방법 논문

인간과 마우스의 뇌실 주위 조직의 측면 심실 및 조직 학적 특성의 3D 모델링

DOI:

10.3791/52328

⸱

2015년 5월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, 2Department of Anatomic Pathology and Laboratory Medicine, University of Connecticut Health Center

이 논문에서

요약

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MRI 스캔(인간), 3D 이미징 소프트웨어 및 면역조직학적 분석을 사용하여 뇌의 외측심실의 변화를 문서화합니다. 그런 다음 노화 또는 질병으로 인해 인간 뇌에서 발생하는 외심실 부피 변화의 종단 3D 매핑과 뇌실 주위 세포 변화의 특성화를 마우스에서 모델링합니다.

초록

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심실계는 뇌척수액(CSF)을 운반하고 순환시키며 뇌에서 용질과 독소를 제거하는 것을 용이하게 합니다. 심실의 기능 단위는 뇌실막 세포(ependymal cell)라고 하는 섬모 상피 세포로, 뇌실을 둘러싸고 섬모 작용을 통해 심실 표면에서 CSF의 층류를 생성할 수 있습니다. 이 뇌실막 세포의 단층은 또한 뇌 간질액(ISF)과 순환 CSF 사이의 교환을 촉진하는 장벽 및 여과 기능을 제공합니다. 따라서 뇌의 생화학적 변화는 CSF의 구성에 반영되며, 뇌실막의 파괴는 CSF와 ISF 교환의 섬세한 균형을 깨뜨릴 수 있습니다. 인간의 경우 측심실 확장과 노화 사이에는 강한 상관관계가 있습니다. 연령 관련 뇌실 비대는 치매나 CSF 흐름의 방해가 없는 경우에도 발생할 수 있습니다. 심실비대증의 정확한 원인과 진행은 종종 알려져 있지 않습니다. 그러나 심실이 커지면 심실 표면 성상교세포증(ventricle surface astrogliosis) 및 관련 뇌실주위 부종(periventricular edema)이 기능적 뇌실막세포 단층을 대체하면서 뇌실막세포 커버리지의 국부적이고 광범위한 손실을 보일 수 있습니다. MRI 스캔과 사후 인간 뇌 조직을 함께 사용하여 측면 심실 용적의 3D 렌더링을 준비, 이미징 및 컴파일하고, 측면 심실 용적을 계산하고, 안면 외측 심실 벽 조직 제제의 면역 조직화학 분석을 통해 뇌실 주위 조직을 특성화하는 방법을 설명합니다. 또한 마우스 뇌 조직에 대한 해당 분석이 제시되어 인간의 노화 및 질병에서 발견되는 외측 심실 및 뇌실 주위 조직의 변화를 평가하기 위한 수단으로 마우스 모델의 사용을 지원합니다. 이러한 프로토콜을 통해 심실비대증의 원인과 결과를 조사할 수 있으며 뇌실 시스템 건강과 뇌 내 중요한 장벽 및 여과 기능을 연구하는 기술을 강조할 수 있습니다.

서론

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뇌실막 세포 단층 선 뇌척수액 (CSF) 및 격자 간 유체 (ISF) 1-3 간의 양방향 장벽 및 전송 기능을 제공하는 뇌의 심실 시스템. 이러한 기능은 뇌가 독성이없는 생리적 균형 2,3에서 유지하는 데 도움이됩니다. 부상 또는 질병을 통해이 안감의 일부의 인간 손실에서 다른 상피 라이닝에서 발견 회생 교체에 결과에 표시되지 않습니다; 오히려 뇌실막 셀 커버리지의 손실은 심실 표면에서 뇌실막 세포의 무 결함 영역을 커버하는 성상 세포의 메쉬 작업과 뇌실 주위 백질 as​​trogliosis 될 것으로 보인다. 중요한 CSF / ISF 교환 및 통관 메커니즘에 심각한 영향이 상피 층 1,2,4-7의 손실이 발생할 것으로 예상된다.

인간의 노화의 일반적인 기능은 측면 심실 (뇌실) 및 observ 등 관련 뇌실 주위 부종을 확대MRI 및 유체 감쇠 반전 회복 자기 공명 영상 (MRI / FLAIR) 8-14에 의해 에드. 뇌실과 심실 라이닝의 세포 조직 사이의 관계를 조사하기 위해, 사후 인간의 자기 공명 영상 시퀀스는 측면 뇌실 뇌실 주위 조직의 조직 학적 제제와 일치했다. 뇌실 가지 경우에서, 신경교 증의 실질적인 영역은 측면 뇌실 벽을 따라 뇌실막 세포 커버....

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프로토콜

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참고 : 동물 절차 IACUC 코네티컷 대학의 승인을 NIH의 지침을 준수 하였다. 인간의 조직 및 데이터 분석 및 절차를 준수했고, 코네티컷 IRB 대학의 승인을 NIH 가이드 라인을 준수합니다.

1. 마우스 : 뇌실의 뇌실 주위 세포 무결성 및 3D 모델링 분석

마우스 뇌실 벽 전체 마운트 1.1) 준비

  1. 면역 조직 화학 (IHC)에 대한 마우스 측면 뇌실 전체 마운트 준비는 이전에 16, 17을 설명했다.

측면 뇌실 분석을위한 1.2) 면역 조직 화학

  1. 이전 18, 19 설명 된대로 수정하고 섹션 마우스 뇌 조직.
    1. 기관은 (옅은 채색으로 표시) 삭제 될 때까지 간단히로 transcardially 정상과 같은 높이 마우스는 실온 식염수, 실온 4 % 파라 포름 알데히드 다음조직까지 0.1 M 인산염 완충 생리 식염수에 (PFA) (PBS)를 보강했다.
    2. 두개골에서 뇌를 제거합니다. 시상 봉합 따라 두개골의 기지에서 잘라 홍채 해부 가위를 사용합니다.
    3. 두개골을 노출하고 집게로 머리를 제거합니다. 밤새 4 ℃에....

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결과

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면역 염색 50 μm의 관상 섹션과 3D 재구성 (그림 3)에 따라 마우스 측면 심실의 윤곽 추적은 볼륨 데이터가 질병이나 부상에 대한 모델 시스템으로 마우스를 사용하여 다른 실험 패러다임에서 수집 할 수 있습니다. 이 절차에 긴급 뇌실 벽이 서로 접착 영역을 배제한다. 심실의 영역 subsegmenting 각 영역 (도 3C)에 대해 다른 색을 지정함으로써, 인접한 절편을 준수 할 수 있고, 지역 및 총 부피는 컴파일 서브 세그먼트로부터 계산 될 수있다.

비슷한 연구는 3D 렌더링에 대한 측뇌실 반자동 세그멘테이션 (ITK-SNAP)와 함께 뇌 MRI 스캔을 사용하여 수행 될 수있다. 뇌실 볼륨의 직접 페어링과 뇌실 주위 조직 분석, 사전 또는 사후의 경우 자기 공명 영상 검사는 분할 및 (3D 복원을 만들 정렬 (그림 5)에 대한 중첩 될 수 있습니다. 세로 분석은 미래의 면.......

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토론

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우리는 도구와 쥐 및 인간에서 뇌의 심실 시스템의 무결성을 평가할 수있다 프로토콜을 제시한다. 이러한 도구는, 그러나, 또한, 14,21,22 또는 노화 과정에서 손상, 질환으로 인한 변화를 겪는 다른 뇌 구조 또는 기관 시스템에 적용될 수있다. 전략의 단면과 길이 MRI 시퀀스들의 정렬이 특정 영역 또는 관심있는 구조의 3 차원 볼륨 표현을 생성 할 수있는 소프트웨어의 인출 이점을 제시 하였다. 종 MRI 시퀀스 수 시간에 걸쳐 발생하는 총 뇌 체적비로 뇌실 총 뇌 부피, 및 / 또는 기타 뇌 구조 (예 subthalamic 핵 23 또는 뇌량 백색질을 포함하도록 확장 될 수있는 3 차원 볼륨 변경 컴파일 ) 확산 가중 텐서 영상을 사용하여. 함께, 뇌의 구조적인 변화의 포괄적 인 분석이 수행 될 수있다. 궁극적으로,조영 기술 컬렉션 뇌 구조 노화 관련 질병 - 관련 변화를 평가하기 위해 뇌의 건강 상태 (24)의 가장 정확한 그림.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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NINDS Grant NS05033(JCC)가 이 작업을 지원했습니다. 코네티컷 대학교 RAC, SURF 및 OUR 프로그램은 추가 지원을 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산염 완충 식염수 (PBS)Life Technologies21600-069
파라 포름 알데히드 (PFA)전자 현미경 과학19210PBS, 4 °에서 4 %에서 사용; C
Normal Horse SerumLife Technologies16050PBS-TX 10% (v/v)
Normal GoatSerum Life Technologies16210PBS-TX 10% (v/v)
Triton X-100 (TX)Sigma-AldrichT8787PBS (v/v)에서 0.1%
VibratomeLeicaVT1000S
Fluorescence MicroscopeZeissImager.M2
카메라HamamatsuORCA R2
현미경 스테이지 컨트롤러Ludl 전자 제품MAC 6000
Stereology 소프트웨어MBF BioscienceStereo Investigator 11
Stereology 소프트웨어ImageJ /NIH NIH 프리웨어
3D 재구성 소프트웨어MBF BioscienceNeurolucida Explorer
컨포칼 현미경LeicaTCS SP2
MRI 소프트웨어
, Freesurferhttps://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall분할 및 볼륨
ITK-Snaphttp://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php분할 및 볼륨
다중 이미지 분석 GUI(Mango)http://ric.uthscsa.edu/mango/ 종방향 오버레이
전체 마운트 장비
22.5°; 미세수술용 직선 찌르기 칼Fisher ScientificNC9854830
파라필름
왁스 바닥 해부 접시 
핀
미세 집게
aquapolymount
해부 현미경LeicaMZ95
전체 마운트 항체
마우스 anti-b-cateninBD Bioschiences, San Jose, CA, USA1:250
염소 anti-GFAPSanta Cruz Biotechnology1:250
토끼 anti-AQP4 (aquaporin-4)  Sigma-Aldrich1:400
코로나 항체
Anti-S100β 항체Sigma-Aldrich1:500
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Life TechnologiesD-130610 µ g/ml(PBS)

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
  2. Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid,....

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