에서 얻은 세포에주의하시기 바랍니다.
  2. 수확 세포 7 :
    1. 부드럽게 2+에 Mg 부착 세포의 접시 / 플라스크를 씻어 / 칼슘 무료로 인산 완충 식염수 (PBS) RT에서 (예를 들어, T75 플라스크 5 ml의 6 웰 플레이트에 잘 당 3 ㎖, 10 ㎖를위한 10cm 접시).
      참고 : PBS는 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 마그네슘 2+ / 칼슘 무료입니다.
      1. 비디오 예를 들어, 80 % 컨 플루 언시 SH-SY5Y 세포의 신경 모세포종의 T75 플라스크를 사용한다. 경우 어디에서 추가 세척 단계를 적용상당한 파편은 요리에 존재한다.
      2. 혈청 알부민 함유 PBS (48), 퍼콜, 또는 피콜 49 원심 분리 구배 및 /....

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Results

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여기에 제시된 프로토콜은 다양한 실험 방법 (그림 2) 수 있습니다. 최단 버전에서는, 그것이 표면 항원의 간단한 염색 가이드 간주 될 수있다 (1, 3, 6 단계). 그것의 더 복잡한 형태에있어서, 세포 내 항원의 범위 공동 라벨 패러다임의 수는 (2 및 / 또는 4~5 선택적 단계) 추구 될 수있다. 또한, CFSE 표지 단계는 세포 - 세포 상호 작용 연구 개체군의 셀 라벨 / 추적에 대한 유용성을 예시 또는 유세포 바코드 실험 (2 단계)를 흐른다. 생존 세포 집단은 (2 단계에서 얻은 및 / 또는 3) 정렬 패러다임 (FACS) 및 사후 종류의 세포 배양을 포함하여 다운 스트림 분석 셀 의무가 있습니다. 한편, 결합 된 세포 표면 항원 염색 (도 3 내지도 5 단계.......

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Discussion

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여기에 제시된 프로토콜은 물론 인간 줄기 세포로부터 유도 된 신경 세포 배양 확립되어 있지만, 동일하게 주 조직 또는 신경 세포주를 포함하는 다른 신경 세포 소스에 적용될 수있다. 배아 공급원 이외에, 신경 줄기 세포 또는 전구 성인 뇌 신경 인성 (27)의 영역으로부터 추출 될 수있다. 또한, 유동 세포 계측법 및 FACS는 성숙한 뉴런 (54), 아스트로 글 리아 (33), 미세 아교 (55), 희소 돌기 아교 세포 (56), 또는 출생 후의 뇌 조직에서 혈관 내피 세포 57 등 다양한 세포 인구를 계량 분석하고 분리하는 이용 될 수있다.

단계 중 하나를 초과는 유세포 판독에 영향을 미치는 분산 특성의 대규모 변화로 이어질 수 있기 때문에 소스에 관계없이, 고정 및 투과성으로 필요를위한 최적의 조건은 실험적으로 각 세포 유형에 대해 결정한다. 프로토콜의 효.......

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Disclosures

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저자는 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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우리 연구 프로그램은 독일 연구 재단(DFG)의 Emmy Noether-Program, 보조금 PR1132/3-1을 통해 자금을 지원받습니다. 프라이부르크 대학의 뮐러-파넨베르크 재단(Müller-Fahnenberg Foundation)의 추가 지원에 감사드립니다. 이 연구는 독일연구재단(GSC-4, Spemann Graduate School)의 Excellence Initiative의 일부 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco의 변형 독수리 배지/영양 혼합물 F-12)figure-materials-1 Life Technologies11330057
Ca2+ Mg2+figure-materials-2 Life Technologies
소 태아 혈청, 적격, EU 승인, 남미 원산지 (FBS)figure-materials-3 Life Technologies10270-106
MEM 비필수 아미노산(100x)figure-materials-4 Life Technologies11140035
TrypLE Expressfigure-materials-5 Life Technologies12604013
Trypan 블루 솔루션, 0.4%figure-materials-6 Life Technologies
파라포름알데히드figure-materials-7 Carl Roth335.3
소 혈청 알부민(BSA) 분획 Vfigure-materials-8 PAA Laboratories, CoelbeK41-001
Tween-20 Detergentfigure-materials-9 Calbiochem655205
Carboxyfluorescein 숙시니미딜 에스테르 (CFSE)figure-materials-10 eBioscience65-0850-84
DMSOfigure-materials-11 AppliChemA1584
보틀 탑 필터 익스프레스 플러스 0.22 µ m, 250 mlfigure-materials-12 MilliporeSCGPU02RE
세포 배양 처리 플라스크 (T 25)figure-materials-13 NUNC156367
세포 배양 처리 플라스크 (T 75)figure-materials-14 NUNC
원뿔형 튜브 (15 ml) < href = "http://www.greinerbioone.com" target = "_blank">figure-materials-15 Greiner Bio-One188271
원뿔형 튜브 (50ml) figure-materials-16 Greiner Bio-One227261
파스퇴르 피펫, 유리 (150mm)figure-materials-17 STEIN Labortechnik, 렘칭겐
피펫 팁(0.1-10 &마이크로; l)figure-materials-18 Corning4125
피펫 팁 (1-200 µ l)figure-materials-19 Corning4126
피펫 팁 (100-1000 µ l)figure-materials-20 Corning4129
혈청학적 피펫, 5 mlfigure-materials-21 Corning4051
혈청학적 피펫, 10 mlfigure-materials-22 Corning4101
혈청학적 피펫, 25 mlfigure-materials-23 Corning4251
마이크로 원심분리기 튜브(0.5 ml)figure-materials-24 Sarstedt72,699
마이크로 원심분리기 튜브(1.5 ml)figure-materials-25 Greiner Bio-One616201
마이크로 원심분리기 튜브 (2.0 ml)figure-materials-26 Sarstedt72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibodyfigure-materials-27 eBioscience17-0247-42Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE 단클론 항체figure-materials-28 eBioscience12-0549-42Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibodyfigure-materials-29 CovancePRB-435PWorking dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 당나귀 안티 토끼figure-materials-30 Life TechnologiesA21206작동 희석 1:2,000
Zenon® 플루오레세인 토끼 IgG 라벨링 키트figure-materials-31 Life TechnologiesZ-25342
Neubauer-Improved counting chamberfigure-materials-32 Marienfeld0640010
Vortexfigure-materials-33 과학 산업G560E
Thermomixer comfortfigure-materials-34 Eppendorf5355 000.001
Accuri C6 유세포 분석기figure-materials-35 Becton Dickinson (BD)653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 Rfigure-materials-36 Peqlab91-PSPIN-24R
오비탈 쉐이커, Unimax 1010figure-materials-37 Heidolph543-12310-00
냉장 원심분리기, Rotanta 96 RCfigure-materials-38 헤티치4480-50
Class II 생물 안전 작업대 Safe 2020figure-materials-39 Thermo Scientific51026640
CO2 인큐베이터, Heracell 240ifigure-materials-40 Thermo Scientific51026331
진공 시스템, Vacusafe comfortfigure-materials-41 Integra Biosciences158320
현미경, Axiovert 40 CFLfigure-materials-42 Zeiss451212
Pipet 컨트롤러, accu-jet profigure-materials-43 브랜드26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &마이크로; l)figure-materials-44 GilsonF144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µ l)figure-materials-45 GilsonF144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µ l)figure-materials-46 GilsonF144566
14190169 15250061 156499S03710150

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. <....

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