Method Article

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

DOI:

10.3791/52333

⸱

June 17th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

In This Article

Summary

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프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

Abstract

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-omics 기술이 잠재적 인 약물의 체외 독성 시험에 대한 새로운 지평을 열어 효율적인 프로토콜은 조합의 다양한 조직으로 인간 만능 줄기 세포를 구별한다. 이러한 분석 용 고체 과학적 근거를 제공하기 위해서는, 현상시 코스 및 시스템 생물학 방법에 의해, 기본 규제 메커니즘 정량적 정보를 얻기 위해 중요하다. 두 분석 따라서 이러한 요구 사항 여기를 조정하고있다. UKK 테스트 시스템에있어서, 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) (또는 다른 다 능성 세포) 자발적 세 배엽 세포의 생성을 허용하도록, 배아 체에서 14 일 동안 분화하도록 남겨진다. 이 시스템은 초기 인간 배아 발달의 주요 단계를 되풀이되었습니다, 세포가 분화하는 동안 화학 물질에 노출 될 경우는, 인간 고유의 초기 배아 독성 / 기형을 예측할 수있다. UKN1 테스트 시스템의 populat에 ​​hESC의 미분에 기초신경 외배엽 전구 이온 (NEP) 육일에 대한 세포. 이 시스템은 초기 신경 발달을 되풀이되었습니다 초기 발달 신경 독성 및 화학 물질에 의해 유발 후생 유전 학적 변화를 예측한다. 두 시스템은, 전 사체 마이크로 어레이 연구와 함께, 생체 독성을 확인하기에 적합하다. 또한, 이들은 시스템 생물학 분석 입력 데이터를 생성하도록 조합하여 사용될 수있다. 이 테스트 시스템은 동물의 대용량을 필요로하는 기존의 독성 연구에 비해 많은 장점을 갖는다. 테스트 시스템은 약물 개발 및 화학적 안전성 평가를위한 비용의 절감에 기여할 수있다. 이들의 조합은 특히 특별히 신경 발달에 영향을 미칠 수있는 화합물에 빛을 비춰.

Introduction

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다양한 유형의 세포로 분화하는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)의 능력은 시험 관내 독성 시험 한 질병 모델링 및 재생 의학 (2)의 새로운 시대를 열었다. 줄기 세포는 자기 복제 할 수있는 능력, 자신의 만능 상태를 유지하고, 전문 세포 3,4로 분화에 부여된다. hESC의의 특성 또한 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 또는 핵 이식 (5)에 의해 생성 된 세포와 같은 다른 사람 다 능성 줄기 세포에서 발견되는 (용량은 모든 주요 세포 타입을 구별하기 위해). 예를 들어, 많은 다른 hESC의 라인은 세포 (13, 14)과 같은 신경 (6), 신장 세포 (7), 신경 능선 세포 (8), 심근 9-12, 또는 간세포로 분화되었다. 또한, hESC의 자발적 배아 체 (사채) (19, 20)의 세 가지 배엽 15 ~ 18의 세포로 분화 할 수 있습니다. 전자아 흘리 배아 개발은 마이크로 어레이 기술 (15)를 사용하여 transcriptomics하여 mRNA의 수준에서 포착 된 다른 배엽과 관련된 다양한 유전자의 발현에 의해 조절된다....

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Protocol

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다음 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포주 (hESC의) H9를 사용하여 수행 하였다. 이 세포주는 정기적으로 hESC의 배양 배지에서 mitotically 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 bFGF와 보충 및 MEFs에 없애, 같은 마트 리겔로 기저막 매트릭스로 코팅 6cm 페트리 접시에 줄기 세포 미디어에서 배양에서 배양 하였다. > 80 % 융합 성 플레이트로부터 H9 세포는 상기 통로에 사용 하였다. 기저막 매트릭스 플레이트상에서 배양 된 H9 세포 사채 형성을 위해 사용 하였다. 다음과 같은 프로토콜에 언급 된 모든 절차는 무균 좋은 세포 배양 방법에 대한 표준 방법을 사용하여 수행되었다.

제 1 부 UKK 테스트 시스템

1. 인간 배아 줄기 세포 배양

  1. 분할 및 피더 세포에 H9의 유지 보수
    1. 각 6cm 판에 피펫 2 ml의 0.1 % 젤라틴 및 세포 배양 incub에서 30 분 동안 품어ATOR (37 ° C에서 5 % CO 2). 멸균 파스퇴르 피펫 대기음 젤라틴 용액.
    2. 두 젤라틴 코팅 된 플레이트에 0.1 × 106

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Results

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UKK 테스트 시스템 중의 메틸 수은 노출

세포 독성 분석은 IC 10 값 메틸 수은의 세포 독성 (10 % 가능성의 감소) (도 1)를 얻었다 H9 EB를 행 하였다. 우리는 또한 마이크로 어레이 기반 (어피 메트릭스 플랫폼) 바이오 마커 연구를 시행 하였다. H9 사채는 14 일 동안 메틸 수은 (0.25 및 1 μM)에 노출되어있다. 14 일째에, 샘플 TRIZOL를 사용하여 수집되었고,이 RNA를 분리 하였다. 전사 프로파일 링은 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 칩을 사용하여 수행 하였다. 데이터는 PARTEK 게놈 스위트 TM 6.6로 분석되고있다. 첫 번째 데이터 개요는 주성분 분석 (도 2A), 벤 다이어그램의 생성 (도 2b)과 히트 맵의 구성 (도 2c)에 의해 수득 하였다. 주성분 분석은 유.......

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Discussion

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독성 시험에 대한 전통적인 접근법에 따라서 테스트 비용과 시간이 많이 소요하게 광범위한 동물 연구를 포함한다. 또한, 종간의 차이로 인해 전임상 동물 안전 연구는 인간을위한 관련 잠재적 인 약물의 독성 효과를 예측하는 항상 유효하지 않습니다. 인간이 아닌 영장류, 가장 예측, 여전히 윤리적 강하고 socioeconomical 요구는 빠르게 체외 시험에 민감하고 강력한 개발하는 현대 사회에 의해 제기되고 있지만 인간의 안전과 관련된 시스템.

인간 배아 줄기 세포의 독특한 능력은 그러므로 약물 안전성 시험 6,21위한 전통적인 접근법에 대한 대안으로서 제안되었다 민감한 toxicogenomics 접근법과 조합하여 생체 내 인간 발달 과정 recapitulating 모든 체세포 형태로 분화한다. 'ESNATS'프로젝트 아래 'UKK'테스트 시스템을 예측하기 위해 개발 된transcr.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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탁월한 기술 지원을 제공해 주신 M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani 및 Cornelia Böttinger에게 감사드립니다. 이 연구는 독일연구재단(RTG 1331)과 독일연구부(BMBF)의 보조금으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F-12Life Technologies11320082 Dulbecco의 Modified Eagle 배지:영양 혼합물 F-12
KOSRLife Technologies10828028 녹아웃 세럼 교체
GlutaMAXLife Technologies35050061GlutaMAX 보충제
NEAALife Technologies11140050MEM 비필수 아미노산 솔루션
DPBSLife Technologies14190-0144Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 칼슘 없음, 마그네슘
mTeSR 매체없음 Stemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V 바닥 판VWR734-0483플레이트, Microwell, V BTTM, 96 Well, 멸균 1 * 50 ST
V 바닥 플레이트 뚜껑VWR634-0011뚜껑, Microtitre 플레이트, Cond. 링 1 * 50 ST
펜/스트렙라이프 테크놀로지15140-122페니실린-스트렙토마이신, 액체
증류수라이프 테크놀로지15230-089.멸균 증류수
인간 FGF-2 (bFGF)MilliporeGF003AF-100UG섬유 아세포 성장 인자 기본, 인간 재조합, 동물 무료
필터 0.22 μ mMilliporeSCGPU02REStericup-GP, 0.22 μ m, 폴리에테르설폰, 250ml, 방사선 멸균
StemPro EZPassageTM DisposablteInvitrogen23181010
BD MatrigelTM, hESC 인증 MatrixStemcell Technologies3542775ml 바이알
DMSOSigmaD-2650
RNAlater 안정화 솔루션Life TechnologiesAM7020이는 동결되지 않은 샘플에서 RNA 무결성을 안정화하고 보호합니다.
70 &뮤; m 세포 여과기Becton Dickinson35235070 &mu를 가진 세포 여과기; m 나일론 메쉬
35 μ m 뚜껑 셀 여과기, 5  ml 튜브Becton Dickinson3522355ml 폴리스티렌 라운드 바닥 테스트 튜브, 셀 스트레이너 캡 (35  &뮤; m)
50ml 멸균 폴리프로필렌 튜브Greiner Bio-One22726150ml 폴리프로필렌 튜브(원뿔형 바닥 포함), 멸균
T75 플라스크Greiner Bio-One658175CELLSTAR 필터 캡 세포 배양 75cm2 플라스크
TRIzolLife Technologies10296010
96웰 광학 바닥 플레이트Thermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
ApotransferinSigma-AldrichT-2036
DispaseWorthington BiochemicalsLS002104
DorsomorphinTocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R& D Systems233-FB
젤라틴시그마-알드리치G1890-100G
포도당시그마-알드리치G7021-100G
글루타맥스기브코 인비트로젠35050-038
HEPESGibco 인비트로젠15630-056
인슐린시그마-알드리치I-6634
녹아웃 DMEM기브코 Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR & D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ProgesteronSigma-AldrichP7556
PutrescineSigma-AldrichP-5780
ROCK 억제제 Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
셀레늄시그마-알드리치S-5261
&베타;-메르캅토에탄올Gibco Invitrogen31350-010
[헤더]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
GeneChip Hybridization, Wash, and Stain KitAffymetrix900721, 22, 23이 키트는 마이크로어레이의 혼성화 세척 및 염색에 필요한 모든 시약을 제공합니다.
Rnase-Free DNase 세트QIAGEN79254
[header]
장비 목록
도립 현미경OlympusIX71
Genechip Hybridization Oven - 645Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450Affymetrix
Affymetrix 유전자 칩 스캐너-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5분자 장치
 
 
 
[header]
List of softwares
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
기능 주석을 위한 온라인 도구
DAVID
Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory
스 스

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceut....

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