이 프로토콜은 근육 또는 피부 조직에서 근육 및 섬유아세포 세포주의 살아있는 세포를 분리하고 1차 배양하는 기술을 설명합니다. 이러한 세포주를 불멸화하는 기술도 설명됩니다. 전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.
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요약
초록
환자 특이적 세포주의 생성은 진단 또는 중개 연구를 위한 매우 유용한 도구이며, 이러한 세포는 환자의 진단 정밀 검사 중에 사용할 수 있는 피부 또는 근육 생검 조직에서 수집할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일차 세포 배양을 위해 소량의 근육 또는 피부 조직에서 살아있는 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 일차 세포에서 myogenic cell line과 fibroblast cell line을 불멸화하는 기술을 제공합니다. 일단 세포주가 불멸화되면, 환자 유래 세포의 상당한 증식이 달성될 수 있습니다. 불멸화된 세포는 약물 스크리닝 및 유전자 돌연변이의 체외 교정을 포함한 많은 다운스트림 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.
서론
분자 진단은 지난 20년 동안 극적으로 발전했습니다. 게놈 DNA는 이제 가래나 뺨 면봉에서 일상적으로 분리되지만 과거에는 채혈이 필요했습니다. 현재 처리 시간이 빠르고 유전자 염기서열 분석이 용이하기 때문에 많은 질병 돌연변이가 추가 검사 없이 일상적으로 확인됩니다. 근육 질환 진단의 경우, 지난 10년 동안 근이영양증(muscular dystrophy) 또는 근병증(myopathy)의 원인이 되는 수십 개의 새로운 유전자가 확인됨에 따라 이러한 질병을 진단하는 방식이 극적으로 바뀌었습니다 1,2. 현재 근이영양증과 선천성 근병증의 원인으로 확인된 유전자는 수십 가지가 있지만, 이러한 유전자 중 많은 수가 질병을 유발하는 메커니즘은 불분명합니다. 특히 희귀 질환은 환자 집단의 규모가 작기 때문에 문제가 됩니다. 이러한 사례뿐만 아니라 더 흔한 질병의 경우, 발병 기전에 대한 연구를 촉진하고 치료 약물을 스크리닝하는 안정적인 도구를 생성하는 것이 매우 바람직합니다.
DNA 진단의 극적인 발전에도 불구하고, 원발성 대사 질환 또는 근육 질환이 의심되는 많은 환자에서 1차 진단을 내리기 위해 근육 생검이 여전히 시행되고 있습니다. 근육 생검이 필요한 경우, 환자의 추가 이환율 위험을 최소화하면서 추가 진단 및 연....
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프로토콜
참고 : 인체 조직의 수집을위한 프로토콜을 검토하고 기관 IRB위원회의 승인을 받아야한다. 폐기, 드 확인 된 인체 조직의 컬렉션은 보스턴 아동 병원과 브리검 여성 병원 IRB위원회에 의해 승인되었습니다. 후술하는 방법은 디 식별에서, 근원 세포의 분리를 위해 적용되어, 조직을 폐기. 설명 방법은 동의 환자 물질에서 수집 한 조직에 적용 할 수있다.
1. 세포 분리
- 근육 조직 검사 및 근육 조직 세포의 정화의 해리
- 조직의 양을 계산하는 근육 생검을 함유하는 접시를 다시 무게 - 후 해리를 위해 조직 배양 생물 안전성 후드에서 10cm 조직 배양 플레이트를 사전 달아.
- 미세하게 멸균 메스, 말하다 근육 조직을 사용하고 마르지 조직을 방지하기 위해 멸균 1X HBSS 몇 방울을 추가합니다.
- 3.5 ml의 디 각각 추가spase II 및 근육 조직의 그램 당 D 콜라게나 제 소화한다. 멸균 25 ML의 피펫을 통해 몇 번을 다진 조직과 효소 솔루션을 피펫. 15 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트를 슬러리 쉽게 5 ㎖ 멸균 피펫 비록 통과 할 때까지 조직을 소화.
주 : 조직 해리 보통 45....
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결과
도 1은 주 조직 분해에 관여하는 주요 단계들을 도시한다 : 조직의 정확한 양은 (도 1A, B) 멸균 조직 배양 용 배양 접시에 칭량된다. 티슈 슬러리 (도 1C, D)를 구할 때까지 조직이어서 미세 멸균 다진 메스를 사용한다. 분해 효소를 첨가 한 다음에, 주 근조직 해리는 대개 45-90 분 이내에 소화 효소에 의해 달성된다. 소화 조직의 진행은 통상적 overdigestion 및 세포 사멸을 방지하기 위해 15 ~ 20 분마다 모니터링된다. 효소 소화 부드럽게 피펫하고 몇 시간마다 15 ~ 20 분을 혼합 할 수 있습니다. 소화 단계의 마지막에, 세포를 100 ㎛ (도 1E, F) 다음, 40 ㎛의 필터를 통해 여과된다. 근조직의 개시 량에 따라 그리고 샘플 또는 약간 심하게 영향을받는 근육, 해리 CEL 차로부터 얻어 졌는지LS 이질적인 것이다.도 1H는 다음의
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토론
유용한 자원으로 세포
질병의 체외 모델에서 질병의 표현형을 설정할 때, 근원 세포 집단의 분리 및 배양은 매우 유용합니다. 여기에 설명 근원 성 세포 분리 과정은, 전파 분화, 또는 즉시 분석 할 수 골격근 시험편 근모 섬유 아세포의 분리를 허용한다. 근원 세포의 구조와 기능은 세포 생존, 세포 융합의 평가의 평가 또는 RNA 또는 단백질 분자의 발현 연구를 통해, 현미경 검사를 통해 평가 될 수있다. 또한 아세포는 조직 손상 다음 근육 발달과 회복의 맥락에서 근원 세포 기능의 직접적인 평가를 허용 미성숙 근섬유의 많은 특징을 공유 myotubes로 분화 될 수있다. 이러한 표현형의 모든 근육 조직 세포의 초기 구절이 비슷한 재현하는 경향이 있지만, 많은 차 m의 동작yogenic 세포주 많은 통로에 걸쳐 변경 될 수있다. 그 결과, (1.1.2) 배양 시설의 편의성 및 장기간에 걸쳐 재현 가능한 결과들의 생성을 용이하게 할 수있는 소정의 근원 성 세포주 불멸.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 간행물은 Cure CMD와 AFM(Association Contre Les Myopathies) 보조금(프로젝트 16297) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받습니다(보조금 번호 K08 AR059750, L40 AR057721 및 2R01NS047727).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 장비 | |||
| 조직 문화 생물 안전 후드 | Baker Company, Inc. | 모델 SterilGuard 후드 | |
| 벤치탑 원심 분리기, 예 : Beckman 모델 | Beckman Coulter | 모델 Allegra 6R | 세포 분류가 수행되면 냉장 기능이 있는 원심분리기가 선호됩니다 |
| 현미경 | Nikon | Model Eclipse TS100 | |
| 조직 배양 인큐베이터, CO2 소스에 연결 | Forma Scientific | Series II | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) | Becton Dickinson | Model Aria | |
| 조직에서 주요 근아세포 | |||
| Dispase II | Roche Applied Science | #04942078001 | 에서 2.4U/ml의 양말 용액을 준비합니다 |
| . | Roche Applied Science | #088882001 | 10 mg/ml |
| 1x Sterile Hank'의 원액을 준비합니다. s Balanced Saline Solution (HBSS), 칼슘 및 마그네슘 무료 | GIBCO Life Technologies | #14185-052 | |
| 소 혈청 알부민, 분획 V | Sigma | #05470 | FACS 분류를 위한 1X HBSS 0.5% BSA의 멸균 용액을 준비합니다 |
| . 근아세포를 위한 멸균 성장 배지: Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 고포도당(4.5g) 함유 30% 소 태아 혈청 | GIBCO Life Technologies | 11965-092 | L-글루타민 |
| RBC 용해 용액 | Qiagen | 158904 | |
| Propidium Iodide 스톡 10mg/ml | Sigma | P4170 | 멸균 증류수에 분말을 희석하여 스톡 용액 준비 |
| 유세포 분석을 위한 항인간 CD56 항체 | Biolegend | 318310 | APC-접합 항체, 기타 라벨은 사용 가능 |
| 1차 근아세포 | |||
| 친환경성 패키징 세포주 PE | Cell Biolabs | RV-101 | |
| 양쪽 친화성 패키징 세포주 PA3174 | Cell Biolabs | RV-102 | |
| 돼지 피부 젤라틴 | Sigma | G1890-500g | 물에 0.1% 젤라틴의 원액을 준비합니다. 접시에 용액을 37°C로 코팅합니다. C를 1시간 동안 사용합니다. 용액을 제거하고 매체를 추가합니다. |
| 폴리젯 | Signagen | SL100688 | |
| G418 | Fisher | 345812 | |
| Hygromycin | EMD Biosciences | 400051 | |
| pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT | not commercial available | Stadler et al, 2013 | |
| Qiagen plasmid midiprep kit | Qiagen | 12143 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 미디엄 199 (31150022) | |
| Dulbecco' s 변형 이글 매체 (DMEM) | Life Technologies | DMEM (11965-092) | 믹스 4 : 1 DMEM : 199 |
| Myoblast 성장 매체 : 4 : 1 Dulbecco ' s 변형 이글 배지(DMEM) 및 배지 199에는 15% 소 태아 혈청이 보충되었습니다. 0.02 M HEPES 완충액; 1.4 mg/L 비타민 B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L 덱사메타손, 2.5 &μ; g/L 간세포 성장 인자 및 10 μ g/L 베타 섬유아세포 성장 인자. | 생명 공학(DMEM, F199); 애틀랜타 생물학(FBS); 인비트로겐(Hepes); 피셔 (ZincSulfate); 시그마(Vit.B12, 덱사메타손); 케미콘 인터내셔널(HGF); 바이오파이오니어(betaFGF) | #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). | 배지 및 원액 Vit. B12 (20mg/ml)를 준비합니다. 아연설페이트(60&마이크로; g/ml); 덱스(55&마이크로; g/&마이크로; l) 더 쉽게 사용할 수 있도록 별도로 사용하십시오. HGF 원액(5µ g/ml) 및 FGF(20µ g/ml)는 최종 작업 농도에서 매주 새로 첨가해야 합니다. |
| TrypLE express | GIBCO Life Technologies | 12605-010 | |
| 면역염색을 위한 미오신 중쇄 항체 | Developmental Hybridoma Bank | MF20 | Clone MF20 |
| 면역염색을 위한 Desmin 항체 | Thermo Scientific | MS-376-S0 | Clone D33 |
| Horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
| 1차 피부 섬유아세포 분리를 위한 시약 | |||
| 수송 배지: 10% 소 태아 혈청 및 0.2% 페니실린/스트렙토마이신 | RPMI 배지 보충 RPMI 1640: GIBCO Life Technologies | 11875-093 | |
| 인간 1차 섬유아세포 배양 배지: 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 | : Thermo Scientific | SH30071.03 | |
| 콜라겐 분해 효소 용액 : 12.5ml의 섬유 아세포 배양 배지 및 필터 멸균 | Worthington | 4176 | |
| 멸균 1X 인산염 완충액 식염수 (PBS) 칼슘 및 마그네슘 무함유 | Lonza | 17-516F | |
| 1 차 근 세포 | |||
| 50 ml 및 15 ml 멸균 원추형 튜브 | GeneMate / Bioexpress | C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))멸 | |
| 균 메스 | Aspen Surgical | 372610 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 1492 | |
| 멸균 5, 10 및 25 ml 피펫 | Bellco glass | 1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml) | 재사용 가능한 피펫은 사용 전에 세척, 면 플러그 및 오토클레이브 멸 |
| 균 조직 배양 처리 플라스틱 접시 (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| 멸균 나일론 셀 스트레이너 (100 µ m 및 40 &마이크로; m 사이즈) | BD 팔콘 | 352340 (40&마이크로; m); 352360(100&마이크로; m) | |
| myoblast immortalization | |||
| Sterile 0.45 µ를 위한 재료; m 필터 | Millipore | SLHV013SL | |
| 클로닝 링 | Corning | #3166-8 | 사용 전후에 세척 및 고압클레이 |
| 섬유아세포 세포주용 재료 | |||
| 멸균 35mm 조직 배양 처리된 플라스틱 접시 | Greiner bio-one | 628160 | |
| 멸균 메스 | DeRoyal | D4510A | |
| 멸균 T25 조직 배양 플라스크 | 테크노 플라스틱 제품, MIDSCI | ||
참고문헌
- Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
- Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
- Sharples, A. P., Stewart, C. E.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.
A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette
