방법 논문

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

DOI:

10.3791/52307

⸱

2015년 1월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

이 논문에서

정오 공지

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요약

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이 프로토콜은 근육 또는 피부 조직에서 근육 및 섬유아세포 세포주의 살아있는 세포를 분리하고 1차 배양하는 기술을 설명합니다. 이러한 세포주를 불멸화하는 기술도 설명됩니다. 전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

초록

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환자 특이적 세포주의 생성은 진단 또는 중개 연구를 위한 매우 유용한 도구이며, 이러한 세포는 환자의 진단 정밀 검사 중에 사용할 수 있는 피부 또는 근육 생검 조직에서 수집할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 일차 세포 배양을 위해 소량의 근육 또는 피부 조직에서 살아있는 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 일차 세포에서 myogenic cell line과 fibroblast cell line을 불멸화하는 기술을 제공합니다. 일단 세포주가 불멸화되면, 환자 유래 세포의 상당한 증식이 달성될 수 있습니다. 불멸화된 세포는 약물 스크리닝 및 유전자 돌연변이의 체외 교정을 포함한 많은 다운스트림 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

서론

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분자 진단은 지난 20년 동안 극적으로 발전했습니다. 게놈 DNA는 이제 가래나 뺨 면봉에서 일상적으로 분리되지만 과거에는 채혈이 필요했습니다. 현재 처리 시간이 빠르고 유전자 염기서열 분석이 용이하기 때문에 많은 질병 돌연변이가 추가 검사 없이 일상적으로 확인됩니다. 근육 질환 진단의 경우, 지난 10년 동안 근이영양증(muscular dystrophy) 또는 근병증(myopathy)의 원인이 되는 수십 개의 새로운 유전자가 확인됨에 따라 이러한 질병을 진단하는 방식이 극적으로 바뀌었습니다 1,2. 현재 근이영양증과 선천성 근병증의 원인으로 확인된 유전자는 수십 가지가 있지만, 이러한 유전자 중 많은 수가 질병을 유발하는 메커니즘은 불분명합니다. 특히 희귀 질환은 환자 집단의 규모가 작기 때문에 문제가 됩니다. 이러한 사례뿐만 아니라 더 흔한 질병의 경우, 발병 기전에 대한 연구를 촉진하고 치료 약물을 스크리닝하는 안정적인 도구를 생성하는 것이 매우 바람직합니다.

DNA 진단의 극적인 발전에도 불구하고, 원발성 대사 질환 또는 근육 질환이 의심되는 많은 환자에서 1차 진단을 내리기 위해 근육 생검이 여전히 시행되고 있습니다. 근육 생검이 필요한 경우, 환자의 추가 이환율 위험을 최소화하면서 추가 진단 및 연구 조직 채취의 기회를 제공합니다. 각 조직 표본에 대한 많은 용도가 있기 때문에 간단하고 효율적이며 최소한의 조직을 필요로 하는 수술 조직을 사용하여 1차 세포 배양을 위한 기술을 확립하는 것이 매우 바람직합니다. 조직에서 일차 세포를 최대한 분리하고 살아있는 물질을 장기간 보관하기 위해 근육 또는 피부 생검의 적절한 분류가 필요합니다. 또한 줄기세포 연구 및 약물 스크리닝은 세포 기반 분석을 사용하여 많은 질병에 대한 치료법을 개발할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다 3,4.

본 문서에서는 인간의 근육 또는 피부 생검에서 일차 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 개인으로부터 많은 수의 세포를 생성하는 데 유용한 근육 세포의 불멸화를 위한 프로토콜을 포함합니다. 이러한 세포는 맞춤형 약물 스크리닝과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있으며, 그렇지 않으면 일차 조직에서 얻은 세포의 수가 전반적으로 적기 때문에 달성할 수 없습니다.

프로토콜

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참고 : 인체 조직의 수집을위한 프로토콜을 검토하고 기관 IRB위원회의 승인을 받아야한다. 폐기, 드 확인 된 인체 조직의 컬렉션은 보스턴 아동 병원과 브리검 여성 병원 IRB위원회에 의해 승인되었습니다. 후술하는 방법은 디 식별에서, 근원 세포의 분리를 위해 적용되어, 조직을 폐기. 설명 방법은 동의 환자 물질에​​서 수집 한 조직에 적용 할 수있다.

1. 세포 분리

  1. 근육 조직 검사 및 근육 조직 세포의 정화의 해리
    1. 조직의 양을 계산하는 근육 생검을 함유하는 접시를 다시 무게 - 후 해리를 위해 조직 배양 생물 안전성 후드에서 10cm 조직 배양 플레이트를 사전 달아.
    2. 미세하게 멸균 메스, 말하다 근육 조직을 사용하고 마르지 조직을 방지하기 위해 멸균 1X HBSS 몇 방울을 추가합니다.
    3. 3.5 ml의 디 각각 추가spase II 및 근육 조직의 그램 당 D 콜라게나 제 소화한다. 멸균 25 ML의 피펫을 통해 몇 번을 다진 조직과 효소 솔루션을 피펫. 15 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트를 슬러리 쉽게 5 ㎖ 멸균 피펫 비록 통과 할 때까지 조직을 소화.
      주 : 조직 해리 보통 45-90 분 이내에 소화 효소에 의해 달성된다. 자세한 내용은 '대표 결과'섹션을 참조하십시오.
    4. 329 XG (~ 1,100 RPM)을 첨가하고 실온에서 10 분 동안 50 ㎖ 원뿔형 튜브 및 세포 펠렛 위에 100 ㎛ 세포 스트레이너를 통해 해리 조직, 필터 멸균 성장 배지 2 볼륨을 추가. 미디어 컴포지션 재료 표를 참조하십시오.
    5. 멸균 된 성장 배지의 1 부피에 펠렛을 재현 탁하고 7 볼륨을 적혈구 세포 용해 액을 합한다. 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 필터링 한 후 t 펠렛329 XG에 10 분, 실내 온도 그는 세포.
    6. 혈구 세포의 개수를 1 × 106 세포 / 100 ㎕의 농도로 HBSS 1X 0.5 % BSA에서 세포를 재현 탁. 따로 설정 ~ 음 (흠) 제어에 사용되는 단일 관에서 25 만 셀. FACS 정렬하여 CD56 양성 세포의 적절한 게이팅에 필요한 요오드화 프로피 듐 및 CD56 따로 추가 단일 색 스테인드 제어 튜브를 설정합니다. 정렬 매뉴얼 셀 또는 적절한 컨트롤을 보장하는 핵심 설비 전문가를 정렬 FACS가 포함되어 있습니다에 문의하기를 참조하십시오.
    7. 얼룩 세포는 항 CD56 항체의 5μL / 10 6 세포를 정렬 할 수 있습니다. 30 분 동안 얼음에 (통제를​​ 포함한) 모든 샘플을 품어.
    8. 10 ㎖의 1X HBSS에 워시 샘플 및 펠릿 세포 냉장 원심 분리기 329 XG (~ 1,100 RPM), 4 ° C의 온도에서 10 분 동안.
    9. SOR되도록 시료 1μg / ml의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐 추가죽은 세포의 배제 테드. 형광 활성화 된 세포 선별기를 이용하여 비 - 근육 조직 세포로부터의 근원 성 CD56 양성 세포를 정제 하였다.
  2. 피부 생검의 해리
    참고 : 근육 조직 검사를 사용할 수없는 경우 피부 섬유 아 세포는 환자의 피부 펀치에서 고립 될 수있다. 피부 섬유 아세포는 근육 조직 세포를 생성하는 형질 MyoD 함께 포함하여 많은 연구를위한 생체 물질로서 사용될 수있다. 또한, 피부 섬유 아세포는 더 깊은 연구 다양한 세포 유형으로 분화 될 수 IPS 세포를 생성하는데 사용될 수있다.
    1. 교통 매체의 실험실로 피부 생검을 전송. 샘플이 수신되면, 가능한 빨리 초대 배양을 수행한다. 일차 배양 당일에 확립 될 수없는 경우, 실온에서 밤새 샘플을 저장한다.
    2. 층류 후드 멸균 35mm 페트리 접시에 피부 생검을 전송합니다.
    3. 멸균 1 페트리 접시에 피부 조직 검사를 씻어X PBS는 혈액과 이물질을 제거합니다. 멸균 메스 지방 조직을 제거합니다.
    4. 2 ㎖의 콜라게나 제 용액을 첨가하고 메스 말하다 조직, 조직의 크기에 따라 1 시간 45 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
    5. , 15ml의 원뿔형 튜브에 소화 조직 전송 배 섬유 아세포 배양 배지 2 ㎖로 배양 접시 린스하고 동일한 튜브에서 매체를 수집한다.
    6. 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 세포 펠렛.
    7. 상층 액을 제거하고 다시 다음, 펠렛 세포를 콜라겐을 제거하는 섬유 아세포 매체의 3 ml의 펠렛을 씻는다. 미디어 컴포지션 재료 표를 참조하십시오.
    8. 단계 1.2.7 한 번 더 반복합니다.
    9. T25 무균 조직 배양 플라스크 위에 5 ml의 섬유 아세포 매체와 플레이트 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 플라스크를 품어.
    10. 다음 1~3일을 통해 섬유 아세포의 부착과 성장을위한 문화를 평가합니다.
      참고 : 일부 작은 조직 조각은 또한 판에 부착 할 수 있고 섬유 아세포이 조직의 조각을 이동한다.
    11. 섬유 아세포는 약 80 %의 합류로 성장 될 때까지 동일한 조건에서 문화를 유지한다.
    12. 트립신에 의해 섬유 아세포를 수집하고 추가 확장을위한 신선한 배양 플라스크에 전송합니다. 칼슘 ++ 및 마그네슘 ++의 무료 문화를 1X PBS에서 3 회 세척하여 트립신을 수행합니다. 37 ° C에서 2 분 동안 세포 (2 ㎖ / T25 플라스크)에 트립신 - EDTA (참조 자료 표)를 추가합니다.
    13. 추가 플라스크에 분리 된 세포를 분할합니다. 일부 조직 조각이 원래 T25 플라스크에 연결된 상태를 유지하는 경우,이 플라스크에 5 ml의 신선한 문화 매체를 추가하고 더 많은 섬유 아세포는 지속적으로 밖으로 이동합니다.
      참고 : 확장 된 섬유 아세포 문화 P1로 아래로 냉동 및 미래의 실험을 위해 액체 질소에 저장할 수 있습니다.

근육 조직 세포의 2 멸화

  1. 4 박의 비율 DMEM 중소기업 199에서 10cm 무균 조직 배양 플레이트에 플레이트 5 백만 피닉스 Ecotropic 포장 세포 (PE) : 10 % 송아지 혈청 1.
  2. 10 mM의 카페인 보충 신선한 매체의 5 mL를 형질에 30 분 전에 피드 세포.
  3. MIDI 준비 (CDK4 또는 플라스미드는 hTERT) 및 polyjet으로부터 플라스미드 DNA의 2 μg의 혼합물을 균질화하고 제조업체에서 권장, 15 분 동안 실온에서 배양한다.
  4. 밤새 PE 세포에 플라스미드 / polyjet 혼합물을 추가합니다.
  5. 신선한 배지로 피드 세포 (DMEM 및 (4)의 중간 (199) 비율 : 10 % 송아지 혈청 1). 12 시간 후, 바이러스 - 함유 상등액을 모으고 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터를 통해 필터링.
  6. (G41 밤새 amphotropic 패키징 세포주 PA317 5를 감염 수집 상청액 1 ㎖를 사용하거나, 0.5 ㎎ / ㎖로 네오 마이신 선택 후 안정한 바이러스 - 생산 세포주를 얻기8) CDK4 또는 0.5 mg을 위해 /의 hTERT에 대한 하이 그로 마이신 ㎖로.
  7. 다음 세 가지 수확의 상층 액을 매일 아침, 저녁과 아침을 수확, 근처 포화 상태에 안정적으로 포장 세포를 성장시켜 바이러스 상층 액을 작업 준비합니다.
  8. 바이러스 상층 액을 여과하고, 직접 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 1 ml의 분취 량 및 저장에 사용하거나 나눕니다. 바이러스 상등액을 각각 동결 - 해동로 50 %의 감염 효율이 없어집니다. 표백 세척을하기 위해 바이러스 입자를 만진 모든 것을 폐기하기 전에 기억하십시오.
    주 : 안정 PA317 바이러스 생산 세포주 냉동 영구 저장 -150 ° C로 유지 될 수있다 (중간 동결하는 10 % DMSO이다 혈청 90 %).
  9. 플레이트 FACS 정제 근원 성 세포 / 웰을 0.1 % 젤라틴으로 코팅 된 6- 웰 플레이트에 5 × 104 세포의 밀도 (1.1-1.9 단계에서 설명). 세포가 바이러스 감염으로 진행하기 전에 판에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오.
  10. F, 필터링 400 μl를 추가reshly 하룻밤 (컨트롤로이 우물을 유지) 각 여섯 웰 플레이트에 바이러스 상층 액 또는 냉동 분량을 생산했다.
  11. 2.5 ㎖ / 웰의 신선 근육 매체 (4 세포를 공급함으로써 변화 매체 : 0.02 M HEPES 완충액; 1.4 ㎎ / L 비타민 B12, 15 % 소 태아 혈청으로 보충 한 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 매체 (199) 0.03 mg의 / L의 ZnSO4, 0.055 ㎎ / L 덱사메타손, 2.5 ㎍ / L 간세포 성장 인자 및 10 ㎍ / L 염기성 섬유 아세포 성장 인자). 표백제 용기에 바이러스 입자를 함유하는 매체 및 피펫 버린다. 삼일 후, 감염에서 회복 400 ㎍ / ㎖의 네오 마이신 (CDK4 감염) 또는 300 ㎍ / ml의 하이 그로 마이신 (의 hTERT 감염)을 사용하여 선택을 치료하는 데에 동일한 배지에서 세포를 남겨주세요.
  12. 제어 요리 다이의 셀 (1-2 주)까지 약물 선택에 따라 세포를 유지한다.
  13. 심지어 selecti 동안 (EDTA 0.05 % 트립신을 사용하여 컨 플루를 60 내지 80 %의 밀집 상태) 통로 세포들은 합류되기 전에기간에. 선택 약물로 보충 신선한 근원 세포 매체와 여러 10cm 요리를 Replate 세포 (2.11에서 설명). 이종 집단으로 불멸화 선택된 셀을 유지하거나 완전히 균질 유전 적 배경 (모든 셀에서 동일한 트랜스 진의 삽입)을 얻었다 복제.
  14. 다음 단계를 사용하여 클론 선택을 수행합니다 :
    1. 작은 식민지가 (10 ~ 20 세포)이 형성 될 때까지, 저밀도 (예 : 10cm 요리를 300-500 세포)에서 세포를 씨와 약 2 주 동안을 유지한다.
    2. 마르지 않도록 세포 박막만을 남겨이 시점에서 매체의 대부분을 제거한다.
    3. (일단 실리콘 진공 그리스에 담근에) 원하는 각 복제를 통해 복제 링을 놓고 트립신 / EDTA 몇 방울을 추가합니다.
    4. 수확 세포들은 조심스럽게 1 ml의 끝이나 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포를 흡입하고 사용할 수있는 가장 작은 멀티 웰 괞 찮아로 전송 반올림이 되시면테 (96 또는 48, 24 또는 12 웰 플레이트).
    5. 지역의 포화 상태를 방지하기 위해 필요에 따라 복제를 확장합니다.

결과

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도 1은 주 조직 분해에 관여하는 주요 단계들을 도시한다 : 조직의 정확한 양은 (도 1A, B) 멸균 조직 배양 용 배양 접시에 칭량된다. 티슈 슬러리 (도 1C, D)를 구할 때까지 조직이어서 미세 멸균 다진 메스를 사용한다. 분해 효소를 첨가 한 다음에, 주 근조직 해리는 대개 45-90 분 이내에 소화 효소에 의해 달성된다. 소화 조직의 진행은 통상적 overdigestion 및 세포 사멸을 방지하기 위해 15 ~ 20 분마다 모니터링된다. 효소 소화 부드럽게 피펫하고 몇 시간마다 15 ~ 20 분을 혼합 할 수 있습니다. 소화 단계의 마지막에, 세포를 100 ㎛ (도 1E, F) 다음, 40 ㎛의 필터를 통해 여과된다. 근조직의 개시 량에 따라 그리고 샘플 또는 약간 심하게 영향을받는 근육, 해리 CEL 차로부터 얻어 졌는지LS 이질적인 것이다.도 1H는 다음의 소화 및 조직 배양 접시 도금 해리 일차 전지 3-6 시간의 일례를 나타내고있다도 1G 즉시 소화 다음 현탁액 단핵 세포의 예를 나타낸다. 근육 조직 세포는 일반적으로 섬유 아세포 및 지방 세포 세포와 혼합됩니다. 면역 세포는 염증 환자의 질병과 연관되는 경우에 존재할 수있다. 따라서, 서로 다른 세포 유형의 잠재 분리는 바람직 할 수 있습니다. 인간의 근육 조직 세포의 전향 적 격리를 들어, CD56 또는 N-CAM 널리 신뢰할 수있는 마커 6-9로 사용되어왔다. 이 정화는 곧 근육 조직 전구 세포의 농축 및 세포 불멸화 과정 이전에 대한 차단 후 도움이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 일차 세포의 불멸화에 먼저 수행 될 수 있고, 그 다음, 근원 세포를 무한 증식 FACS에 의해 CD56 발현에 기초하여 선택 될 수있다. 회로도종래 정렬 FACS 및 FACS 프로필의 일례에 필요한 단계는도 2에 도시되어있다. 요약하면, 일차 전지를 카운트하고 셀 후 일차 항체 (즉, 항 CD56)을 첨가 나타낸 배양 같이 고농도로 재현 탁 얼음에 30 분. 세척 후, 세포 형광 활성화 세포 분류기를 통해 분석하고 (그림 2) CD56 양성 세포의 국지적 인 약 수율이 전체 단핵 세포의 40-70%에 이르기까지, 샘플마다 다릅니다 정제된다. 수율은 개인의 나이에 따라 달라지며, 근원 세포는 영향을받지 또는 병에 걸린 근육에서 추출한 여부. 이영 근육이 자주 CD56 양성 세포의 낮은 비율을 가지고있는 동안 영향을받지 근육은 일반적으로, 근육 조직 세포의 높은 비율을 가지고있다. 정제 된 세포가 완전한 근육 조직 성장 매체에 도금 (재료 표 참조). 그들은 REAC 때 세포를 트립신 처리하여 계대 수 있습니다시간 60 % ~ 70 %의 합류. CD56 발현 세포는 근육 조직과 (도 3에서 도식화 된 바와 같이), 근원 세포의 불멸화 국지적 12,13 두 유전자의 형질 전환을 필요로 순차 시험 관내에서 10,11 myotubes을 형성 할 수있다. 사이클린 의존성 키나제 4 (CDK4)가 부적당 한 배양 조건에 조직 배양의 응력을 극복하기 위해 사용되며, 인간 텔로 머라 아제 역전사 효소 (는 hTERT)이 인하여 단부 복제 현상 (12)에 텔로미어 단축을 방지한다. 모두 사전에 바이러스 플라스미드 pBAbe 백본 벡터에 있습니다. 마우스 CDK4 cDNA의 구조는 네오 마이신 내성 유전자를 포함하고는 hTERT cDNA의 구조는 하이 그로 마이신 내성 유전자가 포함되어 있습니다. 후자는 또한의 hTERT / TK 카세트의 양쪽에 배치 된 단순 포진 바이러스 티미 딘 키나제 (TK) 카세트에 loxP 사이트를 포함합니다. 이 gancyclovir를 사용하여 Cre 호텔 재조합 효소 (14) 및 카운터 선택하여 전체 표현 장치의 절단을 할 수 있습니다.

무한 증식 세포를 새로 완전히 homogenic 유전 배경 (삽입 단일 세포 게놈 및 그 자손)을 얻었다, 바이러스는 다른 사이트에 통합 또는 클로닝 모집단으로 유지할 수있다. 대부분의 경우, 세포 게놈 카세트의 삽입에 따라 약간의 차이 클론 중의 하나의 결과로 인한 주요 집단으로부터 클론을 단리. 또한, 광범위한 조직 문화는 성장 우위 세포보다는 차별화 사람의 선택을 선호합니다. 나는작은 식민지가 (10 ~ 20 세포)이 형성 될 때까지 (10cm 요리를 300-500 세포 등) 약 2 주 동안 배양 한 클론의 solation 낮은 밀도에서 세포를 파종하여 간단하게 이루어집니다. 매질의 대부분은 후 마르지 않도록 세포에만 박막을 남기고 제거된다. 클론은 복제 링을 사용하여 트립신과 다음 필요에 따라 확장됩니다. 확장 불후의 복제는 면역에 의해 FACS, 최근 desmin과 MyoD 식으로 CD56, 또는 분화에 따라 myotube 형성과 같은 일반적인 근육 조직 세포 마커의 발현을 테스트 할 수 있습니다. 3~5일 (도 4) 한 후 : 합류 근원 성 세포 (90 % 컨 플루 언시가) (2 % 말 혈청 (1), (4)의 비율로 DMEM 및 보통 199) 분화 배지에 놓이면 Myotubes 가장 명백하다. 차이는 myotube 형성 및 비 - 불멸화 된 대조군 세포와 세포 사이의 불멸화 myotube 수축 능력이 나타나지 않았다 (비디오 1, 2).

(도 5)을 포함한 여러 방법에 의해 분석 될 수있다. 성장 곡선의 예로는 세포의 통로 번호를 확장 한 확장으로 텔로미어 단축화 관찰도 5a에 도시되어있다. 반대로, 성공적으로 불멸화가 증가 텔로 머라 제 활성과 연관되어 (그림 5)

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그림 1.. 조직의 배치 다음 빈 배양 접시의 무게 차 인간 근육 조직의 분리를위한 중요한 단계의 삽화 (A), 종래 조직 배치 및 (B) 내지 (C) 멸균 메스는 말하다 데 사용되는 조직까지 (D) 조직 그것자기 슬러리로 감소된다. 콜라게나 제와 디스 파제를 첨가하고 조직을 45 ~ 90 분 동안 소화 후 소화 파편 (E, F). (G, H) 해리 직후 도금 갓 해리 된 세포의 예로는 (G를 폐기 나일론 메쉬 필터로 여과 ) 또는 3 시간 분리 후, 일차 전지)는 H (정착하기 시작할 때.

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그림 2 :. 형광 활성화 세포 분류기를 통해 이전에 정화 인간의 근원 세포 염색에 관련된 절차의 흐름 FACS 분석을하기 전에 인간 세포의 염색에 대한 중요한 단계가 강조 표시됩니다. FACS 플롯의 예는 표시됩니다. 음성 대조군 (왼쪽 패널) 정렬 게이트를 설정하기 위해 사용된다. 오른쪽 패널에서, CD56을 발현 양성 세포 및 게이트 percenta 아르양성 세포의 GE가 표시됩니다. 이 전략은 종래에 불멸화 또는 불멸화 절차를 따르면, 하나 근원 성 세포를 정제하는데 사용될 수있다.

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그림 3 : 근원 세포의 불멸화에 대한 바이러스 생산의 개략도. 레트로 바이러스 생산 워크 플로우 아세포를 불멸하는 데 사용됩니다. pBabe 백본 CDK4 또는 floxed-TK는 hTERT 카세트를 함유하는 플라스미드 구조체는 (왼쪽) 피닉스 ecotropic 내로 형질 감염 (PE) 패키징 세포주를 이용하여 밤새 polyjet (8-12 시간). 이어서 상등액 피닉스 amphotropic 패키징 세포주 (PA317) 상으로 여과 한 후 전송된다. 이러한 세포로부터의 상등액을 직접 사용할 수 있거나, 세포는 미래의 사용을위한 안정된 세포주를 생성하기 위해 하이 그로 마이신 또는 중 선택 될 수있다. 여과 및 일정량을상등액 겹 (50 % 효율의 손실로) 나중에 사용하기 위해 -80 ℃에서 보관 될 수있다. 표백제는 절차의 모든 지점에서 사용되는 모든 소비를 청소하는 데 사용된다.

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그림 4 :. 불멸화 절차 (위)의 가역적 근원 세포의 불멸화의 회로도 작업 흐름 : ​​1 차 셀은 처음 CDK4로 형질된다. 네오 마이신 선택 후, 근육 모세포는 두 가지 선택 마커를 포함하는 floxed의 hTERT 카세트로 형질된다 HSV-TK와 하이 그로 마이신. 나중에 원하는 경우의 hTERT 카세트 밖으로 Cre 호텔 재조합 발현과 함께 절제 gancyclovir위한 선택하여 "floxed"될 수있다. 이것은 근육 모세포와 텔로미어 단축의 재 개시 "다시 mortalization"을 할 수 있습니다. 텔로미어가 20킬로바이트 길면, 이것은 여전히​​ 배화 수백 허가, 및 t를 피할 의 hTERT의 과발현의 그는 합병증. 마지막으로, 불사 모집단 동질 클론을 단리 할 수​​있다. 무한 증식 세포의 새롭게 myogenicity는 최근 desmin (하단 왼쪽 패널, 안티 최근 desmin 클론 D33 물들 성장 배지에서 세포, 녹색)와 같은 근육 세포의 특이 마커를 이용하여 도시 될 수있다. 이 복제는 세포 증식 상태를 유지하는 경우에도 분화 세포가 볼 수 있도록, 근원이다. 세포 (2 % 말 혈청, 중간과 오른쪽 패널) 분화 배지에서 분화하는 경우 myotube 형성은 매우 광범위한된다. 배아 마이 오신 중쇄 (녹색)과 myotubes에 MF20 항체로 염색 거의 모든 세포가 DAPI 염색 (파란색, 모든 이미지)에 의해 다수의 핵을 가지고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5 : 불멸화 절차의 확인. (A) 주 근원 세포, 불멸의 인구 (근 모세포는 hTERT-CDK4) 다시 mortalized 클론에서 동질 클론의 성장 곡선은 예로 표시됩니다 (근원 세포는의 hTERT-CDK4가 floxed). 세포가 노화에 도달하기 전에 성장률 차이는 검출되지 않았다. 텔로미어 단축는 TRF 측정 하였다 인구 배화 및 텔로미어 길이의 함수로서 모니터 하였다. (B) 초기 시점 및 근육 아세포 (PD에서 13-75 5 시점)에서 늦은 복제 TRF 제시된 예 재 mortalized 아세포 후 절제는 hTERT (PD 62 152 3 시점) 및 불멸화 아세포 (PD 75, 200). (C)는 성공의 hTERT 감염은 텔로 머라 제 활성의 증가로 변환한다. 전 HTE을 한 후 세포에서 15 텔로 머라 제 활성을 ddTRAP (분석의 정량화, 왼쪽 ddTRAP 판독, 오른쪽)으로 평가 하였다RT 감염. 절제의 hTERT 아세포에서 본 일본어 임계치 텔로 머라 제 활성을 폐지. 결과는 세포에 해당 (배경 수정) 당 생성되는 총 텔로 머라 제품으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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비디오 1과 2 Myotubes 전과 불멸화 공정 후에 세포로부터 생성되었다. 세포를 성장 배지에 융합 상태로 성장하고, 10 일 동안 분화 매체로 전환 하였다. 두 동영상에서 하나 이상의 myotubes의 기능 수축이 검출됩니다. 자연 경련의 기록20X 렌즈를 사용하여 수행 하였다. 차이는 불멸화 및 불멸화 된 비 - 세포 간 관찰되지 않았다.

토론

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유용한 자원으로 세포

질병의 체외 모델에서 질병의 표현형을 설정할 때, 근원 세포 집단의 분리 및 배양은 매우 유용합니다. 여기에 설명 근원 성 세포 분리 과정은, 전파 분화, 또는 즉시 분석 할 수 골격근 시험편 근모 섬유 아세포의 분리를 허용한다. 근원 세포의 구조와 기능은 세포 생존, 세포 융합의 평가의 평가 또는 RNA 또는 단백질 분자의 발현 연구를 통해, 현미경 검사를 통해 평가 될 수있다. 또한 아세포는 조직 손상 다음 근육 발달과 회복의 맥락에서 근원 세포 기능의 직접적인 평가를 허용 미성숙 근섬유의 많은 특징을 공유 myotubes로 분화 될 수있다. 이러한 표현형의 모든 근육 조직 세포의 초기 구절이 비슷한 재현하는 경향이 있지만, 많은 차 m의 동작yogenic 세포주 많은 통로에 걸쳐 변경 될 수있다. 그 결과, (1.1.2) 배양 시설의 편의성 및 장기간에 걸쳐 재현 가능한 결과들의 생성을 용이하게 할 수있는 소정의 근원 성 세포주 불멸 때때로 바람직하다.

특정 세포 집단의 선택

이 프로토콜은 정제 기법을 사용하여 FACS로 골격근 조직으로부터 근원 성 세포의 분리를 설명한다. 선택 세포의 제안 전략은 죽은 세포, 먼지, 비, 근원 세포의 라이브, 근육 조직 세포를 구별하기 위해 요오드화 프로피 듐 (죽은 세포의 지표) 및 CD56 (근육 조직 세포의 마커)를 사용하여 포함한다. CD56 음성 인구가 섬유 아세포 가능성이 지방 세포 세포를 포함 비, 근원 세포를 포함하는 동안 CD56 양성 인구에 포함 된 세포 형성 myotubes 할 수있는 근육 조직 조상이 포함됩니다. 이들 분획의 각각의 수독립적 인 세포 또는 DNA 뱅킹 운동 또는 근육 조직 세포 배양에서 수행되는 분석을위한 부가적인 제어 조건에 유용 할 수있는 병렬 섬유 아세포 세포 배양을 확립 아세포 또는 섬유 아세포, 및 전위의 세포 배양 생산 독립적 배양. 다른 곳에서 16, 17 설명되어 있습니다 FACS 정렬이 바람직하지 않거나 사용할 수없는 경우에 소화 근육 조직에서 특정 myoblastic 및 섬유 아세포 세포 배양의 선택, 몇 가지 다른 옵션이 있습니다. myoblastic 및 섬유 아세포 세포를 분리하는 또 다른 방법은 특정 세포 유형에 대한 세포의 연속적인 통로를 풍부하게 두 종류의 세포 간 접착 성 차이의 사용을 포함한다. 섬유 아 세포가 수립 또는 세포를 계대 다음 resu하는 다른 접시에 뜨는을 도금 할 때 약 1 시간 동안 플라스틱에 배양 세포 현탁액을 허용, 훨씬 더 쉽게 모세포보다 플라스틱을 준수로세포 현탁액 (18)로부터 다수의 섬유 아세포의 분리에 LT.

섬유 아세포 대 근육 아세포의 유틸리티

환자 근육 생검은 일반적 그러나 병든 아세포 효과적으로 증식되지 않을 수도 일차 근육 세포의 정제에 사용되는 유일한 것이 필요 분할 높은 번호에 도달하는 세포의 불멸화를 요구하는, 시험관 내에서의 분할 몇 수를 겪을 수있다. 그들은 모두 유용 및 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 많은 융통성을 제공 할 수 있습니다로 모두 섬유 아세포와 근육 모세포가 근육 조직 검사에서 고립 될 수 있음을 감안할 때, 두 세포 분획, 환자 샘플에서 저장해야합니다. 예를 들어, 섬유 아세포 세포 수를 제한하고 전위를 생성하기 위해 많은 보류 약속을 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 생성을 위해 사용될 수있는 여러 세포 계통으로 분화하도록 유도한다. 이러한 기능은 환자로부터 얻은 세포에 매우 바람직하다잠재적으로 체외 수정 또는 치료 화합물에 대한 검색에서 실험 약물 검사에서 사용할 수있는 희귀 질환과의. 불멸화 아세포 또한 약물 기반 스크리닝에 사용될 수있다. 섬유 아세포는 효과적으로 19-21 MyoD 발현 바이러스 감염에 의해, 근원 운명을 향해 전환 될 수있다. 이 방법은 효과적으로 근육 질환 환자에서 추출한 섬유 아세포를 사용하여 테스트 및 MyoD 발현 아세포 효과적으로 성숙한 근육 단백질을 발현 myotubes을 형성 할 수있는 것이 확인되었다. 따라서, 두 종류의 세포를 효과적으로 여러 하류 어플리케이션에서 사용하고 진단 및 치료 연구를위한 귀중한 물질을 제공 할 수있다.

멸화의 영향

정상 이배체 세포의 불멸화 한 완전히 다양한 특징 및 실험실 연구 될 수 안정한 인간 세포주를 제조 할 수있다. 독립의 차 문화아이솔레이션은 변할 수 있으며 손상 해리 과정에서 배양 또는 동작을 왜곡 할 수 overdigestion 의해 도입 될 때 전체적인 증​​식 능력은 가변적 일 수있다. 텔로 머라 아제 (는 hTERT)의 촉매 서브 유닛의 발현을 사용하여 세포의 불멸화 안정한 세포 표현형을 유지하는 장점을 갖는다 이배체 세포는 남아있다. 텔로 머라 아제는이 Wnt 경로 (22)를 조절 할 수있는 마우스의보고가 있었다. 우리는 인간의 세포에서이 현상을 관찰하지 않았습니다. 텔로미어가 연장 된 후에는 제거 될 수 있도록하지만, 이러한 잠재적 인 합병증을 피하기 위해, 카세트의 hTERT, LOX 사이트와 형벌되었다. 긴 텔로미어는 대부분의 실험을 수행 할 충분, 별도의 부서 수백 부여.

연속 셀 확장은 항상 빠른 성장을위한 선택적 이점을 제공하기 때문에, 세포 표현형은 가끔 인해 가장 빠르게 분할과 성장에 편향 될 수 있습니다세포, 오히려 가장 분화 세포보다. 이 아직 기재된 방법을 이용하여 큰 문제가없는 것으로 판명되었지만, 그것은 자신의 초기 배양 역사 또는 원하는 표현형을 나타내는 세포 클론의 선택에 의해 동결 된 세포를 해동하여 해결 될 수있다.

근처를 무제한으로, 근원 세포의 팽창 약물 선별 가능한 질병 모델링 장점을 가진다 마지막으로, 현재의 기술은 세포 기반 치료에 치료 차량, 또는 차 진단 도구로서 이러한 세포의 사용을 방지 고유 단점을 갖는다. 모두 체외 문화와 불멸화 단계에서의 광범위한는 기본 상태에 비해 근육 세포의 표현형을 변경합니다. 중요한 것은, 이러한 셀들은 기본 위성 틈새 내의 세포의 자연 환경과는 매우 상이한 환경에서 확장된다. 따라서, 무한 증식 세포는 강렬한 가능성 및 안전성 시험 develo의 필요할새로운 기술의 pment들은 인간 환자의 근육 내로 재 도입 될 경우.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 간행물은 Cure CMD와 AFM(Association Contre Les Myopathies) 보조금(프로젝트 16297) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 자금 지원을 받습니다(보조금 번호 K08 AR059750, L40 AR057721 및 2R01NS047727).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
장비
조직  문화 생물 안전 후드Baker Company, Inc.모델 SterilGuard 후드
벤치탑 원심 분리기, 예 : Beckman 모델 Beckman Coulter모델 Allegra 6R세포 분류가 수행되면 냉장 기능이 있는 원심분리기가 선호됩니다
현미경NikonModel Eclipse TS100
조직 배양 인큐베이터, CO2 소스에 연결Forma Scientific Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)Becton DickinsonModel Aria
조직에서 주요 근아세포
Dispase IIRoche Applied Science#04942078001에서 2.4U/ml의 양말 용액을 준비합니다
.Roche Applied Science#08888200110 mg/ml
1x Sterile Hank'의 원액을 준비합니다. s Balanced Saline Solution (HBSS), 칼슘 및 마그네슘 무료GIBCO Life Technologies#14185-052
소 혈청 알부민, 분획 VSigma#05470FACS 분류를 위한 1X HBSS 0.5% BSA의 멸균 용액을 준비합니다
. 근아세포를 위한 멸균 성장 배지: Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 고포도당(4.5g) 함유 30% 소 태아 혈청GIBCO Life Technologies11965-092L-글루타민
RBC 용해 용액Qiagen158904
Propidium Iodide 스톡 10mg/mlSigmaP4170멸균 증류수에 분말을 희석하여 스톡 용액 준비
유세포 분석을 위한 항인간 CD56 항체Biolegend318310APC-접합 항체, 기타 라벨은 사용 가능
1차 근아세포
친환경성 패키징 세포주 PECell BiolabsRV-101
양쪽 친화성 패키징 세포주 PA3174Cell BiolabsRV-102
돼지 피부 젤라틴SigmaG1890-500g물에 0.1% 젤라틴의 원액을 준비합니다. 접시에 용액을 37°C로 코팅합니다. C를 1시간 동안 사용합니다. 용액을 제거하고 매체를 추가합니다.
폴리젯 SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERTnot commercial availableStadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies 미디엄 199 (31150022)
Dulbecco' s 변형 이글 매체 (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)믹스 4 : 1 DMEM : 199
Myoblast 성장 매체 : 4 : 1 Dulbecco ' s 변형 이글 배지(DMEM) 및 배지 199에는 15% 소 태아 혈청이 보충되었습니다. 0.02 M HEPES 완충액; 1.4 mg/L 비타민 B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L 덱사메타손, 2.5 &μ; g/L 간세포 성장 인자 및 10 μ g/L 베타 섬유아세포 성장 인자.생명 공학(DMEM, F199); 애틀랜타 생물학(FBS); 인비트로겐(Hepes); 피셔 (ZincSulfate); 시그마(Vit.B12, 덱사메타손); 케미콘 인터내셔널(HGF); 바이오파이오니어(betaFGF) #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). 배지 및 원액 Vit. B12 (20mg/ml)를 준비합니다. 아연설페이트(60&마이크로; g/ml); 덱스(55&마이크로; g/&마이크로; l) 더 쉽게 사용할 수 있도록 별도로 사용하십시오. HGF 원액(5µ g/ml) 및 FGF(20µ g/ml)는 최종 작업 농도에서 매주 새로 첨가해야 합니다.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
면역염색을 위한 미오신 중쇄 항체Developmental Hybridoma BankMF20Clone MF20
면역염색을 위한 Desmin 항체Thermo ScientificMS-376-S0Clone D33
Horse serumInvitrogen26050-088
1차 피부 섬유아세포 분리를 위한 시약
수송 배지: 10% 소 태아 혈청 및 0.2% 페니실린/스트렙토마이신RPMI 배지 보충 RPMI 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
인간 1차 섬유아세포 배양 배지: 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640: Thermo ScientificSH30071.03
콜라겐 분해 효소 용액 : 12.5ml의 섬유 아세포 배양 배지 및 필터 멸균Worthington4176
멸균 1X 인산염 완충액 식염수 (PBS) 칼슘 및 마그네슘 무함유Lonza17-516F
1 차 근 세포
50 ml 및 15 ml 멸균 원추형 튜브GeneMate / BioexpressC-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))멸
균 메스Aspen Surgical372610
혈구계Hausser Scientific1492
멸균 5, 10 및 25 ml 피펫Bellco glass1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)재사용 가능한 피펫은 사용 전에 세척, 면 플러그 및 오토클레이브 멸
균 조직 배양 처리 플라스틱 접시 (10 cm)BD Falcon353003
멸균 나일론 셀 스트레이너 (100 µ m 및 40 &마이크로; m 사이즈)BD 팔콘352340 (40&마이크로; m); 352360(100&마이크로; m)
  myoblast immortalization
Sterile 0.45 µ를 위한 재료; m 필터MilliporeSLHV013SL
클로닝 링Corning#3166-8사용 전후에 세척 및 고압클레이
섬유아세포 세포주용 재료 
멸균 35mm 조직 배양 처리된 플라스틱 접시Greiner bio-one628160
멸균 메스DeRoyalD4510A
멸균 T25 조직 배양 플라스크테크노 플라스틱 제품, MIDSCI
. 됨 를 분리하기 위한 시약 DMEM Collagenase D  포함 의 불멸화를 위한 시약 분리용 재료 브 해야 합니다. TrypLE express GIBCO Life Technologies 12605-010 에 의해 미국에서 판매된 TPP 90026

참고문헌

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재인쇄 및 허가

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정오

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

태그

FACSCDK4hTERT

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