방법 논문

SDF-1α-키토산 덱스 트란 황산 나노 입자의 제조 및 특성

DOI:

10.3791/52323

⸱

2015년 1월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Laboratory for Biomaterials and Drug Delivery, Department of Anesthesiology, Division of Critical Care, Boston Children's Hospital

이 논문에서

요약

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이 프로토콜의 목적은 줄기세포 귀환 인자인 SDF-1α를 덱스트란 황산염-키토산 나노입자에 통합하는 것입니다. 생성된 입자는 크기와 제타 전위뿐만 아니라 나노 입자에서 SDF-1α의 함량, 활성 및 체외 방출 속도에 대해 측정됩니다.

초록

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키토산(CS)과 덱스트란 설페이트(DS)는 하전 다당류(글라이칸)로, 적절한 조건에서 혼합될 때 고분자 전해질 복합체 기반 나노 입자를 형성합니다. 글라이칸 나노입자는 단백질 인자에 대한 유용한 운반체로, 단백질의 생체 내 전달을 촉진하고 표적 조직에서 단백질의 유지를 유지합니다. 글라이칸 고분자 전해질 복합체는 또한 단백질 전달에 이상적이며, 혼입은 수용액에서 수행되어 단백질의 불활성화 가능성을 줄이기 때문입니다. 헤파린 결합 부위를 가진 단백질은 덱스트란 설페이트에 쉽게 부착되고, 차례로 결합에 의해 안정화됩니다. 이러한 입자는 또한 in vivo에서 전달될 때 염증성과 독성이 적습니다. 아래 설명된 프로토콜에서는 줄기세포 귀환 인자인 SDF-1α(Stromal cell-derived factor-1α)를 먼저 혼합하여 덱스트란 설페이트와 배양합니다. 혼합물에 키토산을 첨가하여 고분자 전해질 착물을 형성한 다음 황산아연을 첨가하여 아연 브리지로 착물을 안정화합니다. 그 결과 생성된 SDF-1α-DS-CS 입자는 크기(직경)와 표면 전하(제타 전위)를 측정합니다. 통합된 SDF-1α의 양을 결정한 후 체외 방출 속도와 입자 결합 형태의 화학주성 활성을 측정합니다.

서론

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덱스 트란 황산 (DS)과 키토산 (CS)는 (DS)에 여러 대체 음으로 하전 된 황산 그룹과 폴리 사카 라이드, 또는 양전하 아민 그룹입니다 (CS를 탈 아세틸). 수용액에 혼합 할 때, 두 가지 다당류는 정전 기적 상호 작용을 통해 고분자 전해질 복합체를 형성한다. 얻어진 착물 수용액 (침전물)로부터 상분리한다 큰 응집체 또는 수분 산성 (콜로이드)의 소형 입자를 형성 할 수있다. 이러한 결과에 기여하는 구체적인 조건은 광범위하게 연구되어 왔으며, 최근의 리뷰에서 요약 한 상세히 도시되어있다. 이러한 조건 중에서, 수분 산성 입자를 제조하기위한 두 가지 기본적인 요구 반대로 대전 된 중합체는 1)이 크게 상이한 몰 질량을 가져야이고; 2) 비 화학량 론적 비율로 혼합 될 수있다. 이러한 조건에 의해 생성 된 전하 전하 중성 복합체 중합체 세그먼트를 허용중화는 분리 및 입자의 코어를 형성하고, 여분의 중합체는 외부 쉘을 형성하기 위해 하나한다. 이 프로토콜에 기재된 당쇄 입자는 폐 전달을 위해 의도되고, 음으로 하전 된 순으로 설계되고, 나노 사이즈의. 음극 표면 전하 입자 2,3의 세포 흡수의 가능성을 감소시킨다. 나노 사이즈의 입자는 원위기도 통로를 통해 용이하게한다. 이 목표를 달성하기 위해, 본 제조에 사용되는 DS의 양은 CS 초과 (중량비 3 : 1); 고 분자량은 DS (중량 평균 MW 500,000)와 저분자 CS (MW kDa의 범위 50-190, 75~85% 탈 아세틸)이 사용된다.

SDF-1α는 화성 활동을 통해 원점 복귀 기능을 발휘 줄기 세포 호밍 ​​요인이다. SDF-1α는 원점과 골수 조혈 줄기 세포의 유지에 중요한 역할을하고 proge의 모집부상 수리 4,5의 말초 조직에 nitor 세포. SDF-1α는 단백질이 프로테아제 (CD26 / DPPIV) 불활로부터 보호, 헤파린 / 헤파 란 설페이트, 형태 다이머에 결합하고, 세포 표면 수용체를 통해 표적 세포와 상호 작용할 수 있도록 그 단백질 서열에 헤파린 결합 부위를 갖는다 6-8. DS는 헤파린 / 헤파 란 황산과 유사한 구조적 특성이있다; 따라서, DS에 대한 SDF-1α의 결합은 천연 고분자 리간드의 그것과 유사하다.

다음 프로토콜에서 우리는 SDF-1α-DS-CS 나노 입자의 제조 방법을 설명합니다. 절차는 이전에 9를 연구 된 제제 중 하나를 나타냅니다. 프로토콜은 원래 VEGF-DS-CS 나노 입자 (10)의 조사에서 적합하다. 소규모 제조 용이 동일한 스톡 용액 및 제조 조건으로 확장 할 수있는 기술된다. 제조 후, 입자 b를 특징Y는 크기, 제타 전위, SDF-1α 통합의 정도, 체외 방출 시간 및 통합 SDF-1α의 활동을 조사.

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프로토콜

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SDF-1α 글리 칸 나노 입자의 1. 준비

생체 내 전달의 목적으로 인해, 제조에 사용 된 모든 용기, 피펫 팁을 소독.

  1. 초순수에서 다음 원액을 준비 : 1 % 덱스 트란 황산; 1 M의 NaOH (PES 막으로 멸균 여과); 0.1 % (0.8 연속적 0.22 μm의 필터를 통해 필터 및 그 후에 NaOH로 pH가 5.5로 조정), 0.2 % 빙초산 키토산; 0.1 M ZnSO 4; 15 % 만니톨; 0.92 ㎎ / ㎖ SDF-1α (80 ° C에서 분취 액에 저장되고, 4 ℃에서 보관 일단 해동 C).
  2. 0.22 μm의 필터 멤브레인을 통해 재고 솔루션을 소독. 리 물러의 amebocyte 용 해물 (LAL) 젤 응고 분석에 준비된 용액에 독소 수준을 평가합니다. 수준이 <0.06 EU / ㎖ 있는지 확인합니다.
  3. 자기 교반 막대를 함유하는 1.5 mL 유리 바이알에 0.18 ml의 초순수를 추가한다. 800 rpm으로 교반 속도를 설정합니다. 0.1 ml의 1 %를 추가덱스 트란 설페이트 및 2 분 동안 교반한다. 0.08 mg을 SDF-1α (0.92 Mg를 0.087 ㎖ / ml의 SDF-1α 용액)를 첨가하고, 20 분 동안 교반한다.
  4. 0.33 ml의 0.1 % 키토산 적가하고 추가 5 분 동안 교반한다. 변경 볶음 최대 속도 (1 분 이상) 0.1 ML의 주사기로 천천히 0.1 ml의 0.1 M ZnSO 4를 추가합니다.
  5. 800 rpm으로 교반 속도를 반환하고, 30 분 동안 교반한다. 0.4 ml의 15 % 만니톨을 추가하고 5 분 동안 교반한다. 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 반응 혼합물을 전송. 10 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 원심 분리기.
    주 : 만니톨의 존재는 원심 분리 후 입자의 부유를 용이하게한다. 펠릿의 소형화에 따라 만니톨의 농도는 0 %에서 5 %로 변화 될 수있다. 원심 분리 후, 각 입자의 완전 재현 탁하여 최종 현탁액 응집체를 피하기 위해 중요하다.
  6. 기음 뜨는 천천히 액체의 마지막 한 방울을 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 0.2 ml의 5 % 만니톨을 추가합니다. 0.5 ml의 펠렛을 일시 중단, 29 G의 옛 성은DLE 주사기. 1 ml의 5 % 만니톨을 추가합니다. 15 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기.
  7. 단계를 반복 1.6.
  8. 뜨는을 기음. 0.2 ml의 5 % 만니톨 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 입자 현탁액을 저장합니다.
    주 : 입자 현탁액도 저장 -80 ° C에서 동결 또는 동결 건조 될 수있다. 서스펜션 포함 5 % 만니톨 동결 및 해동 후 또는 동결 건조 및 수분 보충 후 입자의 응집을 방지하기 위해 필수적이다. 만니톨 보존 후의 현탁액을 원심 분리에 의해 제거 될 수있다.

입자 크기와 제타 전위 2. 측정

입경 및 제타 전위를 소재리스트에 표시된 입자 분석기로 각각 동적 광산란 및 전기 영동 광 산란에 의해 분석된다.

  1. 축적 시간 : 다음 입자 크기 측정을위한 파라미터를 설정 (70); 반복 시간 : 4; 온도 : 25 ° C;희석제 : 물; 강도 조절 : 자동.
  2. 물 (10 배 희석)와 SDF-1α-DS-CS 샘플을 희석. 이러한 에펜 도르프 베트로 일회용 UV 큐벳에 시료 100 ㎕를 넣습니다. 셀 홀더에 큐벳을 삽입합니다. "최적"(~ 10,000 CPS)에 도달하기 위해 강도 조정 기다립니다. 데이터 수집을 시작합니다.
  3. 측정이 완료되면, 직경 (㎚) 및 다 분산도 지수 cumulants 결과를 기록한다. 4 반복 판독 각각으로부터 얻어진 결과를 평균치와 표준 편차를 계산한다.
  4. 로드 제타 전위 측정 플로우 셀에 10 배 희석 한 시료의 입자 500 μL. 누적 시간 : 다음 측정을위한 매개 변수를 설정합니다 (10); 반복 시간 : 5; 온도 : 25 ° C; 희석제 : 물; 강도 조절 : 자동. 제타 전위 (MV)의 결과를 기록한다. (5) 판독 반복의 각각으로부터 얻어진 결과를 평균 및 표준을 계산 deviatioN.

입자의 SDF-1α의 3 정량화

  1. 1.3 램 믈리 샘플 버퍼에 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 ㎎ / ㎖의 농도 자유 양식 SDF-1α를 희석. 40 μL의 1.3 배 램 믈리 샘플 버퍼 6 μL SDF-1α-DS-CS 샘플을 희석. (나눈다. 작은 분취 량으로 원액을 0.25 M 트리스 -HCl, pH가 7.5, 8 % SDS, 40 % 글리세롤, 0.05 ㎎ / 브로 모 페놀 블루,는 ml 8 % 2- 머 캅토 에탄올을 함유 4X 램 믈리 스톡 완충액을 준비하고 -20 ℃로 유지 단일 사용하기 위해 C를 °.)
  2. 10 분 동안 100 ℃에서 샘플을 가열한다. 소용돌이 입자를 완전히 해리시키기 위해 10 분 동안 가열 시간 배 샘플 (최대 속도로 10 초 동안 각각). 2 분 동안 RT에 샘플을 냉각. 0.5 분 10,000 XG에 원심 분리기는 응축수를 가져올 수 있습니다. 소용돌이는 다시 잘 섞는다.
    참고 :이 시점에서, 시료 용액이 눈에 보이는 침전물 존재와 명확해야한다.
  3. 로드 10# 181; L 샘플 / 웰에 4-20 %의 SDS 젤. 20 분 동안 200 V의 전기를 실행합니다. 코마시 블루 단백질 얼룩 젤을 얼룩.
  4. 분자 이미 저와 농도계 분석 소프트웨어를 사용하여 SDF-1α의 단백질 밴드 밀도를 검사합니다. 무료 SDF-1α 표준 구성된 표준 곡선에 대한 입자 SDF-1α의 양을 계산합니다.

생체 외 자료 분석 4.

  1. 1 칼슘과 마그네슘 (D-PBS)없이 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수와 SDF-1α 글리 칸 입자를 혼합 : 1의 비율 (v / v)로.
  2. 1.5 ml의 튜브에 0.05 ㎖의 분취 량으로 입자 현탁액을 나눕니다. 튜브의 바닥에 샘플을로드합니다. 기포를 도입 또는 액체의 표면을 방해하지 않도록. 파라 필름으로 튜브의 상단을 밀봉합니다.
    주 : 이때, 액체는 튜브 믹서 후속 상하 회전시 하단에 남아있을 것이다.
  3. 37에서 튜브를 회전# 176; C 회전 마이크로 튜브 믹서에. 지정된 시간에 튜브에서 분취 액을 제거하고 즉시 4 ° C에서 10 분 동안 16,000 XG에서 원심 분리.
  4. 상층 액과 펠렛을 분리, 0.05 ml의 D-PBS로 펠렛을 재구성. -20 ° C에서 샘플을 저장합니다. 모든 샘플이 수집 된 후 전술 한 바와 같이, SDS 겔상에서 상등액과 펠릿을 조사.

5. 마이그레이션 분석

이 분석은 SDF-1α의 화성 활동을 측정합니다. 세포 표면의 수용체 (CXCR4)와 SDF-1α의 상호 작용은 SDF-1α의 그라데이션으로 세포의 이동을 야기한다. 이 분석에서, 세포는 낮은 잘으로하고 SDF-1α 솔루션 (낮은 우물에서 반투과성 막에 의해 분리) 상부 우물에로드됩니다.

  1. SDF-1α 희석 (유리 또는 입자 - 결합 된 형태) -3- FO에서 이주 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민을 함유하는 RPMI-1640 배지)100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, 및 0.05 ng를 / ㎖의 최종 농도로 용액을 희석 LD.
  2. 24 웰 플레이트에 웰에 희석 된 SDF-1α 솔루션 또는 마이그레이션 버퍼 만 (대조군)의 0.6 ML을 추가합니다. 잘 (입력 셀 제어)에 0.57 ml의 마이그레이션 버퍼를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 이러한 낮은 잘 위에없이 Transwell (기공 크기 5 μm의 직경 6.5 mm)로 투과 세포 배양 삽입을 놓습니다. 트랜스 웰에 0.1 ml의 된 Jurkat 세포 (5 × 10 5)를 삽입로드. 잘 입력 세포 제어에 직접 0.03 ml의 세포를로드합니다. 5 % CO 2 인큐베이터에서 2 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션.
  3. 트랜스 웰 인서트를 제거합니다. 4 ml의 폴리스티렌 튜브에 낮은 우물로 마이그레이션 한 세포를 전송합니다. 유량 계측기와 마이그레이션 된 세포를 계산합니다.
  4. negat에 숫자의 감산 입력 후 세포 수 (X 웰 100/30 입력 셀 컨트롤 세포 수)의 백분율로 계산 이주컨트롤 (에만 이동 완충액을 함유하는 웰에 마이그레이션 셀) 필자.

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결과

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제조 된 SDF-1α-DS-CS 입자의 크기 및 제타 전위는 입자 분석기로 측정된다. 1 사이즈의 측정 분석을 보여준다. 네 개의 반복 된 측정에 의한 결과로부터 cumulants, SDF-1α-DS-CS 입자의 유체 역학적 평균 직경은 661 ± 8.2 (㎚)이고 분산도는 0.23 ± 0.02이다. 제타 전위 측정의 결과는도 2에 도시되어있다. 다섯 반복 측정에서, SDF-1α-DS-CS 입자의 제타 전위는 -24.8 ± 0.5 MV이다. 전술 한 바와 같이, SDF-1α-DS-CS 입자 현탁액에 5 % 만니톨의 존재는 냉동 및 해동 과정에서 입자의 응집을 예방에 필수적이다.도 3으로 보여 물에 현탁시키고 동결 입자의 크기 측정 -80 ° C. 별개의 집계 피크는 해동 후 볼 수 있습니다.

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토론

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전술 한 바와 같이, DS-CS 나노 입자 폴리 음이온 (DS)과 폴리 양이온 (CS) 분자간 전하 중성화를 통해 형성된다. 전하 상호 작용은 분자 충돌시 쉽게 발생하기 때문에, 혼합 중에 중합체 용액 및 교반 속도의 농도는 생성 된 입자의 크기가 중요하다. 일반적인 경향은 더 DS 및 CS 솔루션 (15) 및 작은 입자의 높은 교반 속도 결과를 희석하고 있다는 것이다.

SDF-1α 글리 칸의 나노 입자 제제는 필요에 따라 변경 될 수있다. 예를 들어,이 프로토콜에서 사용되는 SDF-1α / DS / CS의 양 및 비율은 각각 0.08 / 0.33 / 1 (㎎ / ㎎ / MG)이다. SDF-1α 나노 입자의 용도에 따라, 이러한 비율을 변경할 수있다. SDF-1α의 양을 첨가하는 경우는 ~, 입자가 더 작 650 내지 0.04 mg의 대신에 0.08의 Mg (0.04 / 0.33 / 1 ㎎ / ㎎ / MG)이며, SDF-1α 포집 효율이 약간 greater...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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HL671795, HL048743 및 HL108630 :이 작품은 NIH 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
덱스트란 황산염FisherBP1585-100
키토산, 저분자량 Sigma448869
아연 황산염 헵타하이드레이트Sigma204986
D-MannitolSigmaM9546
초순수 인비트로젠 10977-023
SDF-1&알파;참고 8에 따라 준비되었습니다.
주사기 필터, PES 멤브레인 0.22  μ mMilliporeSLGP033RS
자석 마이크로 교반 바 (2  엑스  7  mm)피셔 14-513-63
유리 바이알 키트; SUN-SRI피셔 14-823-182
Delsa 나노 C 입자 분석기 Backman Coulter
Eppendorf UVette CuvetsEppendorf952010069
4– 20% Mini-PROTEAN TGX GelBio-Rad456-1096
GelCode Blue Safe Protein StainFisher PI-24592
분자 이미저 VersaDoc MP 4000 시스템BioRad170-8640
Corning Transwell 투과성 지원Corning3421
Accuri C6 유세포 분석기BD Biosciences
Dulbecco' S 인산염 완충 식염수 시그마D8537
피로젠트 플러스 키트피셔NC9753738

참고문헌

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