방법 논문

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

DOI:

10.3791/52259

⸱

2015년 1월 3일

 ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

이 논문에서

요약

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시험관 분야 분석법은 암 줄기세포를 식별하는 데 일반적으로 사용됩니다. 여기에서는 단일 분석과 다중 세포 기반 구체 분석을 비교합니다. 더 힘든 단일 세포 기반 분석 또는 메틸셀룰로오스 보충제는 더 정확한 결과를 제공하는 반면, 액체 배지에서 수행되는 다중 세포 기반 분석은 세포 밀도의 영향을 크게 받을 수 있습니다.

초록

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수년간의 연구에 따르면 난소암은 종양의 시작, 유지 및 기존 화학 요법 후 재발을 담당하는 소위 "암 줄기 세포"(CSC)의 하위 집단을 포함한 이질적인 세포 혼합물을 보유하고 있습니다. 따라서 난소 CSC를 식별하는 것은 중요한 목표입니다. 체외에서 CSC 잠재력을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 성장 인자와 구 형성이 보충된 무혈청 배지에서 비부착성 배양 조건에서 세포를 도금하고 며칠 후에 구체 형성을 점수화하는 구체 분석입니다. 여기에서는 인간 난소암 구체 분석에 대해 현재 사용 가능한 프로토콜을 검토하고 일반적으로 사용되는 다중 세포 기반 분석과 단일 세포 도금을 기반으로 하는 보다 정확한 시스템을 나란히 분석을 수행합니다. 우리의 결과는 다중 세포 기반 및 단일 세포 기반 구체 분석이 모두 시험관 내에서 구 형성을 조사하는 데 사용될 수 있음을 나타냅니다. 더 힘들고 비용이 많이 드는 단일 세포 기반 분석은 개별 세포의 기능 평가에 더 적합하고 전반적으로 더 정확한 결과를 얻을 수 있는 반면, 다중 세포 기반 분석은 도금된 세포의 밀도에 큰 영향을 받을 수 있으며 사전에 적정 실험이 필요할 수 있습니다. 다중 세포 기반 분석에 대한 메틸셀룰로오스 보충은 기계적 인공물을 줄이는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다.

서론

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난소암이 이질적인 세포의 혼합물로 구성되어 있으며, 기존의 세포독성 요법1-3 후 질병의 시작, 유지 및 재발을 담당하는 소위 "암 줄기세포"(CSC)를 가지고 있다는 증거가 증가하고 있습니다. 따라서 난소 CSC를 대상으로 하는 분자 전략의 개발은 중요한 목표이며 난소암 환자의 치료를 개선할 것을 약속합니다.

CSC의 분자적 특징을 이해하기 위한 전제 조건은 비 CSC로부터 신뢰할 수 있는 격리입니다. 그러나 난소 CSC를 식별하는 것은 어려운 것으로 보입니다. CD133 발현 및 알데히드 탈수소효소(ALDH) 활성4,5가 난소 CSC를 표시하는 것으로 보고되었지만, 일부 데이터는 이러한 마커가 불안정하다는 것을 나타냅니다6. 일관되게 유방암을 제외한 난소암에서7 ALDH1의 발현은 유리한 결과8와관련이 있으며, 제안된 줄기세포 마커 CD44 변이체의 발현은 예후 값이 없다9. 보다 최근에는 배아 줄기 세포 단백질 SOX2의 발현이 난소 암종 세포에 줄기를 부여하고10 높은 SOX2 발현이 임상적으로 공격적인 난소 및 유방 암종과 관련이 있음을 보여주었습니다11,12. 따라서 이 보고서에서는 SOX2 조절 영역에 의해 발현이 제어되는 적색 형광 단백질(RFP)을 포함하는 렌티바이러스 리포터 구조체를 추정되는 난소 CSC를 분리하는 방법으로 사용합니다.

정의에 따르면 CSC는 자가 재생과 분화를 모두 할 수 있어 모든 종양 세포 유형을 발생시킬 수 있습니다. 추정 CSC 집단은 in vivo에서 수행되는 기능 분석에서 분석해야 합니다. 명백한 이유로, 인간 세포에서 이러한 기능 테스트는 주로 인간 종양 세포를 면역이 손상된 마우스에 이식하는 것으로 구성된 이종 이식 분석에 국한됩니다10,13.

브렌트 레이놀즈(Brent Reynolds)와 샘 와이스(Sam Weiss)는 신경세포의 줄기 전위를 평가하는 대리 분석법으로 소위 신경구 분석법을 처음으로 보고한 시험관 내 대안 방법을 제안했습니다14. Dontu와 동료들은 나중에 유방 세포의 줄기 세포 전위 평가를 위해이 분석법의 사용을 확인했습니다15, 16. 여기서, 인간 유선세포를 표피성장인자(EGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), B-27 및 헤파린이 보충된 무혈청 배지에 서로 다른 숫자로 도말하고, 현미경으로 구체 형성을 점수화하기 전에 7-10일 동안 비부착 조건에서 배양했습니다. 세포 수, 성장 배지 및 보충제를 약간 조정한 이 프로토콜에 따라 여러 그룹이 유방17, 뇌18, 췌장19 및 결장20 종양과 같은 여러 암 유형에서 체외 줄기 세포 잠재력을 탐구했습니다. 난소암종(ovarian carcinoma)에서, 우리는 최근에 구체 분석의 타당성을 보고하고 그 결과를 in vivo murine xenograft models10에서 수집된 것과 비교했습니다. 줄기세포 단백질 SOX2의 과발현이 인간 난소암 세포의 체외구 형성과 생체 내 종양원성을 모두 향상시킨다는 것을 발견했다10. 그러나, 구체 개시 세포의 빈도는 생체 내에서 측정된 종양 개시 세포의 빈도보다 높았으며, 이는 구체 분석이 기술적인 이유로 인해 위양성 결과를 초래할 수 있거나 또는 생체 내 분석이 비효율적이어서 위음성 결과를 초래할 수 있음을 시사합니다.

이 보고서에서는 다중 세포 기반 난소 구체 분석을 보다 자세히 분석하고, 문헌에서 사용할 수 있는 다양한 프로토콜을 검토하고, 이를 단일 세포 기반 분석과 비교합니다. 당사는 단일 세포 기반 분석이 다중 세포 기반 분석보다 더 정확하고 재현성 있는 결과를 제공한다는 것을 보여주며, 이는 메틸셀룰로오스를 배양물에 첨가하여 세포를 고정시키지 않는 한 도금된 세포의 밀도에 큰 영향을 받을 수 있습니다. 그러나 단일 세포 기반 분석에서도 in vitro sphere-initiating potential은 in vivo tumor-initiating potential보다 더 높은 빈도로 관찰됩니다.

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프로토콜

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OVCAR-3 인간 난소 암 세포의 1 세대 안정적 렌티가 SOX2 규제 지역 리포터 구조를 포함하는 형질 도입

  1. 10,21 바와 같이 SOX2 조절 영역을 인식하는 리포터 구조체와 함께 HEK 293T 패키징 세포주를 형질 감염에 의해 렌티 바이러스 입자를 생성한다.
    참고 : 기자가 추가로 구성 앞서 tdTomato 형광 단백질의 ProteoTuner 쉴드 시스템의 불안정 도메인이 포함되어 있습니다. Shield1을함으로써 형광 단백질 (22)을 분해하는 프로 테아 좀을 방지 불안정 도메인에 결합한다.
  2. 24 시간의 시간주기 동안 렌티 바이러스 입자 OVCAR-3 세포를 형질 도입. 그 후, 바이러스 상청액을 제거하고 완전 배지에 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 함께 배양 된 세포를 세척 (RPMI 100 U / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신 100 μg의, 10 % FBS가 보충 된).
  3. 48 시간 후, 10 ㎍ / ㎖의 퓨로마이신은 배양에 첨가하고, 적절하게 형질 도입 된 세포의 선택을 허용하기 위해 5 일간 유지 하였다.

셀 정렬 및 도금 2. 준비

  1. 1 Shield1을 추가 : 셀 정렬하기 전에 1,000 희석 24 시간을. 음성 대조군으로 Shield1을 처리 (그림 1)하지 않고 안정적으로 형질 OVCAR-3 세포를 사용합니다. 플라스크에서 대기음 매체는 3 분 동안 0.05 % 트립신 - EDTA로 세포를 1X PBS로 세포를 씻어를 Trypsinize.
  2. 5 분 - (25 ° C 15) RT 300 XG에서 세포 수, 세포를 원심 분리 카운트 (위 참조) 완전 배지를 사용하여 트립신을 중지.
  3. 가만히 따르다 뜨는에 resuspend 세포 신중에 0.5-1 ml의 멸균 PBS.
  4. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너 캡 필터를 사용한다.
  5. 1 mL 당 500 만 세포에 세포 수를 조정합니다.
  6. , MEGM는 성장 인자, 사이토 카인 및 보조 식품으로 보충 (100 μL와 매체 초저 첨부 파일 96 웰 플레이트를 구체 준비B-27, heparine 나트륨; 또는 성장 인자, 사이토 카인, 및 보충, B-27, 또는 1 % 메틸 셀룰로오스 무첨가 heparine 나트륨이 보충 된 DMEM / F12는) 또한 표 1 참조. 선택적으로, 가능한 오염의 위험을 최소화하기 위해 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신의 농도로 배지에 항생제를 추가한다.
  7. 정렬 RFP + 이상에서 제조 된 96 웰 플레이트에 RFP- 세포, 잘 당 1 셀 (하나의 셀 기반 분야 분석) 각각 아니라 100 세포 (다중 셀 기반 분야 분석). 100 μ 노즐, 칼집 압력이 20psi, 수율 마스크 0, 순도 마스크 (32), 위상 마스크 16 : 단일 셀 모드, 정렬 설정을 사용하여 (자료 참조) 종류에 시판 셀 소터를 수행합니다.
  8. 현미경 (단일 세포 기반 분석의 경우) 세포를 포함하는 우물을 점수에 의해 다중 셀 기반 분석을 위해 (개인 우물에서 세포 수를 계산하여 효율성을 도금 평가; 그림 2 ).
  9. 매체 분야의 표준 조건에서 세포를 품어 37 ° C에서 5 % CO 2 (조성물 단계 2.6 참조). 매일의 bFGF (20 NG / ㎖) 및 EGF (20 NG / ㎖)을 보충합니다.
  10. 일주일이 지난 뒤, 집적 리포터 시스템으로부터의 형광 신호를 검출하기 위해 4 배 또는 10 배 배율 및 형광 현미경으로 표준 현미경을 사용하여 종양 신생 분야의 숫자를 카운트. "작은"구 100 μm의 (그림 3) - 직경 50 "큰"구체로 100 ㎛를 초과하는 직경 분야 및 구체를 계산합니다. 당신이 진짜 구체를 계산하고 클러스터를 셀 수 없습니다 있는지 확인하십시오.
    참고 : 단일 세포 기반 분석에서 구 형성이 문화의 10 (7 대) 일 후 현미경으로 득점하기가 쉽습니다.
  11. RFP의 +의 구 형성 세포 및 단일 세포 기반 분석에서 각각 RFP- 세포 (각 실험 한 96 웰 플레이트) 또는 멀티 셀 바의 비율을 계산쇼 등에 의해 제시된 나오지 분야 분석 (각각의 실험에 대해 잘 하나). (16)
    주 : 구 형성 세포 (%) = (구체의 개수) / (셀 시드 수)의 비율은 100 X

분야 3. 직렬과 Passaging

  1. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 적​​절한 멸균 튜브와 원심 분리기에 각 웰의 내용을 놓습니다. 다중 셀 기반 분야 분석을 위해, 함께 잘 하나의 구체를 수집합니다. PBS 긴 원심 분리기 2 분에 5 회 - 잘 3을 씻으십시오. 하나의 셀 기반 분야 분석의 경우, 개별 분야를 수집합니다. 때문에 세포의 낮은 숫자로, 원심 분리 및 세척 단계 1.5 ml의 튜브를 사용합니다.
  2. 0.05 % 트립신 - EDTA의 200 μL에 뜨는에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
  3. 최적의 세포 분리를 달성하기 위해, 부드러운 진탕을 5 분 동안 37 ℃에서 세포 현탁액을 배양한다. 낮은 세포 사멸 속도로 셀 라인 트립신 시간을 최적화 : 더 큰 경우구 부드럽게 100 μL 피펫 팁을 사용하여 볼 수 씹다입니다. 경우 큰 분야는 여전히 존재하는 또 다른 3 분 트립신과 부화 후 분쇄 단계로 진행합니다. 하나의 경우 셀 기반 분석은 트립신 단계 동안 살아있는 세포의 최적 세포 수율의 시간을 최적화해야합니다.
  4. , 트립신을 비활성화 단일 세포 분석, 추가로 2 분 동안 원심 분리기의 경우, 10 분 동안 300 XG에 500 μL에게 완전한 매체와 원심 분리기를 추가합니다.
  5. 구체 매체에 조심스럽게 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다.
  6. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너 캡 필터를 사용한다.
  7. RFP의 + 및 다중 - 셀 bassed RFP- 세포 내 분석을 사용하는 경우, 유동 세포 측정기 분석을 통해 재 부유 한 후 각 웰에서 형광 세포의 비율을 평가.
  8. 위에서 설명한 바와 같이 제조 한 세포의 직렬 replating 분석, 씨앗 아니라 당 1 셀 새로운 초저 첨부 파일 96 웰 플레이트에 들어. 한 개인 영역에서 약 20 개인 우물을 씨앗. 다중 셀 기반의 주 분야 replating 분석법, 종자 세포는 새로운 96- 웰 플레이트에 주요 분야 중 하나 웰로부터 수득하고 현미경으로 세포 수를 카운트 다음날.
  9. 단계 2.11에 기재된 식을 이용하여 이차 분석 분야에서 구 - 형성 세포의 비율을 평가한다.

4. 결과 분석

  1. 독립적 인 3 회 반복 실험을 수행의 결과를 분석하고 양면 학생의 t- 검정 통계 분석을 위해 정규 분포 값과 달리 맨 - 휘트니 - 테스트를 분석하는 데 사용할.

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결과

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기존의 구체 분석에서 RFP + OVCAR-3 세포 대 RFP- 세포의 20 %의 거의 40 %는 주 분야 분석 (그림 4A)의 개별 종양 분야에 상승했다. 또한, RFP + 세포에 의해 형성 한 구체 RFP- 세포에 의해 형성되는 것보다 크기가 더 컸다.

단일 세포 기반 분석에서 도금시 RFP + 세포는 또한 상기 결과를 확인하고, 이상 세포 RFP- 분야 형성. 그러나, 다중 셀 기반 분석 (도 4A, B) 대 단일 도금 당 적은 분야의 발생을 향한 경향이 분석 구 형성에 기계적 구 융합 또는 해리 기술적 이슈를 통해 바이어 싱 될 수 있음을 나타내는 있었다 미부착 된 배지에서.

추가의 이러한 측면을 탐색하기 위해 형성 분야에 도금 셀 밀도의 영향을 비교 하​​였다. 우리는 96에서 잘 당 1 셀에 1,000 세포에서 제한 희석을 사용하여 세포를 도금글쎄 판은 ...

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토론

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구체 배양 암 줄기 세포는 잠재적 인 분석 및 인간 종양 세포 15,25,26 다양한 줄기 세포와 같은 농축 널리 사용되는 방법이다. 이러한 배양 조건 하에서, 자기 갱신 능력이 부족한 암세포 분화 결국 세포 사멸을 거칠 것으로 예상된다. 그들은 초기에 세포 클러스터 또는 특히 차 내 분석 분야, 심지어 종양을 형성 할 수 있지만, 그들로 인해 자기 특성 갱신 부족 직렬 replating시 구 형성능을 유지할 수 없다. 구체 분석법 된 CSC를 식별하고 전체 종양 세포 집단에서의 주파수를 평가하는 분석 대용으로 사용된다.

그러나, 실질적인 변화는 다른 출판 프로토콜을 5,10,27-35 (표 1) 다음과 같은 분야 분석 사이에 수행 관찰 할 수있다. 실험실에서, 우리는 이전에 B-27를 보충하여 MEGM 인간 난소 암 세포로부터 구 형성 발간, bFGF를, 헤파린과 SingleQuot TM

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 C.L.에 수여된 Baden-Württemberg Stiftung(성체 줄기세포 프로그램 II)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고에 대한 비판적인 의견과 검토를 해주신 Martina Konantz 박사에게 감사드립니다. FACS 분류에 도움을 주신 DBM FACS 시설(바젤 대학병원)의 Emmanuel Traunecker와 Toni Krebs에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
저부착 플레이트Corning3474
MEGMLonzaCC-3151
인슐린LonzaCC-4136SingleQuots™
키트 하이드로코르티손LonzaCC-4136SingleQuots™ 키트
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644말단 농도: 20ng/ml
FGFPeproTech100-18B말단 농도: 20ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044말단 농도: 1X
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02희석 1:1,000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsin-EDTAGibco25300-054
Dulbecco' s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189희석 1:1,000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (분말)Gibco42400-010
메틸 셀룰로오스SigmaM0387
Puromycin dihydrochlorideApplichemA2856
Cell 분류기BDAria III 세포 분류기
FACS 분석기BDAccuri c6 유세포 분석기
현미경OlympusIX50 Osiris

참고문헌

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