방법 논문

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

DOI:

10.3791/52351

⸱

2015년 1월 10일

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최적화된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 생체 외 분석을 사용하여 가연성 담배 제품 제제가 수용체 매개 세포 내 분비 사이토카인과 효과기 PBMC의 세포 용해 능력을 현저하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 이러한 신속한 분석은 제품 평가 및 담배 노출의 잠재적인 장기 영향을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

초록

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다른 병리 생리 학적 변화 중, 담배 연기 만성 노출은 미생물 감염 및 종양 발생률 흡연자의 감수성 증가로 연결되었다 염증 및 면역 억제를 야기한다. 생체 내 인간 말초 혈 단핵 세포에서 수용체 - 매개 면역 반응의 억제 (한 PBMC) 연기 성분으로 처리하는 메커니즘을 연구 및 담배 제품에 대한 노출 가능성이있는 장기 효과를 평가하는 매력적인 방법이다. 여기서 우리는 박테리아 리포 폴리 사카 라이드, 수신자 같은 수용체 4 리간드에 의해 자극 된 PBMC를 사용하여 생체 분석을 수행하는 방법을 최적화. 전체 연기 된 배지 (WS-CM)의 효과는, 가연성 담배 제품 준비 (TPP), 니코틴은 생체 분석에 PBMC를하여 사이토 카인 분비와 표적 세포 사멸에 조사 하였다. 우리는 그 표시 분비 사이토킨 IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8, 사이토 카인의 세포 내 IFN-47 ;, TNF-α 및 MIP-1α는 WS-CM-노출 PBMC를 억제했다. K562의 표적 세포 살해 분석으로 산출 된 PBMC의 효과기 세포 용해 기능은 또한 WS-CM에 노출 감소; 니코틴은 이러한 분석에 최소한의 효과적이었다. 요약하면, 우리는 생체 내 분석의 TPP를 효과를 평가하기 위해 개선 된 분석법의 세트를 제공하고,이 방법은 용이하게 다른 관심있는 제품을 테스트하도록 구성 될 수있다.

서론

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심혈관 질환 (CVD), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 암 1,2- 포함한 만성 흡연의 건강에 미치는 악영향에 기술 점의 실질적인 몸체. 만성 흡연은 염증과 면역 억제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 변화는 흡연자 3 미생물 감염과 암의 위험 증가에 기여할 것으로보고되고있다. 생체 외 및 생체 기술이 유용의 병태 생리 학적 효과의 분자 기초를 해명에 담배 연기 4-9 (표 1)과 각종 담배 제품 (10, 11)의 새로운 규정을 안내하기위한 중요한 도구로 인식된다.

예를 들어, 우리는 전체 연기 된 배지 (WS-CM) 및 총 입자상 물질 (TPM) 등의 가연성 담배 제품 준비 (TPP를)이 훨씬 더 독성과 손상에 있음을 증명하고있다불연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)보다 DNA. 게시 된 작업과 일치, 그것은 최근에 가연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)이보고되었다. 게시 된 작업과 일치, 우리는 최근 가연성 TPP를 표시 한 면역 억제의 원인이 보도했다. 이것은 수용체 (TLR) -ligands 같은 톨의 억제에 의해 입증 된, 생체 모델 (14)에 한 PBMC에 의해 살해 (K562) 사이토 카인 분비를 자극, 세포를 대상으로. 흡연 - 유도 된 질병 과정에서 염증의 중요성을 감안하면, 담배 연기의 면역 조절 성 효과를 평가하기위한 분석 조건의 추가적인 최적화는 본 조사된다.

생체 외 분석은 일반적으로 세포 내 사이토 카인을 측정뿐만 아니라 분석 죽이고 14 K562 세포 내에서 세포 독성 T 세포 및 NK 세포 용해 기능을 분비. 분석은 WS-CM 및 니코틴과 PBMC의 후속 자극과 사전 배양을 포함TLR와 S 3 일에 걸쳐 주작 동근; 최종 판독은 효소 면역 분석법 (ELISA를)를 사용하여 및 / 또는 유동 세포 계측법으로 수행된다. 우리는 TLR-4 수용체에 결합하고,이 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 및 사이토 카인 분비의 자극의 결과로 생산 세균 지질 다당류 (LPS)를 이용했다. 단리 한 PBMC, 세포 사멸 분석, 및 IL-8을 정량 TPP를 우리 또한 본 방법의 면역 조절 효과를 평가하기위한 각종 분석 단계의 최적화 외에. 이러한 방법은 다른 연구 문제를 해결하기 위해 적용 및 추가 규제 맥락에서 담배 제품을 평가하기 위해 정제 할 수있다.

표 1. 체외의 보고서를 간행하고 생체 방법은 담배 제품의 준비 varilus 병태 생리 학적 효과를 연구하는 데 사용 CS, 담배 연기 매체.; CSC, 담배 연기 응축; CSE, 담배 연기 추출물; ELISA, 면역 분석을 효소는 링크; GADPH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소; qPCR을 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응; RT, 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응; TS, 담배 연기.

저자 (연구 년) Laan의 등 알. (2004) 무디 등 알. (2004) Oltmanns 등 알. (2005) Vayssier (1998) Witherden 등 알. (2004) Birrell 등 알. (2008)
세포는 사용 인간 기관지 내피 세포 (BEAS-2B), 인간 호중구 인간의 폐포 상피 세포 (A549) 인간기도 평활근 세포 (HASMC) premonocytic 인간 U937 세포, 인간 단핵 폐포 유형 II 상피 세포 (ATII) 인간 단핵구세포주 (THP-1), 인간 폐 식세포
TPP 사용 CSE CSC CSE TS CSE CS
방법 사용 ELISA, qPCR에, 마이그레이션, 전기차 이동 Immunohisto - 화학, 전기, Arrayscan 키트, RT-PCR, ELISA ELISA, RT-PCR, qPCR에, 전기 영동 젤 이동성 변화 광학 현미경, 전자 현미경, 전기, ELISA qPCR에, ELISA, E-toxate 키트 (시그마), P65 플레이트 분석 (TransAM), 전기 영동, 다양한 면역 키트
측정 IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, 마이그레이션 히스톤 아세틸 트랜스퍼, 히스톤 아세틸 라제, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, 에오 열 충격 / 스트레스 단백질 (HSP / 인 Hsp70), HF 전사 인자, NF-κB,TNF-α 계면 활성제 단백질 (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK 인산화 cJUN : DNA 결합, 글루타티온, P65 : DNA 결합
최종 결과 CSE는 AP-1 활성의 억제를 통해 사이토 카인 생성을 하향 조절한다. H 2 O 2와 CSC는 차별적으로, 히스톤 탈 아세틸 화 효소의 활성을 감소, 히스톤 단백질의 아세틸 화를 강화 염증성 사이토 카인의 방출을 조절한다. 담배 연기는 담배 연기에 의해 TNF-α, 20 % CSE 이하 IL-8 릴리스, 에오 탁신의 억제 및 RANTES에 의해 강화 HASMC에서 IL-8의 출시를 일으킬 수 있습니다. TS는 인 Hsp70 과발현 및 활동과 TNF-α 자료를 결합 NFkB의 억제와 관련이 HF 전사 인자를 활성화. 감소 ATII 세포 유래 케모카인 수준의 타협 alveoLAR 수리, 담배 연기에 의한 폐포 손상과 폐기종에 기여. 데이터는 왜 흡연자가 증가 호흡기 감염에 대한 기계적인 설명을 제공합니다. 선천성 반응 억제는 IL-8의 증가를 수반한다.

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프로토콜

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참고 : 동의서 본 연구를 수행 할 수는 좋은 임상 사례 당, IRB 승인에 따라 지역 임상 연구 단위에서 얻었다. 피 처리는 다른 PBMC를 세포 배양 실험의 분리 미생물 살균 용품 및 시약을 사용하여, 멸균 조건 하에서 수행된다.

1. WS-CM 준비

  1. 이전 12 설명 된대로 WS-CM을 생성합니다.
    1. 35-60-2, 용액에 퍼프 볼륨 초에 퍼프 간격, 퍼프 기간 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 다음과 같은 금연 요법을 사용하여 페놀 레드없이 1640 매체를 통해 네 3R4F 참조 담배에서 연기를 전달하여 WS-CM을 준비 각각 초에. 각각의 혼합물은 20 ml의 샘플을 생성합니다.
  2. 날짜, 완료 시간, 담배 이름과 번호와 레이블 튜브 (들). -80 °에서 500 ㎕를 분주 즉시 흡연이 완료된 후에 C 보관하십시오.
  3. 냉동 WS의 분취 량을 분석앞서 설명한 바와 같이 12-㎝ 니코틴, 담배 특이 니트로사민, 다환 방향족 탄화수소의 농도를 결정한다.

PBMC를 2. 분리

  1. (담배 제품이 아닌 소비자 있습니다) 건강한 기증자로부터 신선한 혈액을 수집 웨이크 포레스트 침례 건강 IRB (15)는 별도의 승인에 따라 아래와 같이 신선한 혈액에서 PBMC를을 분리합니다.
    1. 혈액 가방의 도착 이전에, 500ml의 병, 가위, 분리 버퍼, 그리고 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) (RT) 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2) 세포 배양 후드에서 준비를해야합니다. 격리 버퍼 빛으로부터 보호되어야한다.
    2. 거꾸로 혈액 가방을 잡고 그냥이 튜브의 최소 3cm를 떠나 고정 된 경우 아래의 튜브를 잘라.
    3. 500㎖의 병 뚜껑을 제거하고 병 구멍 위의 튜브를 개최합니다. 혈액 가방을 들고 피가 t에 가방에서 자유롭게 흐를 수 있도록하는 데 반전가방이 비어있을 때까지 그는 병입니다. 피가 거품을 만들지 않도록 똑바로 아래로 대 병의 내부 벽에 흐르게.
    4. 혈액에 격리 버퍼의 5 비율 : 1의 병에 격리 버퍼를 따르십시오. 엔드 오버 엔드, 10 배, 단단히 병을 씌우고 조심스럽게 반전. 실온에서 1 시간 동안, 조명 오프 배양 세포 배양 후드에서 병을 둡니다.
    5. 라이트, 밀짚 색의 층은 혈액 위에 구축됩니다. 50 ML 원뿔 튜브에 25 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여이 레이어를 제거합니다. 혈액을 기증 피사체에 따라, 300 ml의 - 수집 된 금액은 50 다를 수 있습니다.
    6. RT에서 10 분 동안 200 XG에서 튜브를 원심 분리기.
    7. 어두운 혈액 색의 펠렛을 떠나, 반투명 뜨는을 대기음. 펠렛이 느슨하지만 점성이 될 것입니다.
    8. 피펫 15ml의 원뿔형 튜브에 차단 완충액 3 ㎖.
    9. 재현 탁 펠렛까지의 수집 담황색 액체의 모든 50 ㎖에 대한 DPBS 20 ㎖를 추가2.1.5 TEP. 소용돌이는 철저하게 혼합, 여러 관에서 재현 탁 액체를 통합합니다. 이 액체는 혈액 세포를 일시 중지 포함되어 있습니다.
    10. 전달 피펫, 단계 2.1.8에서 분리 완충액 3ml를 상 전사 현탁 혈구 5 mL를 가진. 두 개의 레이어를 만들 천천히 조심스럽게 세포 현탁액을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브를 기울입니다. 최소한의 가속 및 브레이크없이 실온에서 40 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기.
    11. 50 ML 원뿔 튜브로 된 PBMC를 포함하는 결과 흐린 중간 계층 (버피 코트)를 제거하기 위해 전송 피펫을 사용합니다. 그 아래에 다른 명확한 그리기 계층 마십시오. 각 50 ML 원뿔 관에 25 개 미만 mL로 전송합니다.
    12. 세포를 씻어 (50 ML 원뿔 튜브의 전체 잔량을 채우기 위해 또는 그 이상)의 차가운 버퍼의 25 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기.
    13. 유동 완충액 10 ml로 펠렛을 재현 탁. 이 PBMC를 포함되어 있습니다. 세포를 세어 메신저를 사용당하지 나 장소를 동결 얼음에.

3. 냉동과 PBMC를 녹고

  1. 원심 분리기 400 x g에서 10 분 동안 단계 2.1.13에서 수집 한 PBMC는.
  2. 제조업체의 지침에 따라 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너를 입력합니다. 주의 : 이소 프로필 알코올은 가연성 및 급성 독성.
  3. 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (39 °의 C)와 펠렛을 재현 탁. 이 동결 RPMI 1640 배지이다. 약 5 × 107 세포 / ㎖를 갖는 현탁액을 초래할 것이다 매체 동결 양 펠렛을 재현 탁. 동결 가능한 세포의 수는 달라진다.
  4. 2 ML의 cryotubes에 세포 현탁액 1 ml의 분량을 분배하고 냉동 컨테이너 cryotubes를 배치합니다. O / N를 저장하고 cryotubes를 제​​거하고에 저장 전송 -80 ° C에서 냉동실에 cryotubes와 냉동 컨테이너를 배치-190 ° C -150 ° C 사이의 극저온 냉동기.
  5. 극저온 저장 부로부터 cryotube을 제거하고 37 ℃ 수조에서 교반과 함께 급속 해동.
  6. 즉시 10 % FBS, 1 % 펜 / 연쇄상 구균과 1 % L- 글루타민을 함유하는 10 ml의 RPMI 1640 완전 배지 (4 ° C)와 15 ML 원뿔 튜브에 cryotube에서 해동 한 PBMC를 전송합니다. 해동 cryotube의 내용은 최대 세포 생존 (15)을 얻기 위해 가능한 한 빨리 전송 될 것이다.
  7. 10 분 동안 400 XG에서 PBMC를 원심 분리기.
  8. 5 ㎖의 RPMI 1640 배지로 완전한 펠렛을 재현 탁하고 세포를 카운트.
  9. 이러한 트리 판 블루 배제 방법으로 확립 된 방법으로 세포 생존 능력을 측정합니다. 95 % - 일반적으로이 방법으로 세포 생존율은 약 90이다. PBMC를 이제 실험에 사용 준비가 된 것입니다.

4. 세포 사멸 결정

참고 : 여기에 나열된 희석이 스​​투의 목적을 위해입니다DY. 희석 따라 변경 될 수 있습니다.

  1. 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석 / 웰, 이하 나타낸 바와 같이.
  2. 다음 농도에 WS-CM 희석 : 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM에서 니코틴 함량을 기준으로) 등차 니코틴 단위의 2.5, 3, 4, 및 5 ㎍ / ㎖의 12.
  3. 다음 농도로 RPMI 배지에서 니코틴 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다.
  4. 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
  5. 이 연구의 목적으로, 전술 한 바와 같이 두 세트의 플레이트를 준비한다. 판을 덮고 24 시간, 37 ℃에서 3 시간, 5 % CO 2에 대한 하나의 판에 대해 하나의 판을 배양한다. 필요에 따라 시점을 조정합니다.
  6. 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 씻고 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
  7. / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7 aminoactinomycin의 D (7AAD)의 5 μL 다음 버퍼를 실행하는 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
  8. 클러스터 튜브에 버퍼를 실행 100 μl를 추가합니다. 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 계측기에 샘플을 획득.
  9. 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 세포의 비율을 결정한다.

5. EC 50 결정

  1. WS-CM과 니코틴의 EC (50) 값은 한 PBMC의 7AAD 양성 염색에 의해 결정됩니다.
  2. EC (50) 값은 진한로 정의된다entration되는 세포의 50 %는 24 시간 분석에서 더 이상 없었다 가능한 한 값은 등차 니코틴 단위 / ㎖ μg의로서 표현된다.
  3. 이 연구의 목적으로, EC (50)의 값은 각각, WS-CM 및 니코틴 1.56 ㎍ / ml 내지 1650 ㎍ / ㎖의 것으로 결정되었다.

6. 분비 된 사이토 카인

참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다.

  1. / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희​​석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의.
  2. 다음 니코틴 농도를 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / ㎖의. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다.
  3. 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다.셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
  4. 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어.
  5. 3 분 300 XG에 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 마지막으로 얼음 차가운 200 μL 버퍼를 실행하고 세척 단계를 한 번 더 반복과 세포를 일시 중단하여 실온에서 세포를 씻으십시오.
  6. RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
  7. 각 웰에 10 ㎍ / ml의 LPS 매체의 200 μl를 추가합니다.
  8. 커버 플레이트 및 4 시간, 24 시간, 48 시간, 또는 37 ° C에서 72 시간 5 % CO 2 동안 품어. 필요에 따라 배양 시간을 조정합니다.
  9. 3 분 동안 300 × g에서 접시를 원심 분리기.
  10. 7 단계와 8 단계의 분석을 수행하기 위해 -80 ° C에서 냉동실에 잘 각각의 저장소에서 상층 액 175 μl를 가져 가라.

7. 세포 측정 비드 어레이 분석

  1. CBA 분석에서 6.10 및 사용 단계에서 제조 세포 상층 액을 해동. 제조업체의 지침에 따라 세포 측정 비드 어레이 (CBA) 분석을 수행합니다.

8. IL-8 ELISA

  1. IL-8 ELISA 단계 6.10 및 사용으로부터 세포 상층 액을 녹여. 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 수행합니다.

9. 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법

참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다.

  1. / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희​​석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의.
  2. 동일한 플레이트에서 다음 니코틴 농도를 희석 : 2, 10, 50, 100, 500, 2000 및 4000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 해저드입니다DOUS.
  3. / 잘 1 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완전 배지에 현탁 PBMC를 100 μl를 추가합니다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
  4. 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어.
  5. 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리 한 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 세척하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
  6. 판에 RPMI 완료 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
  7. RPMI 전체 매체를 사용하여 2 μL / ㎖ GolgiPlug의 작업 농도가 10 ㎍ / ml의 LPS를 준비하고 각 웰에 200 μl를 추가합니다.
  8. 37 ° C에서 6 시간, 5 % CO 2 판을 품어.
  9. 단계 9.8의 끝에서, 버퍼 (39 °의 C)를 실행하고 (300)에서 회전하여 세포를 씻어4 ℃에서 3 분 XG.
  10. 각 웰에 Cytofix 100 μl를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 품어.
  11. 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 1 배 Permwash (4 ° C에서)와 단계 9.9에 설명 된대로 세포를 제거하는 과정을 3 회 반복한다.
  12. 에 다음 항체의 하나의 각 5 μL 각 아니라 다음에 45 μL 1X Cytoperm의 추가 각 웰 : TNF-α-알렉사 형석 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
  13. 1 배 Permwash (4 ° C에서)과 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 버퍼 (4 ° C)를 실행 한 시간 단계 9.9에 설명 된대로 세포 두 번 씻으십시오.
  14. 2 % 파라 포름 알데히드 (39 °의 C) 200 μL로 세포를 재현 탁. 12 × 75mm 튜브에 세포를 전송하고, 사이토 흐름에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 급성 독성 및 건강 위험, 부식성.

(10) K562 죽이는 분석

참고 : K562 세포는 성장한다RPMI 완료 매체와 37 ° C, 5 % CO 2의 문화에서 그들은 분석하기 전에 80 %의 합류에 도달 할 때까지.

  1. 유리 병에 DMSO의 18 μl를 추가하여 숙신 에스테르 (CFSE) 원액 카복시 5 mM의를 준비합니다.
  2. / 웰로 각각의 웰에 대해 원하는 등차 니코틴 단위 또는 니코틴 농도를 달성하기 위해 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다.
  3. / 웰 1.5 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완료 매체에 PBMC를 100 μl를 추가합니다. WS-CM 또는 니코틴 세포의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다.
  4. 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어.
  5. 실온에서 8 분 동안 400 XG에 10 DPBS ㎖의 원심 분리기를 추가하여 K562 세포를 씻으십시오.
  6. DPBS 10 mL로 재현 탁하고 세포를 K562 세포를 카운트.
  7. CFSE 가공용 준비1 ML의 DPBS에 CFSE 주식 솔루션 1 μl를 추가하여 NG 솔루션입니다.
  8. 2 × 107 세포 - 함유 한 K562 세포 현탁액 1 ㎖에 CFSE 작동 액 1ml를 추가한다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어.
  9. 즉시 FBS 200 μl를 추가합니다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어.
  10. RPMI 전체 매체의 10 ML을 추가하고 실온에서 8 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기.
  11. RPMI 상청액을 제거하고 펠렛을 끊고 RPMI 완전 배지 10 mL로 세포를 재현 탁하고 CFSE로 표지 된 K562 세포를 카운트.
  12. 실온에서 3 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리하여 PBMC를 씻으십시오. 액체를 경사 분리하여 상층 액을 기음. 덮개를 장착하고 접시의 바닥을 소용돌이. RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
  13. (1.5 × 106 PBMC를 K562s 100,000) PBMC 플레이트와 상기 각 I 샘플 웰에 1:15 비로 CFSE 표지 된 K562 세포를 추가37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 ncubate.
  14. 실온에서 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포 믹스를 씻으십시오. 액체를 제거하여 상층 액을 기음. 덮개를 놓고 판의 바닥을 소용돌이.
  15. 유동 완충액 200 μl를 첨가하고, 10.14 단계를 한 번 더에 기재된 세정 공정을 반복한다.
  16. / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7AAD의 5 μL 다음 실행 버퍼의 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
  17. 각 웰에 유동 완충액 100 ㎕를 첨가하고, 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 측정기에 샘플을 획득.
  18. 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 및 CFSE 양성 세포의 비율을 결정한다.

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결과

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결과는 평균 (네 기증자 샘플)의 평균 ± 표준 오차로 표시 하였다. 치료 및 치료를받지 않은 샘플 사이의 학생의 t- 테스트는 해당 컨트롤이 모든 치료 용 Excel 소프트웨어뿐만 아니라 t-test를 비교를 사용하여 수행 하였다. 통계적 유의성에 의해 표시되었습니다 * P <0.05; **, P <0.005; ***, P <0.0005.

WS-CM 및 니코틴에 대한 노출의 효과를 측정하기 위해, PBMC를 3 시간 또는 24 시간 동안 다른 WS-CM 및 니코틴의 농도로 처리 하였다. 세포 사멸은 이중 가닥 핵산에 인터 칼 7AAD의 같은 견고하고 안정적인 7AAD 염색법에 의해 측정하고, 죽거나 사균 (16)의 세포막을 관통 할 수있다. 세포 사멸의 용량 의존적 증가 등차 니코틴 단위 (도 1A)의 4 ㎍ / ml의 검출 가까운 80 % 세포 사멸과 함께 24 시간에서 WS-CM 관찰되었다. 세포 죽음의 ...

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토론

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우리와 다른 사람은 이전에 TPP를 함께 한 PBMC의 치료는 표현과 사이토 카인 및 대상 셀 (14)을 죽이는 기능 측정의 분비 등 여러 반응을 억제하는 것이 증명하고있다. 이전의 연구에서 설명하는 실험 방법은 더 이상 배양 기간을 필요로 크기 14에서 겸손했다. 기본이 매력적인 생체 모델의 응용 가능성을 감안할 및 응용 연구, 우리는 이러한 여러 단계의 생물학적 분석에서 분석 매개 변수의 최적화 할 수 있는지를 조사 하였다. 여기서는 TPP 처리 생체 PBMC 모델을 사용 TLR 매개 면역 반응을 측정하는 방법을 단순화 제시한다.

가능한 한 PBMC의 분리 이러한 생체 분석을위한 핵심 요구 사항이다. 잠재적 기증자의 개별 변동과 생리 학적 상태를 감안할 때, 그것은 반응하는 한 PBMC를 얻을 이상적입니다. 본 연구의 목적을 위해, 우리는 격리이전에 출판 된 방법

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 의학의 웨이크 포레스트 대학과 공동 연구 계약에 따라 RJ 레이놀즈 담배 회사 (RJRT)에 의해 자금을 지원한다. GL 프라 사드는 RJRT의 풀 타임 직원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
12 x 75mm 튜브BD Falcon352058
15ml 원뿔형 튜브Corning430790
2ml 마이크로튜브AxygenMCT-150-C-S
3R4F 참조 담배Univ. of Kentucky, College of Agriculture3R4F
50ml 원뿔형 튜브Corning430828
500ml 병Corning430282
7AADBD Pharmingen559925
96웰 플랫 바닥판Termo Nunc439454
96웰 원형 바닥판BD Falcon353077
Cell Culture hoodThermo Scientific1300 시리즈 A2
원심분리기Eppendorf58110R
CFSEMolecular Probes Life TechnologiesC34554
클러스터 튜브Corning4401삼키면 유해, 발암 물질
Cytofix/Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028가연성
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma-AldrichD8418
DPBSLonza17-512F
FBSSigma-AldrichF2442
FCAP 어레이BD Biosciences652099소프트웨어는 CBA 데이터를 분석합니다
필터 유닛Nalgene156-4020
유세포 분석기BD BiosciencesFACS Canto II8 색상, Ex 405 및 Em 785에서.
유세포 분석기BD BiosciencesFACS CaliburEx 495 및 Em 785에서 4가지 색상.
유세포 분석 소프트웨어Tree StarFlowJo
냉동 용기Nalgene5100-0001DMSO, 자극성
GogliPlugBD Biosciences555029발암물질, 자극성, 부식성
H2SO4Sigma-Aldrich339741
Human Inflammatory Cytokine Kit함유BD Biosciences551811
IFN-&감마; V-500 항체BD Horizon561980피부 감작제
IL-8 ELISA 키트R 및 D 시스템DY208
절연 버퍼Isolymph, CTL Scientific Corp.1114868가연성 액체, 자극성
이소프로필 알코올시그마-알드리치W292907
L-글루타민Gibco Life Technologies25030-081
LPS시그마-알드리치L2630
MIP1-&알파; PE 항체BD Pharmingen554730급성 독성, 경구용
MonensinSigma-AldrichM5273
NaClSigma-AldrichS7653
니코틴Sigma-AldrichN3876급성 독성, 환경 위험
ParafilmBemis" 미디엄"
파라포름알데히드Sigma-AldrichP6148가연성, 피부 자극성
펜/연쇄상 구균Gibco Life Technologies15140-122
RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
러닝 버퍼MACS 러닝 버퍼, Miltenyi Biotech130-091-221
Th1/Th2 CBA 키트BD Biosciences551809
TNF-&알파; Alexa Fluor 488 항체BioLegend502915
전달 피펫Fisher Scientific13-711-20
트리스 베이스시그마-알드리치T1503

참고문헌

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  15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
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