배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

요약

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

초록

만능 줄기 세포는 무한정 증식하고 거의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 또한 체세포를 유도만능줄기세포(iPS)로 재프로그래밍하는 기술의 개발은 맞춤형 개인 재생의학의 가능성에 대한 관심과 흥분을 불러일으켰습니다. 그러나 원하는 계통을 향한 줄기세포 분화의 효율성은 여전히 낮습니다. 본 연구의 목적은 체외 분화 과정에서 흔히 발생하는 배아체(EB)의 균질한 집단을 생성하기 위해 조직공학적 접근법을 적용하여 iPS 세포(iPS-RPE)에서 망막 색소 상피(RPE)를 유도하는 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 마이크로웰 플레이트 기술을 사용하여 특정 크기의 EB 형성을 적용합니다. 면역세포화학(immunocytochemistry) 및 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)에 의한 RPE의 단백질 및 유전자 마커를 확인하는 방법도 설명됩니다. 마지막으로, RPE 마커의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석으로 모니터링되는 다양한 크기의 EB에서 분화의 효율성에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 향후 응용 분야에서 iPS 세포를 RPE로 분화하는 것을 용이하게 할 것입니다.

서론

유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포 외적 요인으로 성인 ¹ 셀 재 프로그래밍에 의해 도출 된 다 능성 줄기 세포의 유형이다. 대조적으로, 배아 줄기 세포 (는 ESC), 다 능성 줄기 세포의 다른 유형은, ^2-3 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 생성된다. 서로 다른 기원에도 불구하고, 유도 만능 줄기 세포와는 ESC는 체외에서 어떤 세포 유형 ^4-5로 분화하는 능력에 복제 할 수있는 자신의 무제한 용량의 비교입니다. 유도 만능 줄기 세포의 이러한 특성은 그들에게 개인화 된 재생 의학의 애플리케이션에 이상적 후보를합니다. 최근의 연구 노력은 망막 색소 상피 (RPE) ^6-11 포함 전문 성인 세포를 제조하기위한 강력한 분화 프로토콜 개발에 초점을 맞추고있다.

만능 줄기 세포 유래의 잠재적 임상 적용의 경우, 특정 세포 유형에 대한 지시 분화 필수적이다. 여러 가지 방법이 있습니다효율성 ^{6-7, 12-16으로} 크게 변화 RPE에 모두는 ESC와 유도 만능 줄기 세포의 직접 분화 발표했다. 우리는 여전히 개발 또는 분화하는 동안 세포 / 조직의 운명을 지배하는 분자 이벤트의 많은 모른다. 최근 몇년 최대한 학적 개발을 모방 할 ....

프로토콜

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비

1. 줄기 세포 기초 배지 400㎖의 5 배의 무 혈청 보충 100 ㎖를 첨가하여 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 준비한다. 매체는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다.
2. RHO 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (락) 억제제 (Y-27362)에 시중에서 판매하는 배아 체 (EB) 형성 매체의 10 μm의 솔루션을 추가합니다.
3. (둘 베코 변형 이글 보통 / 영양소 혼합물 F-12 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 교체 (KSR) 및 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 첨가하여 DMEM을 분화 배지를 준비 / F12).
4. 1X N1 보충제, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ml의 타우린 13 NG / ㎖ triiodo-L-로닌 나트륨 염, 20 NG / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 및 15 %를 첨가하여 만능-RPE 미디어를 준비 소 태아 혈청 (FBS) ^{최소 필수 중간 이글 (MEM) 21. 7.4 pH를 조정합니다.}
5. triiodo-L-티 로닌 나트륨 염 주식 솔루션을 준비합니다. 부드럽게 선회하여....

결과

이 실험에서, 유도 만능 줄기 세포는 배양 및 사채의 망막 색소 상피 계보로 분화. 제어 된 크기의 마이크로 웰 플레이트는 EB를 이용하여 형성 하였다. 도 1 EB 형성에서 보이는 바와 같이 마이크로 웰 플레이트에서 균일했다. 이러한 사채 후 (도 2)를 수집하고, 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다.

RPE는 RPE 마커들은 고전 육각 형태, 착색 및 발현에 의해 식별 될 수있다. 문화 12 주 후, 200 셀 사채는 성상 세포와 섬유 아세포 형태를 개발했다. 어떤 착색이 세포 (도 3A)에서 관찰되지 않았다. 큰 사채 고전 RPE의 형태와 색소 침착의 단층을 개발했다 (그림 3B 및 C) 면역 세포는 망막 색소 상피 마커를 검출하기 위해, MITF와 ZO1 500 셀과 3000 셀 사채에서 파생되었다 단백질의 공동 발현을.......

토론

세포 치료 용 다 능성 줄기 세포의 전체 약속을 실현하기 위해서는, 일관되고 재생 가능한 방법으로 분화를 조절하는 것이 필요하다. 이 보고서는, 마이크로 웰 플레이트 기술을 사용하여 크기 조절 사채를 형성 RPE으로 분화를 시작하고 RPE의 단백질과 유전자 마커를 식별하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 체외 분화를 동기화하려면, 사채의 균일 한 크기는 강제로 집계하여 마이크로 웰 플레이트에서 원심 분리 만능 줄기 세포의 알려진 숫자에 의해 형성되었다. 면역 세포 화학 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 설명 식 RPE 및 단백질의 유전자를 모니터링하는 데 사용된다. 마지막으로, 서로 다른 크기의 EB를 분화에서의 효율은 FACS 분석에 의해 분석 하였다. 이러한 기술은 미래 애플리케이션 RPE에 만능 줄기 세포의 분화를 촉진 할 수있다.

주의 깊게 이메일에 실행해야합니다이 방법 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다정확한 데이터의이 프로토콜과 달성의 성.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
mTeSR1 배지 + 5x 보충제	Stem Cell Technologies	5850
Y-27632 (Rock Inhibitor)	Stem Cell Technologies	72304
DMEM/F12	Life Technologies	11330-032
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7154
Non essential amino acids	Hyclone(Fisher)	SH30853.01
녹아웃 세럼 교체용	Life Technologies	10828-028
Gentamicin	라이프 테크놀로지	15750-060
L-글루타민	라이프 테크놀로지	25030-081
MEM 매체	라이프 테크놀로지	10370-021
N1 보충제	시그마	N-6530-5ML
타우린	시그마	T-8691-25G
하이드로코르티손	시그마	H0888-1G
태아 소 혈청	Hyclone (Fisher)	SH3008803HI
Triiodo-L- 티로닌 나트륨  소금	Sigma	T6397
수산화 나트륨	Sigma	S5881
Dispase	Life Technologies	17105-041
Matrigel	BD Biosciences	354277
인산염 완충 식염수	Hyclone (Fisher)	10010-023
Aggrewell 400 플레이트	줄기 세포 기술	27940
AggreWell 배지	줄기 세포 기술	5893
Accutase	줄기 세포 기술	7920
BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과화 키트	BD Biosciences	554714
마우스 Anti-PAX6 항체	개발 연구 Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX 항체	Abcam	Ab23340
마우스  Anti-MITF 항체	Thermo Scientific	MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 항체	Invitrogen	40-2200
RNeasy plus mini kit	Qiagen	74134
PCR 마스터 믹스	Promega	M7502
고용량 RNA to cDNA 키트	Life Technologies	4387406

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