Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
지난 15년 동안 진핵생물뿐만 아니라 원핵생물로부터 막 단백질을 과발현하고 정제하는 능력이 폭발적으로 증가한 것이 특징입니다. 이러한 증가는 주로 막 단백질에 대한 구조 정보를 얻으려는 성공적인 노력에 의해 주도되었습니다. 그러나 이러한 단백질을 기능적으로 조사하는 능력은 동일한 속도로 발전하지 않았으며 종종 제한된 정량적 가치의 정성적 분석으로 제한되어 제공할 수 있는 기계론적 통찰력을 제한합니다. 재구성된 Cl-채널 또는 수송체의 수송 활성을 정량적으로 조사하기 위한 분석법이 설명됩니다. 이 분석은 막 전위를 션트하기 위해 K+ ionophore valinomycin을 추가한 후 프로테오리포좀에서 Cl-의 유출 속도를 측정한 것을 기반으로 합니다. 이온 민감성 전극은 원하는 단백질로 재구성된 프로테오리포좀에서 이온 유출의 시간 경과를 추적하는 데 사용됩니다. 이 방법은 단일 수송 속도, 활성 단백질의 분율 및 기능 단위의 분자량과 같은 재구성된 단백질의 주요 특성을 정량적으로 결정할 수 있기 때문에 기계론적 연구에 매우 적합합니다. 이 분석은 또한 재구성된 단백질을 직접 억제/활성화하는 저분자 화합물의 효과를 결정하고 멤브레인 조성 또는 지질 변형 시약의 조절 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 가능한 경우, 이 방법을 사용하여 얻은 결과를 직접 비교하는 것이 전기생리학적 접근 방식을 사용하여 얻은 결과와 잘 일치하는 것으로 나타났습니다. 이 기술은 CLC 유형 H + / Cl- 교환기 인 CLC-ec1을 모델 시스템으로 사용하여 설명됩니다. 유출 분석은 모든 Cl 전도성 채널/수송체를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 최소한의 변화로 모든 이온 수송 단백질을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.
서론
마지막 두 과발현과 막 수송 단백질을 정제 할 수있는 능력이 크게 증가하고있다 수십 년 : 이온 채널, 일차 및 이차 전송기들은 보통 이종 발현 시스템뿐만 아니라, 천연 공급원으로부터 정제된다. 이 단백질의 안정성을, 표현을 모니터링 개선하고 추출을 용이하게하고 강화하는 새로운 접근 방식은 끊임없이 1-5 개발되고있다. 이러한 기술 혁신은 차례로, 그 기능의 구조적 기지에 대한 우리의 이해를 강화, 막 단백질에 원자 수준의 구조 정보의 폭발을 유발하는 데 큰 도움이되고있다. 반면에, 우리의 능력은 어떤 경우에는 고해상도 구조적 정보가 따라서 정량적 구조 기반 예측을 테스트 할 수있는 능력을 제한 질적 기능 데이터에 의해 수반되도록, 동일한 비율로 증가하지 않은 정제 된 단백질의 기능적 특성을 프로빙. 따라서, developmen는양적 일반화 기능 분석의 t는 막 단백질의 기능 기계론 토대 해명 향해 중요한 단계이다.
채널 및 전송기 - 준비 정량적 정제하고 재구성 CL의 주요 기능적 특성을 결정하기 위해 사용될 수 유출 분석을 기술한다. 분석을위한 원칙은 교통 시스템뿐만 아니라 다양한 비 이온 수송 단백질로 일반화 될 수있다. 채널 / CL 대형의 존재 수송차 - - 정제 된 리포솜 CL로 녹이고 구배 (도 1A, B). CL이 - 유출가 우리의 경우에는, 반대 이온 플럭스 있도록 이온 운반체의 첨가에 의해 개시되는 K + 이온 운반체 발리 노마 이신 (Valinomycin), CL에 의해 설정된 전압 션트되는 - 구배 및 K의 평형 전위로 초기 막 전위를 설정할 + 6,7. t없이이 횡단 전위의 발생에 의해 방지로 유출이 발생, - 그는 더 중요한 순 (CL)을 이온 운반체가 없습니다. - 유출 및 F 0, 활성 단백질을 함유하지 않은 리포좀 분획 τ, CL의 시상수 : 정량적 데이터는 두 개의 측정 파라미터 (도 1C)에 의해 설명된다. τ와 f 0 CL에서 단일 - 전송 속도, 활성 단백질의 활성 분획물 및 복합체의 분자량은 8 유도 될 수있다. 알려진 구조와 기능의 교환기 -이 기술은 CLC-EC1, 잘 특성화 된 CLC 형 H + / CL로 재구성 테오를 사용하여 여기에 예시되어있다. 상기 분석 용이 전압 활성 및 / 또는 리간드의 존재에 따라 상이한 또는 이온 선택성 채널들 또는 컨베이어로 일반화된다. 또한,이 분석은 소분자 직접 영향을 미치는 단백질 재구성 여부를 결정하는데 사용될 수있다,이들 화합물 및 방법에 막 조성물 또는 지질 - 변경 시약 재구성 채널들 및 수송의 기능에 영향을 미치는 영향을 정량.
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프로토콜
1. 지질 준비
- 투명 유리 튜브로 원하는 양의 지질 나누어지는. 사용 E. 콜라이 극성 지질 추출물하지만 대부분 지질 조성물을 사용할 수있다. 지질이 분말 형태 인 경우, 20 ㎎ / ㎖의 농도로 이들을 클로로포름에 재현 탁. 모든 용매가 증발 할 때까지 N 2 가스에서 RT에서 지질을 건조.
- 펜탄의 지질을 재현 탁 클로로포름의 남은 흔적을 제거하기 위해 다시 가스 N 2를 일정하게 건조시킨다. 드라이 모든 용매를 증발 할 때까지. 건조 동안 지질이 아래쪽 형성 치밀한 질량보다는 튜브의 아래쪽을 덮는 제 균일 한 막 분포되도록 부드럽게 회전 튜브.
- 재구성 버퍼 함유 세제를 추가 (300 mM의 KCl을 50 mM의 시트르산, 25 mM의 K 2 HPO 4의 pH 4.5, 35 mM의 CHAPS)은 지질을 용해. 단백질이 CHAPS에 가난하게 허용하는 경우이 단계에서 다른 중성 세제를 사용하십시오.
- Resuspen물 목욕 초음파기를 사용하여 선명도 지질 거라고. 짧은 (30 초 - 1 분)와 짧은 (30 초 - 1 분) 펄스를 최대 전력에서 물 초음파기 목욕의 중심에 튜브를 담가 일시 중지합니다. 이 솔루션은 명확하게해야한다.
주 : 최종 명확성 정도 달성 사용될 특정 지질 조성에 의존한다. 심지어 동일한 명목상 지질이 단계 중 일부 뱃치 간 변이는 것도 가능하다. 잔류 헤이즈를 원심 분리에 의해 제거 될 수 현탁액 중의 큰 입자에 의한 광의 산란에 기인한다. - 20 ~ 60 분 동안 실온에서 재현 탁 지질을 품어.
2. Proteoliposome 형성
주 : 몇 가지 전략은 리포좀으로 세제 용해 된 단백질을 삽입하기 위해 사용될 수있다. CLC-EC1은 투석은 잘 작동하기 때문에 선택 6,9,10의 방법이다.
- 로 정제 된 단백질을 추가 원하는 단백질로 지질 μg의 O를 표현 (P / L) 비율 ( F 단백질 / mg의 지질). P / L 비의 선택은 실험의 목적에 의존한다.
- 목표는 관심있는 단백질의 활성을 평가 높은 P에 재구성하는 경우 각 리포좀 단백질의 여러 복사본을 포함합니다 / L'들, 신호를 최대화한다. 각 소포 평균 한 단백질에 포함되도록 활성 및 / 또는 단백질의 단일 전송 레이트를 수치화하기 위해, 낮은 P / L' s의 포아송 희석 정권 재구성한다. 각 체제를 사용하는 경우보다 깊이 분석을위한 7 단계 및 토론을 참조하십시오.
- 다양한 섭생에 대한 최적의 P / L 값을 결정하려면, 8,11-13 단백질 농도의 함수로서 활성의 완전한 적정을 수행한다. 그러나, 활성 단위의 분자량 (MW가 kDa의 표시)하는 모든 단백질을 다음 P / ℓ를 초기 값을 절반으로 사용될 수있는 공지되어있다 :
PG "/>
- 미리 유체 접촉 투석 튜브 또는 카세트에 단백질과 지질 혼합물을로드합니다. 500-1,000x 지질 재구성 버퍼의 양을 함유하는 비이커에 투석 장치를 배치 (즉, 지질 부유 1 ㎖를 1 L 버퍼) 부드러운 교반하에.
- 변경 버퍼 간격> 3 시간에 3-4 회. 모든 솔루션 변화에서, 카세트 / 튜브 및 증류수로 비커를 씻어 신선한 재구성 버퍼 비커를 입력합니다. 솔루션 변화 1-2 O / N 간격을 포함합니다. 용액 변경의 정확한 수와 기간이 사용될 정확한 지질 및 세제에 의존한다.
- 마지막 단계가 완료된 후, 투석 용기로부터 제거 리포좀 튜브들을 분취 플래시 -80 ° C에서 액상이 N 또는 동결 그들을 동결.
3. 녹화 환경
참고 : 녹화 설정 (그림 2A)이 두 개의 챔버 (평면 바닥 실린더, ~ 3-4 ml의 부피), CL로 구성 - 전극, 아날로그와 pH 측정기 (아래 참조) 디지털 전기 출력, 디지타이저 및 적절한 수집 소프트웨어와 컴퓨터 나.
- pH 미터 전극을, 컴퓨터에 연결되어 디지타이저 pH 미터의 출력 - CL을 연결한다. 하나의 챔버에서 기준 전극과 다른 (그림 2B)에서 레코딩 와이어를 놓습니다.
주 : 칼 ΔV가 양수 (단계 6.4 및 7.2 참조)의 경우에는 와이어 극성이 맞는지. - 기록 챔버 (그림 1B)에서 교반 막대와 볶음 접시에 챔버를 놓습니다. 교반 막대를 전극에 접촉하지 않도록하십시오.
- 한천 다리 (그림 2B) (100 mM의 KCl을 2 % 아가로 오스)를 사용하여 챔버를 연결합니다. 100 mM의 KCl을의 한천 다리를 저장합니다.
CL 4. 준비 - 전극
- 과거와 -possibly- 작동하지 않는 pH 전극을 가져 가라. 완전히 실버 와이어를 공개 유리막 브레이크.
- 조심스럽게 메스 블레이드를 사용하여 실버 와이어에서 코팅을 제거합니다. H 2 O와의 EtOH 풍부한 양을 사용하여 와이어를 청소합니다.
- 전선까지 50ml을 (또는 표백제)의 포화 용액에 장소의 AgCl의 균일 한 어두운 코트 덮여있다.
단일 층 소포 5. 준비
- 실험 전에 밤, 외부 버퍼 15 ㎖ (1 ㎜의 KCl, SO 4, 25 mM의 구연산, 산도 4.5 150 mM의 K 2) 흔들리는 부드러운와가 (저어하지 않음)에 세파 덱스 G-50 구슬의 1g 팽창 사용하기 전에 실온에서 최소 3 시간. 각 실험은 부어 구슬 ~ 3 ㎖가 필요합니다. 기껏해야 몇 일 동안 4 ° C에서 부어 구슬을 유지합니다.
- 리포좀을 실온에서 해동하는 동안, 각 열 ~ 3m 부어부어 G-50 구슬의 리터. RT 중력 흐름에 의해 그들을 말리면; 이것은 일반적으로 1 ~ 2 분 걸립니다.
- 0.4 m 테플론 차단을 사용하여 미니 압출기를 통해 테오에게 11 번을 돌출시켜 단일 층 소포를 준비합니다.
- 플라스틱 둥근 바닥 튜브에 열을 놓습니다. 여분의 용액을 제거하기 위해 열을 스핀. 임상 원심 분리기에서 1,400 XG에 20 ~ 30 초 동안 원심 분리기.
- 13 X 100mm 유리 튜브의 흐름을 통해, 장소 열을 버리고 컬럼에 돌출 된 소포의 100 μl를 추가합니다. 임상 원심 분리기 500 XG에서 1 분 동안 열을 스핀.
- 단계 6.5의 기록 챔버에 첨가한다 관류 ~ 200 μL의 수집.
6. 유출 측정
- 레퍼런스 (접지) 100mm의 챔버의 KCl 2㎖ 및 외부 버퍼의 1.8 ml의 배치 (1 mM의 KCl을을 150 mM의 K 2 SO 4, 25 mM의 시트르산, pH를 4.5) 기록 챔버. 내부 사이의 약간의 삼투압의 불균형외부 솔루션에 영향을주지 않습니다
- 취득 프로그램을 시작합니다. 이 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다, 기준이 평형을 보자.
- 신호를 안정적으로 기준선 (리포좀 준비하고 건조 컬럼)에 도달하면 (도 3a)을 촬영을 시작.
- 시스템 (그림 2A)를 교정 된 10 mM의 KCl 용액 15 μl를 추가합니다.
- 리포좀을 추가합니다. 테오 (그림 3A)에서 - 작은 점프 인해 외부 CL의 불완전한 제거로 볼 수 있습니다. 베이스 라인이 안정 될 때까지 기다립니다.
- 발리 노마 이신 (Valinomycin) 추가 (1 mg의 EtOH 중 / ㎖에서 1 μL)은 유출 (그림 3A)를 시작합니다.
- 유출은 시간 물론 고원까지 (그림 3A)를 실행하자.
- 모든 리포좀 (그림 3A)을 용해 할 수있는 외부 버퍼에 준비 1.5 M β-옥틸 글루코 시드 (β-OG)의 40 μl를 추가합니다. 촬영을 완료합니다.
7. 데이터nalysis
- ASCII 또는 텍스트 형식에서 추적 파일을 내보내고 선택의 분석 프로그램으로 가져옵니다.
- 다음 사항 (도 3A)에서 전압을 측정한다 :
기록의 시작시 (0 V);
교정 펄스 (CAL V)을 첨가 한 후;
리포좀 (리포의 V)을 첨가 한 후;
유출 (V 지느러미)의 끝에;
세제 (V 어린 아이)을 첨가 한 후,
기준 전압 그래서 V 0 = 0. - 실험의 값을 결정 네른스트 - 플랑크 식을 사용하여
측정하여 
여기서 권 칼 μL의 교정 펄스의 부피로 표현 된 실험의 시작에서 챔버 체적은 1800이다1 - 교정 펄스와 mm 단위로 외부 버퍼의 농도 ΔV CAL은 교정 펄스 후에 측정 MV에서 점프입니다 난, [CL] CAL /에서하면 CL 있습니다.
참고 : α의이 경험적인 결정은 세 가지 목적을 수행합니다 : 그것은 시스템이 제대로 응답하는지 보장, 실험 사이에 악기의 응답의 일관성의 측정을 제공뿐만 아니라 실수는 솔루션 결정에 만든되지 않았 음을 확인합니다. - 다음 각 단계 후에 CL 농도를 계산한다 :
400분의 3 인자는 2000 μL의 최종 부피로 15 μL 교정 펄스의 희석에서 온다. - Calcul각 단계, 지느러미 ΔCl의 사러가 / / TOT에서 [CL]의 변화를 먹었다.
- 와 CL (t)에 V (t)를 변환
직접 중요한 지점에서 [CL] 값을 결정하고 내부 통제로 계산 된 값으로 비교합니다. - 추적을 정상화 CL 확인해의 리포 = 0, CL 확인해 무비 = 1 그래서
- 하기 식 유출 경시 맞는 :
CL 실험적으로 측정함으로써 결정된다 누설 - - L는 Cl의 비율이다 τ와 동일한 조건에서 제조 된 무 단백질 리포좀으로부터 유출이 공정의 시간 상수이다. - V, 초기 속도를 계산한다 :
여기서 ΔCl 핀은 밀리몰의 표현 및 V는 μL의 챔버의 체적이다. - 전송 속도 / 전도도를 계산
P는 P / L이고, MW는 활성 착물 kDa의 분자량으로 표현
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결과
교환기, 리포좀에 재구성 - 정제 CLC-EC1, 원핵 CLC 형 H + / CL에 의해 매개 교통 - 우리는 상세하고 강력한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 실험 장치의 개략적 인 대표도도 3에 도시되어 정제 된 CLC-EC1 및 높은 내부 CL 함유 재구성은 테오 -. 낮은 CL 함유 용액 욕에 침지 -. 이러한 조건 그물 CL에서 - 유출은 리포좀 (그림 3A)에 양의 전하의 축적에 의해 방지 할 수있다. 유출 (그림 3B) - 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 추가는 K +가 막 따라서 전위 전철과 CL을 시작 가로 질러 이동할 수 있습니다. 플럭스 시간 코스는 CL을 사용하여 모니터된다 - -selective 전극 및 CL의 총량 ...
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토론
정제 음이온 선택적 채널 또는 리포좀에 재구성 수송에 의해 매개 교통 - 우리는 상세한 CL을 측정 할 수있는 프로토콜을 설명했다. CLC-EC1을 기 - 사용 된 예는 원핵 H + / CL이었다. 고려중인 이온에 적합한 하나의 AgCl 전극 : 그러나, 방법론 용이 리간드 12,13,15, 11,12 전압 또는 AG로 대체하여 다른 음이온 선택성 15,16 스포츠 의해 게이트 된 채널을 연구하기에 적합 할 수있다. 전극이 CL 이외의 이온에 대한 선택적 - 이러한 H의 +로, I - F는 -, 상업적으로 사용할 수 있습니다.
중요한 단계 및 가정의 몇 가지의 토론은 다음과 같습니다.
푸 아송 희석 가정의 한계
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 보조금 GM085232와 Irma T. Hirschl/Monique Weill-Caulier Scholar Award(A.A.에)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 지방살균제, Avanti Polar Lipids Inc. | 아반티 폴라 지질 Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 벤치탑 | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A 디지털 pH-mV 미터 | 이들은 Ebay에서 찾을 수 있습니다. | ||
| 작동하지 않는 pH 프로브 | 은색 와이어가 있는 모든 pH 측정기 프로브가 작동합니다. 유리/플라스틱 코팅을 제거하고 전선을 청소해야 합니다. | ||
| DI-710 데이터 로거 | DATAQ 기기 | ||
| WinDAQ 수집 소프트웨어 | DATAQ 기기 | ||
| 피어스 일회용 플라스틱 기둥, 중력 흐름, 2ml | 피어스(Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX 배양 튜브, 일회용, 붕규산 유리 | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| 홀더/가열 블록 | 이 있는 압출기 세트아반티 폴라 지질 Inc. | 610000 | |
| 컴퓨터 |
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