이 프로토콜의 목적은 줄기세포 귀환 인자인 SDF-1α를 덱스트란 황산염-키토산 나노입자에 통합하는 것입니다. 생성된 입자는 크기와 제타 전위뿐만 아니라 나노 입자에서 SDF-1α의 함량, 활성 및 체외 방출 속도에 대해 측정됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
키토산(CS)과 덱스트란 설페이트(DS)는 하전 다당류(글라이칸)로, 적절한 조건에서 혼합될 때 고분자 전해질 복합체 기반 나노 입자를 형성합니다. 글라이칸 나노입자는 단백질 인자에 대한 유용한 운반체로, 단백질의 생체 내 전달을 촉진하고 표적 조직에서 단백질의 유지를 유지합니다. 글라이칸 고분자 전해질 복합체는 또한 단백질 전달에 이상적이며, 혼입은 수용액에서 수행되어 단백질의 불활성화 가능성을 줄이기 때문입니다. 헤파린 결합 부위를 가진 단백질은 덱스트란 설페이트에 쉽게 부착되고, 차례로 결합에 의해 안정화됩니다. 이러한 입자는 또한 in vivo에서 전달될 때 염증성과 독성이 적습니다. 아래 설명된 프로토콜에서는 줄기세포 귀환 인자인 SDF-1α(Stromal cell-derived factor-1α)를 먼저 혼합하여 덱스트란 설페이트와 배양합니다. 혼합물에 키토산을 첨가하여 고분자 전해질 착물을 형성한 다음 황산아연을 첨가하여 아연 브리지로 착물을 안정화합니다. 그 결과 생성된 SDF-1α-DS-CS 입자는 크기(직경)와 표면 전하(제타 전위)를 측정합니다. 통합된 SDF-1α의 양을 결정한 후 체외 방출 속도와 입자 결합 형태의 화학주성 활성을 측정합니다.
서론
덱스 트란 황산 (DS)과 키토산 (CS)는 (DS)에 여러 대체 음으로 하전 된 황산 그룹과 폴리 사카 라이드, 또는 양전하 아민 그룹입니다 (CS를 탈 아세틸). 수용액에 혼합 할 때, 두 가지 다당류는 정전 기적 상호 작용을 통해 고분자 전해질 복합체를 형성한다. 얻어진 착물 수용액 (침전물)로부터 상분리한다 큰 응집체 또는 수분 산성 (콜로이드)의 소형 입자를 형성 할 수있다. 이러한 결과에 기여하는 구체적인 조건은 광범위하게 연구되어 왔으며, 최근의 리뷰에서 요약 한 상세히 도시되어있다. 이러한 조건 중에서, 수분 산성 입자를 제조하기위한 두 가지 기본적인 요구 반대로 대전 된 중합체는 1)이 크게 상이한 몰 질량을 가져야이고; 2) 비 화학량 론적 비율로 혼합 될 수있다. 이러한 조건에 의해 생성 된 전하 전하 중성 복합체 중합체 세그먼트를 허용중화는 분리 및 입자의 코어를 형성하고, 여분의 중합체는 외부 쉘을 형성하기 위해 하나한다. 이 프로토콜에 기재된 당쇄 입자는 폐 전달을 위해 의도되고, 음으로 하전 된 순으로 설계되고, 나노 사이즈의. 음극 표면 전하 입자 2,3의 세포 흡수의 가능성을 감소시킨다. 나노 사이즈의 입자는 원위기도 통로를 통해 용이하게한다. 이 목표를 달성하기 위해, 본 제조에 ....
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프로토콜
SDF-1α 글리 칸 나노 입자의 1. 준비
생체 내 전달의 목적으로 인해, 제조에 사용 된 모든 용기, 피펫 팁을 소독.
- 초순수에서 다음 원액을 준비 : 1 % 덱스 트란 황산; 1 M의 NaOH (PES 막으로 멸균 여과); 0.1 % (0.8 연속적 0.22 μm의 필터를 통해 필터 및 그 후에 NaOH로 pH가 5.5로 조정), 0.2 % 빙초산 키토산; 0.1 M ZnSO 4; 15 % 만니톨; 0.92 ㎎ / ㎖ SDF-1α (80 ° C에서 분취 액에 저장되고, 4 ℃에서 보관 일단 해동 C).
- 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 재고 솔루션을 소독. 리 물러의 amebocyte 용 해물 (LAL) 젤 응고 분석에 준비된 용액에 독소 수준을 평가합니다. 수준이 <0.06 EU / ㎖ 있는지 확인합니다.
- 자기 교반 막대를 함유하는 1.5 mL 유리 바이알에 0.18 ml의 초순수를 추가한다. 800 rpm으로 교반 속도를 설정합니다. 0.1 ml의 1 %를 추가덱스 트란 설페이트 및 2 분 동안 교반한다. 0.08 mg을 SDF-1α (0.92 Mg를 0.087 ㎖ / ml의 SDF-1α 용액)를 첨가하고, 20 분 동안 교반한다.
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결과
제조 된 SDF-1α-DS-CS 입자의 크기 및 제타 전위는 입자 분석기로 측정된다. 1 사이즈의 측정 분석을 보여준다. 네 개의 반복 된 측정에 의한 결과로부터 cumulants, SDF-1α-DS-CS 입자의 유체 역학적 평균 직경은 661 ± 8.2 (㎚)이고 분산도는 0.23 ± 0.02이다. 제타 전위 측정의 결과는도 2에 도시되어있다. 다섯 반복 측정에서, SDF-1α-DS-CS 입자의 제타 전위는 -24.8 ± 0.5 MV이다. 전술 한 바와 같이, SDF-1α-DS-CS 입자 현탁액에 5 % 만니톨의 존재는 냉동 및 해동 과정에서 입자의 응집을 예방에 필수적이다.도 3으로 보여 물에 현탁시키고 동결 입자의 크기 측정 -80 ° C. 별개의 집계 피크는 해동 후 볼 수 있습니다.
AMOSDF-1α-DS-CS 입자의 SDF-1α의 UNT는 SDS.......
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토론
전술 한 바와 같이, DS-CS 나노 입자 폴리 음이온 (DS)과 폴리 양이온 (CS) 분자간 전하 중성화를 통해 형성된다. 전하 상호 작용은 분자 충돌시 쉽게 발생하기 때문에, 혼합 중에 중합체 용액 및 교반 속도의 농도는 생성 된 입자의 크기가 중요하다. 일반적인 경향은 더 DS 및 CS 솔루션 (15) 및 작은 입자의 높은 교반 속도 결과를 희석하고 있다는 것이다.
SDF-1α 글리 칸의 나노 입자 제제는 필요에 따라 변경 될 수있다. 예를 들어,이 프로토콜에서 사용되는 SDF-1α / DS / CS의 양 및 비율은 각각 0.08 / 0.33 / 1 (㎎ / ㎎ / MG)이다. SDF-1α 나노 입자의 용도에 따라, 이러한 비율을 변경할 수있다. SDF-1α의 양을 첨가하는 경우는 ~, 입자가 더 작 650 내지 0.04 mg의 대신에 0.08의 Mg (0.04 / 0.33 / 1 ㎎ / ㎎ / MG)이며, SDF-1α 포집 효율이 약간 greater.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
HL671795, HL048743 및 HL108630 :이 작품은 NIH 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 덱스트란 황산염 | Fisher | BP1585-100 | |
| 키토산, 저분자량 | Sigma | 448869 | |
| 아연 황산염 헵타하이드레이트 | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| 초순수 | 인비트로젠 | 10977-023 | |
| SDF-1&알파; | 참고 8에 따라 준비되었습니다. | ||
| 주사기 필터, PES 멤브레인 0.22 μ m | Millipore | SLGP033RS | |
| 자석 마이크로 교반 바 (2 엑스 7 mm) | 피셔 | 14-513-63 | |
| 유리 바이알 키트; SUN-SRI | 피셔 | 14-823-182 | |
| Delsa 나노 C 입자 분석기 | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4– 20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| 분자 이미저 VersaDoc MP 4000 시스템 | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell 투과성 지원 | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 유세포 분석기 | BD Biosciences | ||
| Dulbecco' S 인산염 완충 식염수 | 시그마 | D8537 | |
| 피로젠트 플러스 키트 | 피셔 | NC9753738 |
참고문헌
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A.
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재인쇄 및 허가
