방법 논문

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는 - 채널 및 전송기

DOI:

10.3791/52369

⸱

2015년 4월 20일

 , 
1Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, 2Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 3Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

이 논문에서

요약

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Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

초록

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지난 15년 동안 진핵생물뿐만 아니라 원핵생물로부터 막 단백질을 과발현하고 정제하는 능력이 폭발적으로 증가한 것이 특징입니다. 이러한 증가는 주로 막 단백질에 대한 구조 정보를 얻으려는 성공적인 노력에 의해 주도되었습니다. 그러나 이러한 단백질을 기능적으로 조사하는 능력은 동일한 속도로 발전하지 않았으며 종종 제한된 정량적 가치의 정성적 분석으로 제한되어 제공할 수 있는 기계론적 통찰력을 제한합니다. 재구성된 Cl-채널 또는 수송체의 수송 활성을 정량적으로 조사하기 위한 분석법이 설명됩니다. 이 분석은 막 전위를 션트하기 위해 K+ ionophore valinomycin을 추가한 후 프로테오리포좀에서 Cl-의 유출 속도를 측정한 것을 기반으로 합니다. 이온 민감성 전극은 원하는 단백질로 재구성된 프로테오리포좀에서 이온 유출의 시간 경과를 추적하는 데 사용됩니다. 이 방법은 단일 수송 속도, 활성 단백질의 분율 및 기능 단위의 분자량과 같은 재구성된 단백질의 주요 특성을 정량적으로 결정할 수 있기 때문에 기계론적 연구에 매우 적합합니다. 이 분석은 또한 재구성된 단백질을 직접 억제/활성화하는 저분자 화합물의 효과를 결정하고 멤브레인 조성 또는 지질 변형 시약의 조절 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 가능한 경우, 이 방법을 사용하여 얻은 결과를 직접 비교하는 것이 전기생리학적 접근 방식을 사용하여 얻은 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났습니다. 이 기술은 CLC 유형 H + / Cl- 교환기 인 CLC-ec1을 모델 시스템으로 사용하여 설명됩니다. 유출 분석은 모든 Cl 전도성 채널/수송체를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 최소한의 변화로 모든 이온 수송 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

서론

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마지막 두 과발현과 막 수송 단백질을 정제 할 수있는 능력이 크게 증가하고있다 수십 년 : 이온 채널, 일차 및 이차 전송기들은 보통 이종 발현 시스템뿐만 아니라, 천연 공급원으로부터 정제된다. 이 단백질의 안정성을, 표현을 모니터링 개선하고 추출을 용이하게하고 강화하는 새로운 접근 방식은 끊임없이 1-5 개발되고있다. 이러한 기술 혁신은 차례로, 그 기능의 구조적 기지에 대한 우리의 이해를 강화, 막 단백질에 원자 수준의 구조 정보의 폭발을 유발하는 데 큰 도움이되고있다. 반면에, 우리의 능력은 어떤 경우에는 고해상도 구조적 정보가 따라서 정량적 구조 기반 예측을 테스트 할 수있는 능력을 제한 질적 기능 데이터에 의해 수반되도록, 동일한 비율로 증가하지 않은 정제 된 단백질의 기능적 특성을 프로빙. 따라서, developmen는양적 일반화 기능 분석의 t는 막 단백질의 기능 기계론 토대 해명 향해 중요한 단계이다.

채널 및 전송기 - 준비 정량적 정제하고 재구성 CL의 주요 기능적 특성을 결정하기 위해 사용될 수 유출 분석을 기술한다. 분석을위한 원칙은 교통 시스템뿐만 아니라 다양한 비 이온 수송 단백질로 일반화 될 수있다. 채널 / CL 대형의 존재 수송차 - - 정제 된 리포....

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프로토콜

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1. 지질 준비

  1. 투명 유리 튜브로 원하는 양의 지질 나누어지는. 사용 E. 콜라이 극성 지질 추출물하지만 대부분 지질 조성물을 사용할 수있다. 지질이 분말 형태 인 경우, 20 ㎎ / ㎖의 농도로 이들을 클로로포름에 재현 탁. 모든 용매가 증발 할 때까지 N 2 가스에서 RT에서 지질을 건조.
  2. 펜탄의 지질을 재현 탁 클로로포름의 남은 흔적을 제거하기 위해 다시 가스 N 2를 일정하게 건조시킨다. 드라이 모든 용매를 증발 할 때까지. 건조 동안 지질이 아래쪽 형성 치밀한 질량보다는 튜브의 아래쪽을 덮는 제 균일 한 막 분포되도록 부드럽게 회전 튜브.
  3. 재구성 버퍼 함유 세제를 추가 (300 mM의 KCl을 50 mM의 시트르산, 25 mM의 K 2 HPO 4의 pH 4.5, 35 mM의 CHAPS)은 지질을 용해. 단백질이 CHAPS에 가난하게 허용하는 경우이 단계에서 다른 중성 세제를 사용하십시오.
  4. Resuspen물 목욕 초음파기를 사용하여 선명도 지질 거라고. 짧은 (30 초 - 1 분)와 짧은 (30 초 - 1 분) 펄스를 최대 전력에서 물 초음파기 목욕의 중심에 튜브를 담가 일시 중지합니다. 이 솔루션은 명확하게해야한다.....

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결과

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교환기, 리포좀에 재구성 - 정제 CLC-EC1, 원핵 CLC 형 H + / CL에 의해 매개 교통 - 우리는 상세하고 강력한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 실험 장치의 개략적 인 대표도도 3에 도시되어 정제 된 CLC-EC1 및 높은 내부 CL 함유 재구성은 테오 -. 낮은 CL 함유 용액 욕에 침지 -. 이러한 조건 그물 CL에서 - 유출은 리포좀 (그림 3A)에 양의 전하의 축적에 의해 방지 할 수있다. 유출 (그림 3B) - 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 추가는 K +가 막 따라서 전위 전철과 CL을 시작 가로 질러 이동할 수 있습니다. 플럭스 시간 코스는 CL을 사용하여 모니터된다 - -selective 전극 및 CL의 총량 .......

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토론

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정제 음이온 선택적 채널 또는 리포좀에 재구성 수송에 의해 매개 교통 - 우리는 상세한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명했다. CLC-EC1을 기 - 사용 된 예는 원핵 H + / CL이었다. 고려중인 이온에 적합한 하나의 AgCl 전극 : 그러나, 방법론 용이 리간드 12,13,15, 11,12 전압 또는 AG로 대체하여 다른 음이온 선택성 15,16 스포츠 의해 게이트 된 채널을 연구하기에 적합 할 수있다. 전극이 CL 이외의 이온에 대한 선택적 - 이러한 H의 +로, I - F는 -, 상업적으로 사용할 수 있습니다.

중요한 단계 및 가정의 몇 가지의 토론은 다음과 같습니다.

푸 아송 희석 가정의 한계

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH 보조금 GM085232와 Irma T. Hirschl/Monique Weill-Caulier Scholar Award(A.A.에)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
지방살균제, Avanti Polar Lipids Inc.  아반티 폴라 지질 Inc.610200
IEC Centra CL2 벤치탑Thermo Scientific
Orion Research Model 701A 디지털 pH-mV 미터이들은 Ebay에서 찾을 수 있습니다.
작동하지 않는 pH 프로브은색 와이어가 있는 모든 pH 측정기 프로브가 작동합니다. 유리/플라스틱 코팅을 제거하고 전선을 청소해야 합니다.
DI-710 데이터 로거DATAQ 기기
WinDAQ 수집 소프트웨어DATAQ 기기
피어스 일회용 플라스틱 기둥, 중력 흐름, 2ml피어스(Thermo Scientific)29922
KIMAX 배양 튜브, 일회용, 붕규산 유리Kimble Chase73500-13100
홀더/가열 블록이 있는 압출기 세트아반티 폴라 지질 Inc.610000
컴퓨터
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참고문헌

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  1. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
  2. Drew, D., et al.

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재인쇄 및 허가

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