화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

요약

여기에서는 발아 효모에서 화학적-유전적 상호 작용을 정의하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 효모 분자 생물학의 기본 기술을 기반으로 하며 중소 규모의 화학 물질 및 기타 매체 환경에 대한 기계론적 조사에 매우 적합합니다.

초록

생리 활성 화학 물질의 작용 모드를 결정하는 학술, 제약의 넓은 범위에 관심, 산업 과학자이다. 사카로 미세스 세 레비 시아, 또는 신진 효모, 모델 진핵 생물이되는 ~ 6,000 유전자 삭제 돌연변이 hypomorphic 필수 유전자의 전체 모음 돌연변이 체는 시판되고있다. 이러한 돌연변이의 수집 체계적 화학 견딜 필요 유전자 화학적 상호 작용, 즉 유전자를 검출하는데 사용될 수있다. 이 정보는, 차례대로, 화합물의 작용 가능성 모드에보고한다. 여기에서 우리는 효모 신진 화학 - 유전자 상호 작용의 신속한 식별을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액션의 잘 정의 된 메커니즘이 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)을 사용하는 방법을 보여준다. 우리의 결과는 핵 TRAMP가 엑소 및 DNA 복구 효소 이전 m과 일관성이 5-FU의 존재하에 증식에 필요한 RNA 보여기반 바 코딩 화학 유전 적 접근과 5-FU에 악영향을 모두 RNA 및 DNA 신진 대사에 영향을 미치는 것을 지식을 icroarray. 이러한 높은 처리량 스크린 필요한 검증 프로토콜은 또한 기술된다.

서론

유전 도구와 모델 생물 사카로 미세스 세 레비 시아에 이용 가능한 자원 일괄 유전자 네트워크 생물학적 시스템의 요구 사항을 이행하는 방법으로서 기능에 대한 새로운 통찰력을 제공 대규모 기능 유전체학 연구있게되었다. 이러한 도구의 초석은 효모 ^{1, 2의} 모든 열려있는 독서 프레임의 비 필수 유전자 결실의 완전한 세트의 공동 제작했다. 눈에 띄는 관찰 표준 실험실 조건에서 haploids로 성장하면 효모의 유전자 만 ~ 20 %가 생존에 필요한 것이 었습니다. 이것은 다른 생물학적 경로의 이용을 통해 게놈 섭동에 대하여 버퍼링 세포의 능력을 강조한다. 유전 개별적으로 가능한 있습니다 돌연변이하지만 조합에 치명적인는 연결 또는 수렴 병렬 생물학적 경로를 신호 및 생물학적 기능을 설명하는 유전자 상호 작용 네트워크를 형성한다. 조건부 TE의 발전과 함께필수 유전자의 mperature에 민감하고 hypomorphic 대립이 기술은 중요하지 않은 유전자 ^3,4의 연구에 국한되지 않았습니다. 이 개념은 유사한 세포 과정에 관여하는 유전자 ^(5)가 함께 클러스터링 방법을 설명하는 편견 유전자 상호 작용지도를 생산하는 게놈 규모로 적용되었습니다.

유전자 네트워크의 화학 교란 모방 ....

프로토콜

참고 :이 절차의 일반적인 작업은 그림 2에 설명되어 있습니다.

성장 억제 용량 1. 결정

1. 효모 하룻밤 문화의 준비
   참고 :이 프로토콜에 사용되는 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스 성장 미디어 (YEPD)는 표준 조리법 ^(13)이다.
   1. BY4741 (마타 HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) YEPD 한천 접시에 세포 밖으로 행진 30 ° C 또는 볼 식민지 형성 할 때까지 48 시간 동안 배양한다.
   2. 하나의 식민지로 무균 배양 용기에 YEPD 액체 매체의 5 mL를 접종하여 하룻밤 문화를 준비합니다. 연속 회전이나 진탕 30 ° C에서 밤새 품어. 문화는 일반적으로 아침 (~ 2 × 10 ⁸ 세포 / ㎖)에 의해 포화에 도달 할 것입니다.
2. 고체 한천 매체 준비 다양한 화학 용량을 포함
   1. 여러 주식을 준비화학 물질은 적당한 용매 100X 원하는 최종 농도에서 시험한다.
      참고 : 유효 농도는 화학 물질에 따라 달라집니다, 그리고 경험적으로 결정해야합니다. 높은 mM의 낮은 μM에서, 즉, 그것....

결과

이 방법의 유효성으로서 우리는 위에서 설명한 프로토콜은 다음 화학 요법 제 5- 플루오로 우라실 (5-FU)의 대표적인 화학적 상호 작용 유전자 스크린을 수행 하였다. 5-FU는 티미 신타뿐만 아니라 DNA와 RNA 대사 ^(18)을 방해하는 것으로 알려져있다. 5-FU의 화학적 유전 적 상호 작용은 공부 잘하고 이질 동형 접합 삭제 컬렉션 ^8,19를 모두 사용하여 효모 바코드 마이크로 어레이 기술에 의해 조사되었다. 여기서 우리는 유사한 결과가 돌연변이 콜로니 크기의 정량 비교함으로써 얻어 질 수 있음을 보여준다.

그것은 수행 화면 비 필수 유전자의 결실 반수성 컬렉션을 이용하는 것을 유의해야한다. 이 유형의 스크린은 또한 필수 유전자 돌연변이의 포함을 허용 이배체 균주, 온도에 민감한 돌연변이 및 hypomorphic 대립 유전자를 사용하여 수행 될 수있다. 반수체 삭제 컬렉션을 활용 장점 중 하나는 약물 센스티브을 증가목표 경로의 성.......

토론

화학적 상호 작용 유전자 프로파일을 생성하기위한 방법이 여기에 설명했다. 방법은 간단하다 화학의 유무에 광범위한 유전자 결실 컬렉션 각 균주의 콜로니 크기를 비교하여, 화학적 내성 모독에 필요한 모든 유전자들은 식별된다. 민감한 균주의 결과 목록의 주석 농축 분석은 화학 물질의 작용 모드에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 효모 신진 위해 최적화되어 있지만, 이는 또한 다른 배열 된 E. 미생물 삭제 모음과 함께 사용하도록 적응 될 수있다 휴대 교란의 ^{(26, 27)의} 수백을 조사하기 위해 성공적으로 사용 된 대장균 게이오 컬렉션입니다.

효모 및 기타 생물 화학 - 유전 적 프로파일 링은 잘 확립되어있다. 이러한 연구의 대부분은 마이크로 어레이 분석 또는 높은 처리량 sequ 통해 결실 돌연변이 체를 풀링 재배 적 경쟁 분석법에 의존고유 한 유전자 바코드의 encing. 이 방법은 큰 화학 라이브러리.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
효모 추출물	BioBasic	G0961	YEPD 액체/고체 매체의 경우 1% 최종 농도에 추가(w/v)
티르톤 분말	BD Biosciences	211820	YEPD 액체/고체 매체의 경우 2% 최종 농도에 추가(w/v)
포도당	아나케미아	31096-380	YEPD 액체/고체 매체의 경우 2% 최종 농도(w/v) —에 추가합니다. 오토클레이브하지 마십시오. 20% 원액을 준비하고, 여과 살균하고, 오토클레이빙 후 매체에 첨가합니다.
Agar A	Bio Basic	FB0010	YEPD 고체 매체 용 2 % 최종 농도 (w / v)
G418	AG Scientific Inc.	G-1033	200  dH2O의 mg/ml 및 필터 살균.
12-웰 플레이트	Greiner Bio One	655180
5 ml 배양 튜브	Evergreen Scientific	222-2376-080
10 cm 페트리 디쉬	VWR	25384-302
ROTOR HDA	싱어 인스트루먼트	ROT-001	고처리량 미생물 어레이 피닝 로봇
PLUSPLATE© 페트리 디쉬	싱어 악기	PLU-001	200 접시
상자 384 Short-Pin RePad	싱어 악기	RP-MP-384	1,000 패드 상자
1536 짧은 핀 RePad	싱어 악기	RP-MP-1536	1,000 패드
대체 고정 도구:
완전 자동화된 Robtic 시스템	S& P 로봇 공학	http://www.sprobotics.com	여러 자동 식민지 처리 로비틱 및 상상 시스템을 사용할 수 있습니다.
수동 고정 도구	V& P Scientific	http://www.vp-scientific.com	휴대용 복제 도구 및 액세서리.

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