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방법 논문

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

12.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

2015년 1월 4일

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

이 논문에서

요약

종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

초록

리지드 종양 조직 강하게 암 세포 이동 및 침입 조절에 연루되어왔다. 가교 조직을 통해 침략 마이그레이션은 단백질 가수 분해 세포 외 기질 (ECM)을 저하 invadopodia라는 굴지의 풍부한 돌출부에 의해 촉진된다. Invadopodia 활성은 강성 신호 액토 마이 오신 수축력을 통하여 이러한 세포 내 구조를 조절할 수 있음을 시사 ECM 강성 암세포 수축력에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 두 분석 사이에 변동이 존재하지만, 여기에 제시된 프로토콜 번째 PAAS를 만들기위한 방법을 제공한다AT는 두 분석에서 쉽게 사용될 사용자의 특정 생물학적 및 기술적 요구에 적응할 수있다.

서론

종양 관련 ECM의 강성 액토 마이 오신의 수축성 1-3을 증가시켜 악성 동작을 운전에 중요한 요소로 확인되었습니다. 이 효과는 주로 유방암 세포로 입증되었지만, 매트릭스 강성 암의 다른 유형에 중요한 역할을 할 수 있음 종양 강성을 제안 암 4-8 다양한 유래의 세포의 침입 특성을 변경하는 것으로 밝혀졌다. 침습성 마이그레이션 중 가교 결합 조직을 관통하도록, 암세포는 국소 적 ECM 9 저하 테이나 지역화 invadopodia라고도 액틴 풍부한 접착제 돌출부들을 이용한다. Invadopodia 침략 세포의 특징으로 간주되며 암세포 침윤 및 전이 10,11에 연루되어있다. 이전 작업은 매트릭스 강성이 invadopodia 번호를 조절할 수있는 것으로 나타과 미오신 II 활동과 mechanosensitive 단백질 (12)를 통해 ECM 저하 4,12 관련 지을 수 있고 있습니다. 주어진종양 및 암 밀도 공격성 13,14 사이의 상관은, 이러한 결과는 암 세포 액토 마이 오신 수축력 통해 침윤 및 전이를 구동하는 강성 종양 조직에 응답 할 수있는 메커니즘을 제시한다.

시험관 ECM 강성 및 생체 조직 밀도가 암세포의 침습 1,15-17 행동을 조절하는 것으로 나타났다. 액토 마이 오신 수축력이 과정에서 중요하게 나타나는 반면, 전이성 용량이 증가하는 상관 관계 또는 수축력 6,18-20을 감소 여부에 현재 연구 충돌합니다. 또한, 이러한 힘이 직접 invadopodia 활성 여부 (21)를 매개 알려지지 않았다. 우리는 최근에 암 세포의 수축력이 매트릭스 강성에 의존했고, invadopodia 5 ECM 저하의 예측 것을 발견했다. 이러한 결과는 셀룰러 힘 invadopodia 교류를 매개하여 암의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사종양 미세 환경의 기계적 특성에 대응 tivity.

암세포 (5)의 침입 및 수축 특성을 상관하기 위해, 우리는 이전에 의존 강성 invadopodia 4,12,22 활성을 조사하기 위해 사용 된 서로 다른 강성으로 PAAS 생성을위한 프로토콜을 개질. 화학적 PAAS 걸쳐 인간 혈장 피브로넥틴 가교함으로써, 하이드로 겔이 변형 된 세포는 모두 실험 5와 동일한 강성을 경험하도록 invadopodia 및 견인력 분석 모두에 대한 기준으로 이용 될 수있다. invadopodia 내 분석, 피브로넥틴 매트릭스 열화를 검출하기 PAAS에 포개어 ECM을 연결하기위한 젤라틴 천연 결합 도메인을 제공한다. 견인력 내 분석, 피브로넥틴 세포 견인력을 계산하는 데 사용되는 미세 변위를 검출하는 직접적인 세포 부착을위한 리간드를 제공한다. 우리가 하드, 소프트라는 것을이 Methods,정상 및 암 조직 (23)에 대해보고 기계적 특성의 범위에 걸쳐있는 파 5 1023, 7307 및 22692의, 유리 바닥 요리에 바인딩 및 탄성 계수, E가된다 엄격한 PAAS.

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프로토콜

PaaS를위한 유리 Coverslips는 1. 준비

  1. 낮은 린트 물티슈 청소 12mm의 된 커버.
  2. 불꽃 12mm 커버 슬립과 핀셋을 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통해 전달하여 각 35mm의 유리 바닥 접시의 마이크로 웰의 14mm coverslip에.
  3. 실온에서 5 분 동안 0.1 N NaOH를 200 μL로 마이크로 웰 치료.
  4. 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조.
  5. 흄 후드에서 실온에서 10 분 동안 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란의 50 내지 100 μL로 마이크로 웰 치료. 이 화학 물질은 플라스틱과 반응; 따라서, 유리 피펫을 사용하여 플라스틱 접시와의 접촉을 피하기 위해 마이크로 웰 완전히 채워지지 않는다.
  6. 3 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란이 명확해질 때까지 약 10 분 동안 초순수와 마이크로 웰을 세척 할 것.
  7. 초순수 두 번 스퀴즈 병을 사용와 마이크로 웰을 씻어.
  8. 초순수의 2 ml로 마이크로 웰을 세척10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정에 로커 t 실온.
  9. 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조.
  10. 30 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정 로커에 실온에서 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액 2 ㎖와 함께 마이크로 웰 치료.
  11. 10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz에서) 설정 로커에 실온에서 초순수 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 30 분의 총 두 번 더 반복한다.
  12. 30 분 동안 가파른 각도 (60 ° 이상)에서 건조 마이크로 웰.
    참고 : 요리는 데시 케이 터 2 개월 동안 저장할 수 있습니다.

Invadopodia 분석 실험을위한 PaaS를 2. 준비

  1. 소프트 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.05 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 %의 BIS 25 μL, 및 초순수 574 μL (표 1)를 결합한다.
  2. 하드 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.35 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 %의 아크릴 아미드, 175 # 200 μL를 결합181; L ​​2 %의 BIS, 및 초순수 409 μL (표 1).
  3. 강성 PAA (12 % 아크릴 아미드 및 0.60 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 300 μL, 2 % BIS 300 μL, 및 초순수 169 μL (표 1)를 결합한다.
  4. 15 분 동안 용액을 탈기시킨다. 각각, 부드러운 하드, 단단한 PAA 솔루션에 초순수에 1 ㎎ / ㎖ 인간의 플라즈마 피브로넥틴의 200, 215, 230 μl를 추가합니다. 모든 용액의 경우, 10 ㎎ / ㎖ 아크릴산 N 히드 록시 숙신이 미드 (NHS) 에스테르 1 μL, 100 ㎎ / ㎖의 암모늄 퍼 설페이트 5 μL, 및 N, N, N ', N'- 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED 2 μl를 추가 ; 표 1). 부드러운 피펫으로 혼합 및 솔루션에 거품을 만들지 마십시오.

PAA
(1 ml)에 		40 %
AA
(μL) 		2 %
BIS
(μL) 		초순수
물
(μL) 		1 ㎎ / ㎖
FN
(μL) 		10 ㎎ / ㎖
NHS 에스테르
(μL) 		100 ㎎ / ㎖
APS
(μL)
TEMED
(μL) 		탄력있는
계수
(PA)
부드러운 (200) (25) (574) (200) (1) (5) 이 1,023
단단한 (200) (175) (409) (215) (1) (5) 이 7307
엄격한 (300) (300) 169 (230) (1) (5) 이 22692

표 1 : 성분 voluMES 및 invadopodia 분석법에 사용 부드럽고 단단한 경질 PAAS 위해 탄성률 얻어진. AA = 아크릴 아미드, FN은 피브로넥틴, APS는과 황산 암모늄 =를 =.

  1. 각 마이크로 웰의 중심에 PAA 용액 8.48 μL 피펫.
    참고 :이 볼륨은 이론적으로 두께 75 ㎛의 PAA를 산출한다.
  2. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 마이크로 웰의 물방울에에 12mm 커버 슬립의 골조면을 낮 춥니 다.
  3. 샌드위치 PAA 솔루션은 15 ~ 30 분 동안 중합 할 수 있습니다. 남은 솔루션을 확인하여 중합을 확인합니다.
  4. 각각의 접시에 1X PBS 2 ㎖를 추가하고 핀셋으로 12mm 된 커버를 제거합니다.
    참고 : 10 배 PBS는 실험실에서 만들어 0.011 M KH 2 PO 4, 1.54 M의 NaCl, 0.056 M 나 2 HPO 4로 구성되어있다.
  5. 5 분 동안 실온에서 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 세척한다. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.

3. P견인 힘 분석 실험을위한 PaaS를 배상

  1. 소프트 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.05 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 %의 BIS 25 μL, 및 초순수 566 μL (표 2)를 결합한다.
  2. 하드 PAA (8 %의 아크릴 아미드 및 0.35 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 200 μL, 2 % BIS 175 μL, 및 초순수 401 μL (표 2)를 결합한다.
  3. 강성 PAA (12 % 아크릴 아미드 및 0.60 % BIS)의 1 ㎖의 용액의 경우, 40 % 아크릴 아미드 300 μL, 2 % BIS 300 μL, 및 초순수 161 μL (표 2)를 결합한다.
  4. 15 분 동안 용액을 탈기시킨다. 각각, 부드러운 하드, 단단한 PAA 솔루션 1 ㎎ / ㎖ 인간의 플라즈마 피브로넥틴의 200, 215, 230 μl를 추가합니다. 초음파 처리 30 초 200 nm의 적색 형광 마이크로 스피어 (605분의 580 나노 미터의 여기 / 방출)의 8 μL. 각 솔루션의 경우, 200 nm의 적색 형광 마이크로 스피어의 8 μl를 추가10 ㎎ / ㎖ 아크릴산 NHS 에스테르 1 μL, 100 ㎎ / ㎖의 암모늄 퍼 설페이트 5 μL, TEMED 및 (표 2)의 2 μL. 부드러운 피펫으로 혼합 및 솔루션에 거품을 만들지 마십시오.

PAA
(1 ml)에 		40 %
AA
(μL) 		2 %
BIS
(μL) 		초순수
물
(μL) 		1 ㎎ / ㎖
FN
(μL)
마이크로 분야
(μL) 		10 ㎎ / ㎖
NHS 에스테르
(μL) 		100 ㎎ / ㎖
APS
(μL)
TEMED
(μL) 		탄력있는
계수
(PA)
부드러운 (200) (25) (566) (200) 8 (1) (5) 이 1,023
단단한 (200) (175) (401) (215) 8 (1) (5) 이 7307
엄격한 (300) (300) (161) (230) 8 (1) (5) 이 22692

표 2 :. 성분 볼륨과 견인력 세이에 사용 부드럽고 단단한 경질 PAAS 위해 탄성률 얻어진 AA = 아크릴 아미드, FN은 피브로넥틴, APS는과 황산 암모늄 =를 =.

  1. 각 마이크로 웰의 중심에 PAA 용액 8.48 μL 피펫.
    참고 :이 볼륨은 이론적으로 두께 75 ㎛의 PAA를 산출한다.
  2. 조심스럽게 일의 골조 측면을 낮출핀셋을 사용하여 마이크로 웰의 물방울에에 전자 12mm coverslip에.
  3. 샌드위치 PAA 솔루션은 15 ~ 30 분 동안 중합 할 수 있습니다. 남은 솔루션을 확인하여 중합을 확인합니다.
  4. 각각의 접시에 1X PBS 2 ㎖를 추가하고 핀셋으로 12mm 된 커버를 제거합니다.
  5. 5 분 동안 실온에서 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 세척한다. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.

Invadopodia 분석 실험을위한 ECM 4. 준비

  1. 37 ° C에 젤라틴 용액 (1 % 젤라틴 1 % 자당)를 가열한다.
  2. 45 °의 각도로 유리 바닥 요리를 진행할 때 마이크로 웰의 바닥으로부터 신중 흡 인물을 1 분 동안 젤라틴 용액 150 μL로 PAAS 치료.
  3. 60 분 동안 건조를 최적화하기 위해 가파른 각도 (60 ° 이상)에서 마이크로 웰의 PAAS에 젤라틴의 나머지 얇은 층을 건조.
  4. i에서 냉장 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액 2 ㎖와 마이크로 웰 치료30 분 동안 실온에서 15 분 동안이어서 CE.
  5. 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  6. 1 분 동안 수소화 붕소 나트륨 용액 2 ml로 마이크로 웰 치료. 조심스럽게 젤라틴의 표면에 형성하는 거품을 제거하기 위해 벤치에 요리를 누르십시오.
  7. 대기음을 5 분 동안 1X PBS로 2 ㎖ 마이크로 웰을 씻어. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  8. 15 분 동안 4 ° C에서 175,000 XG에 50 μg의의 /의 1X PBS와 ml의 원심 분리기에 FITC 표지 인간의 플라즈마 피브로넥틴 솔루션을 희석. 시판 표시 피브로넥틴를 구입하거나 다음과 같이 레이블 :
    1. 투석 튜브의 보레이트 완충액 (170 mM의 나트륨 테트라 보레이트 40 mM의 염화나트륨)과 장소 10ml에 피브로넥틴 5mg을 녹인다.
    2. 자기 교반기에 실온에서 용해 FITC 6 ㎎을 함유하는 보레이트 완충액 200㎖에 배관을 배치하여 피브로넥틴 레이블어둠 속에서 1.5 시간 동안 가장 낮은 설정에서 설정합니다.
    3. 두 볼륨이 어두운 추운 방 (4 ° C)에서 3 일 동안 가장 낮은 설정으로 설정 자석 교반기에 1X PBS의 500 ml로 투석은 하루 변경됩니다.
    4. (1 : 200) 희석 된 분취 량의 광학 농도에 기초하여 계산 FITC 표지 된 피브로넥틴 농도가 280 nm 내지 493 nm에서의 AS는 [OD 280 - (0.36 X OD 493)] / 1.4 배 (200)의 2 배의 희석 인자는 (있는 계정 ㎎ / ㎖ 단위로 얻어진 다음 단계에서 피브로넥틴 농축 글리세롤) 미국.
    5. 4 ° C에서 하룻밤 어둡고 추운 방에서 가장 낮은 설정으로 설정 자석 교반기 50 % 글리세롤 용액에 하룻밤 투석.)
  9. 어둠 속에서 60 분 동안 실온에서 FITC 표지 된 피브로넥틴 용액 150 ㎕를 마이크로 웰과 치료.
  10. 에서 유리 바닥 요리를 들고 때 조심스럽게 마이크로 웰의 바닥에서 FITC 표지 피브로넥틴 솔루션을 대기음45 ° 각도는 다음 멸균 어두운 세포 배양 후드에서 10 분 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 유리 바닥 접시를 채운다. 또한 유리 바닥 접시 뚜껑을 채우거나 70 % 에탄올에 배어 낮은 보풀 물티슈로 닦아.
  11. 5 분 1X PBS로를 작성하여 바닥이 유리로 요리를 씻으십시오. 15 분 총 1X PBS 2 ㎖와 두 번 더 반복합니다.

Invadopodia 시험 법 5. 준비 및 이미징

  1. (1 DMEM 및 5 %의 낮은 단백질 혈청, 10 % 소 태아 혈청, 및 새롭게 추가 된 표피 성장 인자 20 ng를 / ㎖와 함께 RPMI 1640 1) 유리 바닥 마성 및 invadopodia 배지 2 ㎖로 25,000 암세포 추가 하룻밤 배양한다.
  2. 대기음 세포를 고정을 20 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액 2 ㎖와 함께 마이크로 웰을 처리하고.
  3. 1X PBS 2 ml의 두 빠른 세척 한 후, 방 템피에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액 2 ml로 마이크로 웰을 치료5 분 동안 어둠 속에서 rature는 세포를 Permeabilize 하시려면합니다.
  4. 1X PBS 2 ㎖로 세척 한 후 바로, 3 % 소 혈청 알부민이 60 분을 차단하는 세포에 대한 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액으로 마이크로 웰을 치료.
  5. 60 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액에서 : 마우스 항 cortactin 항체 (750 1) 150 μL와 마이크로 웰을 인큐베이션.
  6. 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  7. (500 1) 및 546 팔로이 딘 (1 : 750) 60 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 차단 용액에 150 ㎕의 염소 항 - 마우스 항체 633 마이크로 웰을 인큐베이션.
  8. 5 분 1X PBS 2 ㎖와 마이크로 웰을 세척 할 것. 15 분의 총 두 번 더 반복한다.
  9. 각각의 마이크로 웰을 작성하여 22 × 22 커버 슬립 커버하는 매체를 장착 여섯 방울을 추가합니다.
  10. 이미지 cortactin과 액틴이 647분의 632 나노 미터의 여기 및 방출 필터를 사용하여 invadopodia을 확인하고570분의 556 nm의, 각각, 와이드 - 필드 도립 현미경 높은 NA, 40X 오일 침지 렌즈를 사용. 마찬가지로, 화상 피브로넥틴 518분의 492 nm 인 여기 및 방출 필터를 사용하여 ECM 분해 동정을 행 하였다.

6. 준비 및 견인 힘 분석 실험의 영상

  1. 유리 바닥 요리에 invadopodia 매체의 2 ㎖에 15,000 암 세포를 추가하고 밤새 배양한다.
  2. 유리 바닥 요리 대기음 매체와 같은 보조제 (5 % 낮은 단백질 혈청, 10 % 소 태아 혈청, 및 새롭게 추가 된 표피 성장 인자 20 ng를 / ㎖), 사전에, L-15 배지 2 ㎖로 대체 37 ° C에 -warmed.
  3. 거꾸로 현미경 1 시간 동안 습도가 높은 37 ° C로 사전 평형에 환경 챔버의 유리 바닥 요리를 품어.
  4. 휴대 전화 위치를 표시하기 위해 높은 NA, 자동화 단계와 넓은 필드 거꾸로 현미경에 40 배 렌즈를 사용하여 이미지의 네 세트를 가지고 :
    1. 에에 이미지 세포위상차 ( "단계"화상)을 사용하여 (P)의 PAAS.
    2. PAAS 상단의 마이크로 스피어의 제 1 층까지 아래 셀 중심으로 약간의 645분의 560 nm의 여기 및 방사 필터를 사용하여 형광 이미지의 초점이 미세하게된다 (화상 "스트레스").
    3. 또한, (마커로서 미소 구체를 사용하여) PAAS의 바닥에 집중하고 ( "바닥"화상)을 화상. 주 :이 이미지의 목적은 대표 결과에 기재된 견인력 계산을위한 각 위치에서의 실제 두께 PAA 얻을 Z 위치를 기록하는 것이다.
    4. 이러한 이미지가 여러 위치에서 획득 한 후, 부드럽게 세포를 제거하기 위해 10 % 트리톤-X 솔루션의 220 μL에 섞는다. 앞서 설명한 ( "널 (null)"이미지) 등의 각 위치에서 PaaS를 상단의 이미지 미소.

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결과

invadopodia 분석에서, invadopodia은 전형적 전지 본체 내의 구조에 점 모양 cortactin 액틴과 같은 마커 (도 1)의 colocalization을함으로써 식별된다. 모두 적극적으로 저하 및 비 분해 invadopodia는 카운트 될 수 있으며, 이러한 구조는 FITC 표지 된 피브로넥틴 (도 1)에 형광 신호가없는, 검은 부분으로 colocalized 여부에 의해 구별된다. Invadopodia 수동 계산하고, 셀당 ECM 분해 수동 셀 내에 윤곽선이 검정색 영역을 임계 화에 의해 결정된다.

견인력 분석에서, 네 개의 이미지가 무대 위치 (그림 2)로 표시 한 각 세포의 위치에 캡처됩니다. 먼저, "상"및 이미지의 관심 대상의 모든 셀이 고려되고 "스트레스". PAA의 "바닥"이미지는 하이드로 겔 두께를 계산...

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토론

우리는 침습적 수축성 셀룰러 동작과 상관시킬 invadopodia 견인력 분석의 기초로서 사용될 수있다 PAAS을 제조하는 방법을 제시한다. PaaS를 오래 세포에 강성 효과를보고 견인력 18,24,27를 계산하는 데 사용되었지만,이 프로토콜은 매트릭스에 대한 응답으로 침략과 수축 세포 행동의 상관 관계를 같은 경직성와 PaaS를 기반으로 병렬 분석을 개발하는 최초 기계적 특성. 제대로 바닥이 유리로 요리 된 커버를 활성화하면 PaaS를 그들에 결합 떨어져 오지 않을 것을 보장한다. 우리가 다른 사람이 과거 4,12,28에 PAAS의 표면에 젤라틴을 바인딩 같은 술포 SANPAH 및 아크릴산 NHS 에스테르 시약에 의존 다하고 있지만, 이들 방법은 피브로넥틴 확실 균일 표면층을 생성하지 않았 음을 발견 . 실시 따라서, 피브로넥틴 아크릴산 NHS 에스테르를 사용하여 매립 PAAS 걸쳐 가교시켰다다른 그룹 (29, 30)에 의해. 그러나, 피브로넥틴의 농도 증가는, 경질...

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공개 사항

이 작품은 상 수 K25CA143412에서 국립 보건원 (NIH)의 국립 암 연구소 (Parekh 씨)에 의해 지원되었다. 우리는 추가 지원이 이비인후과의 부서에서 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

감사의 글

저자가 공개하는 게 없다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-AminopropyltrimethoxysilaneSigma-Aldrich281778
Acrylamide (40%)Bio-Rad161-0140
아크릴산 NHS 에스테르Sigma-AldrichA8060흄 후드에서 신선하게 준비 DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidinLife TechnologiesA22283도 사용할 수 있습니다
.161-07001x PBS
Aqua Poly / MountPolysciences18606를 채우기 위해 6 방울을 사용하십시오
Bio-Rad161-0142
소 혈청 알부민RPIA300751x PBS에서 차단 용액을 위해 3 %를 만들고 4 °에 보관합니다. C
Coverslips (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
투석 튜빙Sigma-AldrichD977715 - 30 분 동안 붕산염 완충액에서 사전 평형
DMEMCellgro10-013-CV사용 invadopodia 매체
DMSOSigma-AldrichD8418아크릴 산 NHS 에스테르 용액을 만드는 데 사용
표피 성장 인자생명 PHG0311
FBSThermo ScientificSH30070.03사용하여 invadopodia 매체
탄올PHARMCO-AAPERE200
을 만드는 데 사용할 수 있습니다.전형적으로 PBS에 있는 1% 자당/1% 젤라틴 해결책의 10 ml를 만들고 4°C에 저장하십시오; C(젤라틴을 쉽게 녹이기 위해 PBS 예열)
유리 바닥 접시(35mm 커버슬립)MatTekP35G-0-14-C커버슬립은 코팅되지 않은
글루타르알데히드(25%)Polysciences01909 0.5%염소
안티 마우스 Alexa Fluor 633 항체Life TechnologiesA21050
인간 플라즈마 피브로넥틴Life Technologies33016-015초순수 5ml를 넣어 1mg/ml를 만듭니다. 과도한 동결 및 해동 주기를 피하기 위한 사용에 따른 부피 분취
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-110x PBS 재고
마우스 항코르tactin 4F11 항체EMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-110x PBS 재고 만들기 위해 사용
NaClRPIS2302010x PBS 스톡 및 붕산염 완충액
NaOH (1 N)Sigma-AldrichS2770초순수로 0.1 N
Nu-Serum (저단백질 혈청)BD Biosciences355500invadopodia 매체
ParaformaldehydeAcros416785000전형적으로 1x PBS에 있는 10% 주식을 만들고, 증기 두건에서 준비하고, 파라포름알데히드를 쉽게 녹이기 위하여 그 후에 강한 HCl)PBS (메마른)를 가진 PH 7.4로 다시 가져오기 위하여 강한 HCl)
PBS (메마른)Cellgro21-040-CV위한 사용 세포 배양
RPMI 1640Cellgro10-040-CV사용을 vadopodia 매체 나트륨
borohydride시그마-알드리치452882증기 두건에서 신선한 1개 mg/ml 1x PBS에 있는
나트륨 메타 붕산염 사수화물시그마 - 알드리치S0251붕산염 완충액을 만드는 데 사용
설탕RPIS24060은일반적으로 PBS에서 1 % 자당 / 1 % 젤라틴 용액 10ml를 만들고 4 °C에 보관합니다. C (젤라틴을 쉽게 녹이기 위하여 PBS를 예열하십시오)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA160461x PBS에 10%의 재고를 만들고 견인력 분석에서 세포 제거를 위해 그대로 사용하거나 염색을 위해 1x PBS로 희석
에서 10mg/ml 은 로다민 과황산 암모늄 Bio-Rad에서 신선한 10 % 용액을 준비하고 마이크로 웰 BIS (2 %)는 기술은 초순수로 70%을 에량 은 를 만드는 데 사용합니다.은 으로 희석합니다.은 를 만드는 데 사용합니다.를 준비하기 위하여은 합니다.

참고문헌

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