방법 논문

쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

DOI:

10.3791/52249

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2015년 5월 19일

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1Department of Neurology, Johns Hopkins University

이 논문에서

요약

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쥐의 시신경에 직접 주입하는 것은 재생 연구에 유용합니다. 우리는 두개골을 열지 않는 쥐의 시신경에 직접 주입하는 최소 침습적 기술을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 수술 합병증을 최소화하고 회복 속도가 빨라집니다.

초록

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쥐의 시신경은 줄기세포 재생 연구에 유용한 모델입니다. 쥐의 시신경에 직접 주입하면 뼈를 제거하지 않고 최소 침습 수술로 중추 신경계로 전달할 수 있습니다. 이 기술은 안와 융기에서 경미한 근막 절개 후 시신경을 시각화하고 직접 주입하는 접근 방식을 설명하며, 결막 견인 봉합사를 사용하여 눈을 부드럽게 아래로 당겨 빼냅니다. 주입된 시신경의 대표적인 예는 염색된 비드의 성공적인 주입을 보여줍니다.

서론

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시신경은 중추 신경계 (CNS) 등 시신경염, 녹내장 및 외상 등의 안과 조건을 포함 재생 연구를위한 이상적인 위치를 제공합니다. 줄기 세포의 다양한 주사 어느 축삭 카운트를 증가 및 / 또는 퇴행성 질환 예방 효능을 입증되거나 손실 미엘린 장착에 약속을 보여 주었다. 1,2

인간의 시신경이 약 3.0-3.5 mm의 직경 chiasm에 망막에서 여행 약 120 만 병렬 축삭이 포함되어 있습니다. (3) 실험실에서 인간의 질병을 모델링하기 위해, 쥐가 자주 사용되어왔다. 성인 쥐의 시신경은 약 0.5 mm의 직경 내에서 약 10 만 축삭이 포함되어 있습니다. 중추 신경계의 주요 제한 4 중 하나를 재생 연구 직접 뼈없는 액세스입니다. 동물에 합병증 및 수술 위험은 두개골이나 척추가 제거 될 때 더 높다. 의 장점과 유사척추 최소 침습 방법, 두개골의 서비스 감소 합병증과 더 빠른 회복을 열지 않고 5 직접 시신경 주사.

이 기법은 이전 연구에서 이용되고있다. (6)이 원고 및 첨부 영상에서는 쥐 시신경에 줄기 세포를 주입하는 최소 침습 절차를 보여준다.

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프로토콜

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참고 : 모든 동물의 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마취 기계는 필요에 따라 매년 검사 및 교정을 필요로한다.

1. 마취 및 위치

  1. 마취.
    1. 2~3% 이소 플루오 란과 마취하에 모든 수술 절차를 수행합니다. 발가락 핀치와 호흡 속도에 의해 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 쥐가 발가락 핀치에 대한 응답으로 주저하지 않는 것을 확인합니다.
      참고 : 움찔 너무 늦기 마취를 표시하고 시작하기 전에 더 이상 마취 또는 더 높은 이소 플루오 란 농도를 필요로 할 수있다. 매 2 초 마취를 나타내는 너무 느립니다 1 호흡보다 호흡 속도가 너무 높고, 이소 플루오 란 농도의 번개가 필요할 수 있습니다.
    2. 절차 중에 머리의 움직임을 피하기 위해 필요한 동물을 고정. 수술 눈에 리도카인 한 방울을 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 인공 눈물마다 10 분을 사용합니다. 주기0.01 ㎎ / ㎏ SC 사전에 작동하고 모든 6 ~ 8 시간의 프레 노르 핀의 주입이 필요.
  2. 위치.
    1. 정위 프레임에 쥐를 넣고 가열 패드 따뜻한 유지. 눈에 노출을 피하기 위해 알코올 복용 케어 두피 모피 젖은. 수술 후 감염의 위험을 최소화하기 위해 멸균 도구 및 무....

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결과

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실험의 결론에서, 래트를 희생시키고 4 % 파라 포름 알데히드 관류. 시신경 조심스럽게 해부하고 저온 유지 절편에 마운트 하였다. 2 에반스 청색 염료 사이트를 시각화하기 위해 주입되는 저전력 쥐 전체 시신경의 일례를 도시한다. 화살표는 주사의 정확한 위치를 식별합니다. 신경 아래 염료의 확산에 의해 한정되는 바와 같이이 절개가 분사 몇 분 이내에 완료되었다. 다른 주사에서는 몇 시간에 걸쳐 광학 chiasm 향해 염료의 느린 확산을 관찰 하였다.

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그림 1 :.보기의 외과 분야 쥐가이 그림에서 왼쪽 눈에 액세스하는 위치입니다. 절개 궤도 능선과 근막 위에 만들어진다조직은 눈 뒤에는 해부된다. 결.......

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토론

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줄기세포의 시신경에 직접 주사하거나 재생을 촉진하기 위한 기타 제품은 CNS에 주입하는 다른 수단에 비해 편리한 모델을 제공합니다. 이 기술은 시간이 덜 걸리고, 전체 마취가 덜 필요하며, 두개골이나 뼈 조직을 뚫거나 제거하는 것을 피하고, 합병증 발생률을 줄이고, 수술 후 보다 빠른 회복을 가능하게 합니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1. 시신경 다발을 명확하게 시각화할 수 있도록 수술 부위에서 적절한 지혈, 2. 최소한의 외상으로 시신경에 쉽게 삽입할 수 있도록 피펫 팁을 정확하게 측정, 3. 시신경을 최적으로 노출할 수 있는 결막 봉합사를 사용하여 눈을 엄격하게 제어합니다.

시신경에 대한 대체 측면 접근법은 두개골을 해부하지 않고 시신경에 직접 주입할 수 있는 대안이 이전에 설명되었습니다. 6 우리의 경험에 따르면 측면 보기는 망막 바로 뒤의 최근위 시신경에 더 제한됩니다........

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공개 사항

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저자는 보고할 의미 있는 공개가 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 NeuralStem, Inc. 및 Johns Hopkins Project RESTORE의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
루이스 쥐찰스 리버4모든 쥐 균주가 작동합니다.
마취 기계SurgivetCDS9000CDS 9000 소동물 마취 기계 - 기둥 마운트
주입 펌프스톨팅53129
해부 현미경National Optical409-411-1105
광섬유 광원Fisher Scientific12-562-21
해부 및 입체 기기스톨팅51400
피펫 풀러Kopf750
피펫세계 정밀 기기18150-6
일회용 메스 블레이드Harvard Apparatus810-15-021
홍채 절제술 가위전자 현미경 과학Uniband LA-4XF

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
  2. Quigley, H. A., Iglesia, D. S.

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재인쇄 및 허가

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