이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.
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방법 논문
미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서
이 논문에서
요약
초록
면역 조직 화학은 동일계에서 항원의 존재, 위치 및 상대적인 풍부함을 검출하기위한 널리 이용되는 기술이다. 이 초급 프로토콜 및 미세 아교 예로서 신경 요소의 마커를 사용하여, 시약, 장비 및 설치류 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색을 완료하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 특히,이 논문은 각각 Iba1과 팬의 연결에 대한 면역 조직 화학 염색을 통해 미세 아교 세포와 신경 세포의 형광 시각화를위한 단계별 프로토콜입니다. 형광 이중 라벨링 정확하게 세포 유형, 수용체, 리간드 사이의 상호 작용을 관찰 할 수있는 기회를 제공하고, 동일한 샘플 내의 다중 단백질의 위치 파악에 특히 유용하며, 및 / 또는 서로뿐만 아니라 단백질 공동과 관련된 세포 외 기질 하나의 셀 내에서 지역화. 다른 시각화 기술과는 달리, 형광 면역 조직 화학 염색의 강도가 감소 할 수있다적절한 예방 조치가되지 않는 한, 염색 다음 달에 주. 형광은 더 효율적이고, 두 개 이상의 사이보다 정확한 분화 가능으로 이러한 제한에도 불구하고, 많은 어플리케이션에서 형광 이중 표지, 예컨대 3,3'- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride (DAB) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 대안보다 선호 마커. 토론은 문제 해결 팁과 성공을 촉진하기 위해 조언을 포함한다.
서론
면역 관심 항원에 특이 적으로 결합하는 일차 항체를 사용하여 조직 절편에서 항원 (예 : 단백질)를 검출하기위한 공정이다. 그는 항체가 큰 특이성 1 항원을 지역화 할 수 있다고 판단 할 때 면역은 1934 년 JR Marrack에 의해 개척되었다. 1942 년부터, 면역 조직 화학 염색을 시각화하기 위해 형광 항체를 사용하여 연구를 체외에서 첫 번째의 일부는 생체 조직 화학적 연구에서 처음으로 4 발표 된 후 2,3, 출판되었다. 1960 년대, 삼십년 면역 조직 화학 방법의 개시 후, 효소 결합 된 항체는 보조 시약으로 사용되기 시작했다. 이 방법은 동시에 독립적으로 프랑스와 미국 5,6에서 개발되었다. 오늘, 항체의 다양한는 면역 조직 화학 연구 (7)에 대한 무한한 가능성을 제공합니다.
">이 대응의 전반적인 목표는 면역 조직 화학 염색에 대한 간략한 소개를 제공하는 것입니다, 그것은이 기술의 포괄적이고 철저한 검토하기위한 것이 아닙니다 설명 된 방법에있어서,이 항원에 대한 면역 조직 화학 기술은 미세 아교 세포에 대한 (마커를 제공하고 있습니다. 관류 파라 포름 알데히드의 염색 뉴런), 자당 cryopr....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고 : 모든 절차가 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)을 준수하여 수행 하였다. 추천 재료 및 장비의 목록은 표 1에서 찾을 수있다.
1. 조직 준비
- 관류
- 소듐 펜 토바 비탈 (25 ㎎ / ㎏, IP)의 과다와 설치류를 안락사, 8 ml / 분의 유속으로 완전히하여 죽인 (3-5 분)까지의 인산 완충 식염수 (PBS)을 관류로 transcardially. 깊이있는 관류 지침, 게이지 등 2012 9를 참조하십시오.
- 즉시 / 분 8 ㎖의 유속에서 15 ~ 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 관류하여 조직을 고정, PBS 플러시 다음.
- 4 ℃에서 (트리스 완충 식염수를 제조 순서로, 15 %, 30 %, 30 %) 등급 자당 솔루션 다음 24 시간에 대해 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌와 장소를 제거합니다. 이후 자당 솔루션 O에 뇌 이동할수 있답니다 뇌 후 각 솔루션에 침몰했다. 참고 : 일반적으로, 각 솔루션에 오일이 조직이 싱크에 충분한 시간이다.
- 조직의 냉동 및 냉동 절편
- 등의 OCT 화합물로서 매체에 매립 뇌를 놓고 ....
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결과
이 염색 프로토콜 미세 아교 세포 형광 594 채널 (빨간색)에 표시 한 쥐의 뇌 조직 섹션에서 결과와 488 채널 레이블 뉴런 (녹색, 그림 4 참조). 핵 염색을 완료 한 경우, 채널 405 (블루)에 표시한다. 이미지는 서로 다른 채널에서의 촬영과 세 채널의 직접 비교를 위해 오버레이 또는 두 채널 사이에있을 수있다. 많은 디지털 수집 소프트웨어 스위트는이 기능을 포함한다. 여기에 표시된 Iba1 및 팬 신경 마커를 두 번 라벨은 대뇌 피질의 층에서 분명 긴 미세 신경 돌기 대부분 분지의 미세 아교 세포를 보여줍니다.
그림 4 :. 이바-1 / 팬 신경 이중 라벨 열 1의 대표 공 초점 형광 이미지.......
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토론
이 통신의 전반적인 목표는 독자에게 면역 조직 화학 절차를 소개했다. 이를 위해, Iba1 및 팬 신경 항원에 두 번 라벨의 예는 미세 아교 세포 및 관류 파라 포름 알데히드의 신경 세포를 관찰하기 위해, 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌를 사용 하였다.
이 기술은 무단 목적을 제공하도록 구성 될 수있다. 뇌, 폐, 간, 신장, 소장에 제한 등 아니라 조직 유형의 다양한 상이한 항원 어레이 프로토콜에 약간의 조정으로 면역 가시화 될 수있다. 면역은 여러 마커의 직접 비교를 할 수 있으며 하나의 샘플에서 네 가지 항체까지 포함 할 수 있습니다. 하나의 샘플에 사용 된 항체의 수는 블리드 쓰루, 형광 파장의 중첩에 대해 설명에 의해 제한된다. 그 결과로서 내 염색 조합을 제한 제한된 형광 스펙트럼이 존재화롯불 샘플 (그림 6 참조).
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 이 커뮤니케이션에 대한 귀중한 피드백을 준 Mr. Ryan Hart와 Mr. Arriz Lucas에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 NIH NINDS R01 NS065052 및 Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fisherbrand Superfrost Plus 유리 슬라이드 | Fisher Scientific | 22-034-979 | 조직 장착에 사용 (1.2.2) |
| 오븐 | Thermo Scientific | 51028112 | 조직 건조에 사용 (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | 2.2.2 단계에서 사용 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | 염색 중 모든 세척에 사용 (2.2) 및 Hoechst 단계 (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | 슬라이드 건조에 사용 (2.2) |
| 블랙 스테인닝 박스 | Ted Pella | 21050 | 차단 및 염색 단계에 사용 (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | 블록 및 항체 배양에 사용 (2.2) |
| 마우스 &알파;-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | 1차 항체에 사용 (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | 1차 항체 (2.2.4) |
| 당나귀 α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 2차 항체 (2.2.6) |
| -mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | 2차 항체 (2.2.6) |
| 케이터링 호일 | Any | N/A | 1.2.2 및 2.3.2 단계에서 사용 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | 커버 슬립에 사용 (2.2.8) |
| 커버 슬립 | Fisher Scientific | 12544E | 커버 슬립에 사용 (2.2.8) |
| 클리어 네일 폴리쉬 | 모든 | N/A | 커버슬립에 사용 (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 및 LSM 710 (레이저 스캐닝, 공막) | Carl Zeiss | N/A | 이미징에 사용 (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | 이미징에 사용 (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | DAB 프로토콜 | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | DAB 프로토콜 |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | DAB 프로토콜 |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | DAB 프로토콜 |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | DAB 프로토콜 |
| 30% 과산화수소 | FisherScientific | H325-500 | DAB 프로토콜 |
| Wheaton 슬라이드 랙 및 염색 접시 | TedPella | 21043 | DAB 프로토콜 |
| Masterflex 관류 펌프 및 튜빙 | Cole-Parmer | 관류에 사용(1.1.1 및 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT 화합물(12의 경우) | Fisher Scientific | 14-373-65 | 조직 동결에 사용 (1.2.1) |
| 온도계 (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | 조직 동결에 사용 (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | 조직 절단에 사용 (1.2.2) |
| 염색 접시, 2 개의 뚜껑이있는 플라스틱 | Grale Scientific | 353 | 항원 레트리벌 |
| 용 20 자리 염색 랙, 수평 슬라이드 | Grale Scientific | 354 | 항원 레트리벌 |
| 전자 레인지 | 모든 | N / A | 항원 레트리벌 |
참고문헌
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marsha....
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