방법 논문

쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

DOI:

10.3791/52249

⸱

2015년 5월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

이 논문에서

요약

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쥐의 시신경에 직접 주입하는 것은 재생 연구에 유용합니다. 우리는 두개골을 열지 않는 쥐의 시신경에 직접 주입하는 최소 침습적 기술을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 수술 합병증을 최소화하고 회복 속도가 빨라집니다.

초록

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쥐의 시신경은 줄기세포 재생 연구에 유용한 모델입니다. 쥐의 시신경에 직접 주입하면 뼈를 제거하지 않고 최소 침습 수술로 중추 신경계로 전달할 수 있습니다. 이 기술은 안와 융기에서 경미한 근막 절개 후 시신경을 시각화하고 직접 주입하는 접근 방식을 설명하며, 결막 견인 봉합사를 사용하여 눈을 부드럽게 아래로 당겨 빼냅니다. 주입된 시신경의 대표적인 예는 염색된 비드의 성공적인 주입을 보여줍니다.

서론

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시신경은 중추 신경계 (CNS) 등 시신경염, 녹내장 및 외상 등의 안과 조건을 포함 재생 연구를위한 이상적인 위치를 제공합니다. 줄기 세포의 다양한 주사 어느 축삭 카운트를 증가 및 / 또는 퇴행성 질환 예방 효능을 입증되거나 손실 미엘린 장착에 약속을 보여 주었다. 1,2

인간의 시신경이 약 3.0-3.5 mm의 직경 chiasm에 망막에서 여행 약 120 만 병렬 축삭이 포함되어 있습니다. (3) 실험실에서 인간의 질병을 모델링하기 위해, 쥐가 자주 사용되어왔다. 성인 쥐의 시신경은 약 0.5 mm의 직경 내에서 약 10 만 축삭이 포함되어 있습니다. 중추 신경계의 주요 제한 4 중 하나를 재생 연구 직접 뼈없는 액세스입니다. 동물에 합병증 및 수술 위험은 두개골이나 척추가 제거 될 때 더 높다. 의 장점과 유사척추 최소 침습 방법, 두개골의 서비스 감소 합병증과 더 빠른 회복을 열지 않고 5 직접 시신경 주사.

이 기법은 이전 연구에서 이용되고있다. (6)이 원고 및 첨부 영상에서는 쥐 시신경에 줄기 세포를 주입하는 최소 침습 절차를 보여준다.

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프로토콜

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참고 : 모든 동물의 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 마취 기계는 필요에 따라 매년 검사 및 교정을 필요로한다.

1. 마취 및 위치

  1. 마취.
    1. 2~3% 이소 플루오 란과 마취하에 모든 수술 절차를 수행합니다. 발가락 핀치와 호흡 속도에 의해 마취의 적절한 수준을 확인합니다. 쥐가 발가락 핀치에 대한 응답으로 주저하지 않는 것을 확인합니다.
      참고 : 움찔 너무 늦기 마취를 표시하고 시작하기 전에 더 이상 마취 또는 더 높은 이소 플루오 란 농도를 필요로 할 수있다. 매 2 초 마취를 나타내는 너무 느립니다 1 호흡보다 호흡 속도가 너무 높고, 이소 플루오 란 농도의 번개가 필요할 수 있습니다.
    2. 절차 중에 머리의 움직임을 피하기 위해 필요한 동물을 고정. 수술 눈에 리도카인 한 방울을 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 인공 눈물마다 10 분을 사용합니다. 주기0.01 ㎎ / ㎏ SC 사전에 작동하고 모든 6 ~ 8 시간의 프레 노르 핀의 주입이 필요.
  2. 위치.
    1. 정위 프레임에 쥐를 넣고 가열 패드 따뜻한 유지. 눈에 노출을 피하기 위해 알코올 복용 케어 두피 모피 젖은. 수술 후 감염의 위험을 최소화하기 위해 멸균 도구 및 무균 기술을 사용합니다.

2. 눈 관리

  1. 측면 결막에 4-0 봉합사를 놓고 부드러운 견인을 허용하기에 충분한 봉합사로 묶어.

3. 해부

  1. 초기 해부.
    1. .도 1에 도시 된 바와 같이, 크기 10 메스를 사용하여 궤도 릿지를 덮는 피부 ~ 1 인치 절개를 피부와 하부 근막 후퇴 신중 근막을 얻어 해부. 수술에 과도한 출혈을 방지하기 위해, 근막을 해부하면서 혈관을 절단하지 마십시오. PL 전략적으로 사용제압면 팁 지혈을 제공합니다.
  2. 깊은 해부.
    참고 : 아래로 소켓에서 눈을 당겨 결막에 부드러운 견인과 함께, 우수한 궤도 근육이보기에 올 것이다. 시신경을 노출하기 위해 절단이 근육 및 레트로 안와 지방이 제거되어야한다. 지방은 폐기 할 수 있으며 주사 후 대체되어서는 안된다. 이 시점에서, 시신경 근막은 경질에 싸여 혈관 (그림 1)과 함께, 시신경 자체의 번들로 볼 수 있어야합니다.
    1. 적은 외상 피어싱 만들기 위해 메스 또는 31 게이지 경 바늘을 사용하여 경질의 작은 절개를합니다.

4. 피펫 인젝터

  1. 50 ~ 100 μm의 직경에 유리 마이크로 피펫을 당깁니다. 안정성을 제공하기 위해, 미세 조작기에 마이크로 피펫을 탑재하고 주입 펌프에 연결 해밀턴 주사기에 부착.
  2. 구슬을 당겨 (또는 줄기 세포)전후 메틸 블루 용액 0.5 μL 부피와 함께 역행 마이크로 피펫으로 0.5-1.0 μL 부피 재구성.
    주 : 분당 0.5 μL로 설정 주입 속도는 시신경에 외상을 방지한다.

5. 주입

  1. 단지 흠 경질 위의 시신경 상에 마이크로 피펫의 팁을 낮 춥니 다.
    참고 : 최소한의 피해 시신경 결과에 유리 팁의 작은, 그러나 활발한 움직임. 주입 펌프가 시작될 때, 메틸 청색 염료 주입 시신경의 영역을 강조한다. 염료는 지주막 하 공간에 누출하지 않고 시신경 내에서 현지화 된 상태로 유지해야한다.
  2. 줄기 세포 주입이 완료되면 결정 및 메틸 블루 제를 주입 도즈로 주입 펌프를 끄지 메틸 청색의 제 2 대역을 따르. 높은 방지하기 위해 주입 각 1 μL 볼륨 2 분 동안 시신경 내에서 여전히 마이크로 피펫을 유지마이크로 피펫의 철수시 압력 방출.
    참고 : 또 다른 방법은 수동으로 조작 할 수있는 공기 충전 주사기에 피펫 팁을 연결하는 것입니다. 어느 쪽이든, 시신경의 손상을 최소화하기 위해 과도한 힘을 피하십시오. 우리는 각각의 시신경에 볼륨 더 이상 2보다 μl를 주입하는 것이 좋습니다.

6. 후속

  1. 즉시.
    1. 주입이 완료되면, 지혈을 제공하기 위해 사용되는 임의의면을 따라 팁을 마이크로 피펫을 제거한다. 3-0 실크 피부를 봉합하고 결막 봉합을 제거합니다.
    2. 그들이 마취에서 나타날 때까지 가열 패드에 따뜻한 쥐를 유지합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
    3. 동물 과도한 혼수, 운동 실조, 또는 수고 숨쉬기를 포함하여 고통의 징후를 보이는 경우G는, 매일 세 번까지의 근육 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)와 적절한 진통제를 관리 할 수​​ 있습니다.
  2. 장기간.
    1. 다음 24 ~ 48 시간 동안, 부종 또는 방전 상처에서 또는 가창, 구부리고 모양이 아닌 스타일리스트, 또는 식사를하지 고통의 징후를 포함하여 수술의 합병증 쥐를 관찰합니다. 필요에 따라 수의사 또는 윤리 안락사와의 협의를 생각해 보자.

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결과

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실험의 결론에서, 래트를 희생시키고 4 % 파라 포름 알데히드 관류. 시신경 조심스럽게 해부하고 저온 유지 절편에 마운트 하였다. 2 에반스 청색 염료 사이트를 시각화하기 위해 주입되는 저전력 쥐 전체 시신경의 일례를 도시한다. 화살표는 주사의 정확한 위치를 식별합니다. 신경 아래 염료의 확산에 의해 한정되는 바와 같이이 절개가 분사 몇 분 이내에 완료되었다. 다른 주사에서는 몇 시간에 걸쳐 광학 chiasm 향해 염료의 느린 확산을 관찰 하였다.

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그림 1 :.보기의 외과 분야 쥐가이 그림에서 왼쪽 눈에 액세스하는 위치입니다. 절개 궤도 능선과 근막 위에 만들어진다조직은 눈 뒤에는 해부된...

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토론

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줄기세포의 시신경에 직접 주사하거나 재생을 촉진하기 위한 기타 제품은 CNS에 주입하는 다른 수단에 비해 편리한 모델을 제공합니다. 이 기술은 시간이 덜 걸리고, 전체 마취가 덜 필요하며, 두개골이나 뼈 조직을 뚫거나 제거하는 것을 피하고, 합병증 발생률을 줄이고, 수술 후 보다 빠른 회복을 가능하게 합니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1. 시신경 다발을 명확하게 시각화할 수 있도록 수술 부위에서 적절한 지혈, 2. 최소한의 외상으로 시신경에 쉽게 삽입할 수 있도록 피펫 팁을 정확하게 측정, 3. 시신경을 최적으로 노출할 수 있는 결막 봉합사를 사용하여 눈을 엄격하게 제어합니다.

시신경에 대한 대체 측면 접근법은 두개골을 해부하지 않고 시신경에 직접 주입할 수 있는 대안이 이전에 설명되었습니다. 6 우리의 경험에 따르면 측면 보기는 망막 바로 뒤의 최근위 시신경에 더 제한됩니다....

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공개 사항

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저자는 보고할 의미 있는 공개가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NeuralStem, Inc. 및 Johns Hopkins Project RESTORE의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
루이스 쥐찰스 리버4모든 쥐 균주가 작동합니다.
마취 기계SurgivetCDS9000CDS 9000 소동물 마취 기계 - 기둥 마운트
주입 펌프스톨팅53129
해부 현미경National Optical409-411-1105
광섬유 광원Fisher Scientific12-562-21
해부 및 입체 기기스톨팅51400
피펫 풀러Kopf750
피펫세계 정밀 기기18150-6
일회용 메스 블레이드Harvard Apparatus810-15-021
홍채 절제술 가위전자 현미경 과학Uniband LA-4XF

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
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