종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
리지드 종양 조직 강하게 암 세포 이동 및 침입 조절에 연루되어왔다. 가교 조직을 통해 침략 마이그레이션은 단백질 가수 분해 세포 외 기질 (ECM)을 저하 invadopodia라는 굴지의 풍부한 돌출부에 의해 촉진된다. Invadopodia 활성은 강성 신호 액토 마이 오신 수축력을 통하여 이러한 세포 내 구조를 조절할 수 있음을 시사 ECM 강성 암세포 수축력에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 암세포의 침윤성 및 수축 특성은 서로 다른 강성의 폴리 아크릴 아마이드 젤 (PAAS)에 기초 invadopodia 및 견인력 세이를 이용하여 시험 관내에서 상관 될 수있다. 두 분석 사이에 변동이 존재하지만, 여기에 제시된 프로토콜 번째 PAAS를 만들기위한 방법을 제공한다AT는 두 분석에서 쉽게 사용될 사용자의 특정 생물학적 및 기술적 요구에 적응할 수있다.
서론
종양 관련 ECM의 강성 액토 마이 오신의 수축성 1-3을 증가시켜 악성 동작을 운전에 중요한 요소로 확인되었습니다. 이 효과는 주로 유방암 세포로 입증되었지만, 매트릭스 강성 암의 다른 유형에 중요한 역할을 할 수 있음 종양 강성을 제안 암 4-8 다양한 유래의 세포의 침입 특성을 변경하는 것으로 밝혀졌다. 침습성 마이그레이션 중 가교 결합 조직을 관통하도록, 암세포는 국소 적 ECM 9 저하 테이나 지역화 invadopodia라고도 액틴 풍부한 접착제 돌출부들을 이용한다. Invadopodia 침략 세포의 특징으로 간주되며 암세포 침윤 및 전이 10,11에 연루되어있다. 이전 작업은 매트릭스 강성이 invadopodia 번호를 조절할 수있는 것으로 나타과 미오신 II 활동과 mechanosensitive 단백질 (12)를 통해 ECM 저하 4,12 관련 지을 수 있고 있습니다. 주어진종양 및 암 밀도 공격성 13,14 사이의 상관은, 이러한 결과는 암 세포 액토 마이 오신 수축력 통해 침윤 및 전이를 구동하는 강성 종양 조직에 응답 할 수있는 메커니즘을 제시한다.
시험관
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프로토콜
PaaS를위한 유리 Coverslips는 1. 준비
- 낮은 린트 물티슈 청소 12mm의 된 커버.
- 불꽃 12mm 커버 슬립과 핀셋을 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통해 전달하여 각 35mm의 유리 바닥 접시의 마이크로 웰의 14mm coverslip에.
- 실온에서 5 분 동안 0.1 N NaOH를 200 μL로 마이크로 웰 치료.
- 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조.
- 흄 후드에서 실온에서 10 분 동안 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란의 50 내지 100 μL로 마이크로 웰 치료. 이 화학 물질은 플라스틱과 반응; 따라서, 유리 피펫을 사용하여 플라스틱 접시와의 접촉을 피하기 위해 마이크로 웰 완전히 채워지지 않는다.
- 3 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란이 명확해질 때까지 약 10 분 동안 초순수와 마이크로 웰을 세척 할 것.
- 초순수 두 번 스퀴즈 병을 사용와 마이크로 웰을 씻어.
- 초순수의 2 ml로 마이크로 웰을 세척10 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정에 로커 t 실온.
- 공기 대기음을 30 분 동안 마이크로 웰을 건조.
- 30 분 동안 중간 속도 (~ 1 Hz로) 설정 로커에 실온에서 0.5....
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결과
invadopodia 분석에서, invadopodia은 전형적 전지 본체 내의 구조에 점 모양 cortactin 액틴과 같은 마커 (도 1)의 colocalization을함으로써 식별된다. 모두 적극적으로 저하 및 비 분해 invadopodia는 카운트 될 수 있으며, 이러한 구조는 FITC 표지 된 피브로넥틴 (도 1)에 형광 신호가없는, 검은 부분으로 colocalized 여부에 의해 구별된다. Invadopodia 수동 계산하고, 셀당 ECM 분해 수동 셀 내에 윤곽선이 검정색 영역을 임계 화에 의해 결정된다.
견인력 분석에서, 네 개의 이미지가 무대 위치 (그림 2)로 표시 한 각 세포의 위치에 캡처됩니다. 먼저, "상"및 이미지의 관심 대상의 모든 셀이 고려되고 "스트레스". PAA의 "바닥"이미지는 하이드로 겔 두께를 계산.......
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토론
우리는 침습적 수축성 셀룰러 동작과 상관시킬 invadopodia 견인력 분석의 기초로서 사용될 수있다 PAAS을 제조하는 방법을 제시한다. PaaS를 오래 세포에 강성 효과를보고 견인력 18,24,27를 계산하는 데 사용되었지만,이 프로토콜은 매트릭스에 대한 응답으로 침략과 수축 세포 행동의 상관 관계를 같은 경직성와 PaaS를 기반으로 병렬 분석을 개발하는 최초 기계적 특성. 제대로 바닥이 유리로 요리 된 커버를 활성화하면 PaaS를 그들에 결합 떨어져 오지 않을 것을 보장한다. 우리가 다른 사람이 과거 4,12,28에 PAAS의 표면에 젤라틴을 바인딩 같은 술포 SANPAH 및 아크릴산 NHS 에스테르 시약에 의존 다하고 있지만, 이들 방법은 피브로넥틴 확실 균일 표면층을 생성하지 않았 음을 발견 . 실시 따라서, 피브로넥틴 아크릴산 NHS 에스테르를 사용하여 매립 PAAS 걸쳐 가교시켰다다른 그룹 (29, 30)에 의해. 그러나, 피브로넥틴의 농도 증가는, 경질.......
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공개 사항
이 작품은 상 수 K25CA143412에서 국립 보건원 (NIH)의 국립 암 연구소 (Parekh 씨)에 의해 지원되었다. 우리는 추가 지원이 이비인후과의 부서에서 제공 한 것을 인정하고 싶습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
감사의 글
저자가 공개하는 게 없다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Acrylamide (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 아크릴산 NHS 에스테르 | Sigma-Aldrich | A8060 | 흄 후드에서 신선하게 준비 DMSO |
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Life Technologies | A22283 | 도 사용할 수 있습니다 |
| . | 161-0700 | 1x PBS | |
| Aqua Poly / Mount | Polysciences | 18606 | 를 채우기 위해 6 방울을 사용하십시오 |
| Bio-Rad | 161-0142 | ||
| 소 혈청 알부민 | RPI | A30075 | 1x PBS에서 차단 용액을 위해 3 %를 만들고 4 °에 보관합니다. C |
| Coverslips (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| 투석 튜빙 | Sigma-Aldrich | D9777 | 15 - 30 분 동안 붕산염 완충액에서 사전 평형 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | 사용 invadopodia 매체 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 아크릴 산 NHS 에스테르 용액을 만드는 데 사용 |
| 표피 성장 인자 | 생명 | PHG0311 | |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | 사용하여 invadopodia 매체 |
| 탄올 | PHARMCO-AAPER | E200 | |
| 을 만드는 데 사용할 수 있습니다.전형적으로 PBS에 있는 1% 자당/1% 젤라틴 해결책의 10 ml를 만들고 4°C에 저장하십시오; C(젤라틴을 쉽게 녹이기 위해 PBS 예열) | |||
| 유리 바닥 접시(35mm 커버슬립) | MatTek | P35G-0-14-C | 커버슬립은 코팅되지 않은 |
| 글루타르알데히드(25%) | Polysciences | 01909 0.5 | %염소 |
| 안티 마우스 Alexa Fluor 633 항체 | Life Technologies | A21050 | |
| 인간 플라즈마 피브로넥틴 | Life Technologies | 33016-015 | 초순수 5ml를 넣어 1mg/ml를 만듭니다. 과도한 동결 및 해동 주기를 피하기 위한 사용에 따른 부피 분취 |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | 10x PBS 재고 |
| 마우스 항코르tactin 4F11 항체 | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | 10x PBS 재고 만들기 위해 사용 |
| NaCl | RPI | S23020 | 10x PBS 스톡 및 붕산염 완충액 |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | 초순수로 0.1 N |
| Nu-Serum (저단백질 혈청) | BD Biosciences | 355500 | invadopodia 매체 |
| Paraformaldehyde | Acros | 416785000 | 전형적으로 1x PBS에 있는 10% 주식을 만들고, 증기 두건에서 준비하고, 파라포름알데히드를 쉽게 녹이기 위하여 그 후에 강한 HCl)PBS (메마른)를 가진 PH 7.4로 다시 가져오기 위하여 강한 HCl) |
| PBS (메마른) | Cellgro | 21-040-CV | 위한 사용 세포 배양 |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | 사용을 vadopodia 매체 나트륨 |
| borohydride | 시그마-알드리치 | 452882 | 증기 두건에서 신선한 1개 mg/ml 1x PBS에 있는 |
| 나트륨 메타 붕산염 사수화물 | 시그마 - 알드리치 | S0251 | 붕산염 완충액을 만드는 데 사용 |
| 설탕 | RPI | S24060은 | 일반적으로 PBS에서 1 % 자당 / 1 % 젤라틴 용액 10ml를 만들고 4 °C에 보관합니다. C (젤라틴을 쉽게 녹이기 위하여 PBS를 예열하십시오) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | 1x PBS에 10%의 재고를 만들고 견인력 분석에서 세포 제거를 위해 그대로 사용하거나 염색을 위해 1x PBS로 희석 |
참고문헌
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
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재인쇄 및 허가
