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방법 논문

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

8.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52370

⸱

2015년 3월 12일

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

이 논문에서

요약

여기에서는 싱크로트론 X선 형광을 사용하여 샘플에서 금속의 양과 분포를 결정하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 부착 세포에 초점을 맞추고 이 샘플을 준비하기 위한 화학적 고정 방법을 설명합니다. 그런 다음 싱크로트론 X-ray를 사용하여 샘플을 장착하고 이미지화하는 방법을 설명합니다.

초록

선 형광 이미징을 사용하면 크거나 작은 샘플 영역에서 여러 원소의 공간 분포 및 농도를 동시에 비파괴적으로 측정할 수 있습니다. 재료 과학, 지구 과학, 문화 유산 연구 및 화학 생물학을 포함한 많은 과학 분야에 적용되었습니다. 예를 들어, 화학 생물학의 경우 세포 내 금속 분포를 시각화하면 세포에서 자연적으로 발생하는 금속 이온뿐만 아니라 약물 및 나노 입자와 같은 외인성 유입 금속을 모두 연구할 수 있습니다. 거의 모든 생물학적 샘플의 완전히 수화된 특성으로 인해 극저온 온도에서 이미징 후 cryo-fixation은 현재 사용 가능한 이상적인 이미징 방식을 나타냅니다. 그러나 이러한 조합에 쉽게 접근할 수 없거나 실용적이지 않은 상황에서는 알데히드 기반 화학적 고정이 여전히 유용하고 때로는 불가피합니다. 이 기사에서는 X선 형광 이미징을 위한 화학적 고정에 의한 부착 포유류 세포의 준비에 대해 가능한 한 자세히 설명합니다.

서론

형광 이미징은 정체성과 샘플에 존재하는 원소의 양을 모두 허용 X 선은 공간적으로 해결한다. 입사 X 선은, 주목 무거운 요소의 결합 에너지 전자보다 크도록 선택된 에너지, 핵 (1)에 내측 쉘 전자의 결합 에너지를 극복. 이 전자 껍질에 '구멍'을 만듭니다. 높은 에너지의 전자가이 구멍으로 아래로 떨어질 때, 형광 X 선 파장이 그 궤도의 에너지 분리에 의존 방출된다. 오비탈의 에너지 간격은 주어진 요소의 특징이기 때문에, X 선 형광 발광 소자는 파장에 의존하는 특성을 갖는다. 그것은 본 요소의 식별을 허용 특성이 파장에서 발광된다. 형광 강도의 보정은 본 소자의 정량을 허용한다.

X 선 형광 microscopY (XFM)는 부분적으로 같은 봄-8 일본, 유럽 방사선 싱크로 시설 프랑스 (ESRF) 및 고급 광자 소스 (의 것과 매우 화려한 X 선 싱크로트론 소스의 개발, 점점 더 활용되고있다 미국 2 APS). 이 소스는 매우 높은 강도의 X 선 빔을 제공한다. 동시에, 이러한 존 플레이트 기술과 같은 X 선 광학 개선은 다소 비효율적 3이라도 서브 마이크론 이러한 스폿 빔의 포커싱을 허용했다. 매우 고강도 빔, 현재 이용 가능한 기술을 검출기로 측정 할 수있는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분하다 집중 될 수 광의 심지어 비교적 소량 생산 신호. 따라서, 셀에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 기술 4-10 최근 개발 많은 이용한다 특히 하나의 애플리케이션이다.

앱 동안 고려해야 할 많은 중요한 요소가 있습니다XFM을 누워 배양 된 포유 동물 세포 또는 다른 생물학적 시료의 원소 분포와 정량화를 조사합니다. 첫째, 샘플은 의미있는 것으로 측정 위해서는, 모두 구조적 및 원소 조성에 대하여, 그대로 유지되어야한다. 그것이 집광 X 선 빔에 의해 야기 될 수 방사선 손상에 강건한되도록 둘째, 표본은 어떠한 방법으로 보존되어야한다. 시료가 한 번에 이러한 기준을 모두 만족시킬 수있는 한 가지 방법은 급속 유리체, 비결정질 얼음 11,12으로 고정된다는 것이다. 급속 동결은 종종 플 런지 동결 또는 높은 압력이 13 ~ 16 동결 등 다양한 냉동 보존 기술을 통해 달성된다. 그것은 일반적으로 냉동 보존이 가능한 원시 상태에 가까운 생물학적 샘플에서 전체 세포의 구조와 화학 성분을 보존하는 것이 허용됩니다. 세포 및 조직 내로의 고정 제 느리고 침투로 인한 선택적 한편 화학 고정, w로서엘 막 투과성과 같은 이후의 변화는 다양한 세포 이온 특히 CL, 칼슘과 K로 확산 이온 따라서 17 ~ 19 차선의 이러한 요소의 조사를 렌더링, 침출 손실 또는 이전 할을 허용 할 수있다. 특히 부착 포유 동물 세포의 일반적인 화학 고정, 이상 극저온 고정의 분명한 이점에도 불구하고, 동결 보존은 다양한 한계 20-23있다. 가장 눈에 띄는 사람은 없습니다 모든 연구소가 냉동 보존 장비에 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 심지어 현재 대부분의 고압 냉장고 또는 냉동고는 지금까지 세포가 배양되는 곳에서 할 수있다 냉동 시설의 부분 집합에 의해 비용과 소유 뛰어 들다. 냉동 보존의 장점은 셀에 배치 여행 스트레스의 단점과 교환 될 수 있습니다. 동결 반드시 X 선 형광 분석을위한 샘플을 보존하는 방식으로 가장 엄격한 동안 따라서, 확실히 모든 상황에서 모든 연구에 가장 접근 아니다;않으며 항상 필수적인 - 관심 금속 단단히 고정 가능한 거대 분자에 결합하고, 샘플을 이미지화 된 해상도가 건조시 발생할 수있는 초 미세의 손상보다 큰 경우. 주의 사항 24 염두에, 화학 고정 및 건조는 적절한 선택이 될 수 있습니다.

성공적인 X-ray 형광 이미징 실험에서 다른 요소는 적절한 분석을 포함한다. X 선 형광 촬상 근본적 공간 해상도를 제공하기 위해 래스터 주사와 함께 X-ray 형광 발광 스펙트럼이다. 수집 된 X 선 형광 방출 스펙트럼은 발광 피크, 배경, 및 입사 빔의 탄성 및 비탄성 산란 피크를 겹치는 조합을 함유한다. 이러한 기여 디 컨벌루션 및 발광 피크 피팅 가능 소프트웨어는이 필드 (25)에 중요한 발달이었다. 또한, 개발 및 상업적인 DIST재료 수량 형광 강도 상대적인 보정하는 공지 된 조성물의 박막 표준 ribution도 매우 중요했다.

이 프로토콜은 화학적 고정 및 공기 건조 부착 세포의 제조에 대한 설명을 제공한다. 이 과정에서 중요한 단계는 종종 성공에 특정 패션 키에 부드러운 세정을 잘 준수하지 않는 실리콘 질화물 윈도우에있는 세포의 성장이다.

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프로토콜

악기, 기판, 문화 미디어와 요리 1. 준비

  1. 실리콘 나이트 (시 3 N 4) 윈도우의 취급.
    1. 한편으로 캡슐의 타단을 회전시키면서 약간 창 자체 짜지하는 방식으로 윈도우를 함유 한 단부를 압착하여 캡슐을 연다.
    2. 역의 쌍을 확인, 실체 현미경 아래 뾰족한 핀셋 끝에 접착제, 틈새 나 굴곡이 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면, 창은 핀셋으로 파손 또는 후속 단계에서 그들을 떨어져 비행 할 수있다.
    3. 부드럽게 윈도우의 가장자리가 나올 필요로하는 곳에 캡슐을 넓게 할 수 있도록하는 방향으로 압력을 개방 끝 부분에 캡슐을 압박하면서, 조심스럽게 핀셋 윈도우의 프레임을 잡고 캡슐에서 창을 제거합니다.
  2. 창 미리 세척 (선택 사항).
    1. 부드럽게를 담그고, 미리 세척 창을 원하는 경우70 % 에탄올에서 2 분 세척 100 % 에탄올에서 2 분 세척 한 다음 5 초 동안 증류수에.
  3. 부착 및 배양 접시에 창을 살균.
    1. 창문을 부착하기 위해, 배양 접시의 바닥에 평평한면을 위로해서 창을 설정, 깨끗한 유리 슬라이드에 테이프의 조각을 배치합니다. 테이프의 긴 측면 아래 기장 스트립을 약 잘라. 깨끗한 면도날 ( "¾에 의해"⅛에서) 짧은 측 떨어져 테이프의 조각을 가져 가라.
    2. 그리드 또는 창의 가장자리에 테이프의 조각을 적용 핀셋을 사용합니다. 안전하게 개구 창 자체를 덮는없이 접착 충분히 사용한다. 핀셋 접착 테이프를 조작, 배양 접시의 바닥에 내려 창을 설정합니다. 단단히 배양 접시의 바닥에 테이프를 부착 핀셋의 끝을 사용합니다.
    3. 다른 가장자리에 다른 테이프 스트립을 적용하고 단단히 핀셋의 끝이 바닥에이를 준수합니다.
    4. 일단 모든 창문은테이프, 자외선 (UV) 방사선 배양 접시에서 창을 소독. 약 1 시간 동안 층류 후드에서 UV 램프 아래에서 요리를 배치함으로써이 작업을 수행.
    5. 윈도우 폴리 리신으로 미리 코팅 될 경우 (선택)이므로, 윈도우는 다음의 멸균 않는다. 코트는 10 37 ° C 배양기에서 1 시간 동안 멸균 된 0.01 %의 폴리 -L- 라이신 솔루션의 μL와 함께 창은 문화 미디어로 남아있는 솔루션을 씻어 낸다.
  4. XFM 전에 최종 세척을위한 버퍼를 준비합니다.
    1. 트리스 글루코스 또는 피페 라진 N를 준비, N '비스 (에탄 설 폰산) (PIPES)는 칼슘 및 마그네슘없는 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)로 삼투압과 pH를 동등한 임의의 미량 금속이없는 버퍼 -sucrose. 세포를 화학적으로 고정 후 세포를 씻어 이러한 버퍼 중 하나를 사용합니다.
      1. 트리스 포도당 용액 (10 mM 트리스, 260 mM의 혈당, 9 mM의 아세트산을) 만들 포도당 1.4 g, 트리스베이스 36 mg을 추가하고,초순수에 20 ㎖의 아세트산을 16 μL. 그런 다음, 초순수 30 ml의 최종 볼륨을 조정합니다. 어떤 pH 조정이 필요하지 않습니다. 최대 일주에 실온에서 보관하십시오.
      2. PIPES-수크로오스 (20 밀리미터 PIPES, 200 mM의 수크로오스가) PIPES 0.18 g과 초순수 20㎖를 수크로오스 2.0 g을 추가하고, 농축 아세트산 소량으로 7.4의 pH를 조절할 수 있도록한다. 그런 다음, 초순수 30 ml의 최종 볼륨을 조정합니다. 최대 일주에 실온에서 보관하십시오.
        참고 : 마지막 헹굼에 PBS의 사용을 피하는 이유는 PBS 인산, 염화 칼륨의 농도가 완전히 공기 건조하기 전에 제거되지 않는 경우가 XFM을 방해 할 수 있도록 높은 것입니다.
  5. 셀 도금 용 버퍼를 준비합니다.
    1. 준비 또는 RPMI 배지 1640 모든 미디어를 꺼내, 1X 트립신 EDTA 솔루션, D-PBS, 정상적으로 부착 세포 O를 계대에 대해 수행되어야하는 것처럼 특정 부착 세포주에 필요한 다른 시약F이자, 37 ° C로 예열.

세포의 2. 도금

  1. 층류 후드에있는 창을 포함하는 멸균 배양 접시에 살짝 기울어 져 그것으로 배양 접시의 측면을 따라, 미디어 (100mm 배양 접시에 10 ㎖)에 추가합니다. 불필요한 표면 장력을 생성 또는 질화규소 윈도우의 표면에 직접 떨어지지 않도록 매체. 미디어가 추가됨에 따라, 서서히 도포하는 경사각에게 미디어 그리드 및 창을 완화.
  2. trypsinizing 또는 세포주를 계대를 위해 평소와 같이 판 떨어져 세포를 긁어 적절하게 관심의 부착 세포주를 준비합니다. 신선한 판에 세포를 적용하기 전에 필요한 셀 카운팅, 또는 다른 준비를 수행합니다.
  3. 일반적으로 24-72 시간 이내에 50 % -70 % 합류에 도달하는데 필요한 세포 밀도로 창문 배양 접시에 세포를 추가하고, 5 % 이산화탄소 배양기에서 가습 37 ° C에서 배양한다.
  4. 원하는 세포 밀도 때까지 (보통 50 % -70 %의 합류)에 도달 할 때, 거꾸로 광학 현미경을 사용하여, 때때로 세포의 성장을 관찰한다.

세포의 3. 고정

  1. 구매 한 콘텐츠 (예를 들면 25 % 파라 포름 알데히드)을 희석하고 (시료에 과량의 나트륨을 첨가 회피) 아세트산으로 pH를 7.4로 조정하여 D-PBS 신선한 4 % 파라 포름 알데히드를 준비한다.
  2. 세포가 원하는대로 성장되었습니다 (예 : Hoescht 등) 어떤 중요한 얼룩 적용 군데되었을 때, 한 손으로 45 ° 각도로 접시를 기울이기, 부드러운 흡인하여 미디어를 제거하고 다른 손 피펫으로 흡입 .
    참고 : 대신 피펫 보냈다 미디어, 대안은 창을 집어 두 번 D-PBS와 마이크로 원심 튜브에 창을 찍어 다음 PBS 세척의 2 번 다음에 20 분 동안 고정액 솔루션과 새로운 문화 용기에 배치하는 것입니다 잔류 고정 제를 제거합니다. 이 선택하면, DIR 이동ectly 3.5 단계.
  3. D-PBS로 부드럽게 접시를 씻어 접시의 측면을 향해 45도 각도로 피펫을 접시를 잡고 부드럽게 신선한 4 % PFA / PBS를 추가, 천천히 허용 경사각을 완화하여 즉시 제거 된 액체를 교체 정착액 솔루션은 윈도우를 포함한다. 실온에서 20 분 동안 고정액으로 덮여 세포 보관하십시오.
  4. 약간 접시를 기울 손으로 흡입, 위와 같이 다시, 부드러운 흡인하여 액체를 제거합니다.
  5. 부드럽게, 파이프 / 자당 용액의 일부를 추가하는 단계 3.3에 설명 된 틸팅 및 피펫 팅 방법을 사용하여 제거 된 액체를 교체합니다.
  6. 반복 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다.
  7. 건조 재료를 준비합니다.
    1. 이러한 Kimwipes로 보풀이없는 수건을 수집하고, 매우 빠르고 쉽게 편리 있도록 박스의 밖으로 당깁니다.
    2. 윈도우가 건조 설정하는 깨끗하고 레벨이 아닌 장소를 준비합니다. 능선을 따라서이 전자 현미경에 사용되는 종류의 고무 그리드 매트를 설정이 마를 때 창이 한쪽에 누워 할 수 있습니다. 이는 건조로 건조 표면에 갇히지에서 윈도우를 유지하고, 시료의 나머지 가장자리 버퍼 드레인 것이다.
  8. 조심스럽게 액체에서 창을 개최 창에 부착 된 테이프를 tweeze. 역방향 핀셋을 따기 다음 그들을 떠 갈 수있는 파이프 / 자당의 작은 금액을 적용하고하여 테이프를 벗겨 질 창을 검색합니다.
  9. 조심스럽게 철저하게 (창 자체를 건드리지 않고) 킴과 윈도우의 가장자리에서 초과 파이프 / 크로스를 바르기. 또한 킴 와이프의 둥근 배를 이용하여 다시 들여 영역을 바르기.
    주 : 목표는 가능한 한 윈도우의 표면 상에 염 또는 버퍼의 결정화를 적게하는 것이다.
  10. 그리드 매트에 창을 놓습니다. 창은 격자 매트에 평평하게 누워 있지 않은지 확인하지만, (그리드 매트의 능선을 사용)과 그리드의 한 작은 감동 가장자리에 누워가능한 매트. 윈도우를 건조 시키십시오.

4. 샘플 장착 및 이미지

  1. 샘플이 건조되면, 광학 현미경을 사용하여 Windows에 세포의 존재를 확인합니다. 싱크로트론에 전송을 위해 샘플을 준비하기 전에,이 검증을 수행합니다.
  2. 실험을 호스팅하는 싱크로트론 빔라인 교통을위한 창을 패키지로 제공된다. 부드럽게 한 다음, 유리 슬라이드 상에 양면 테이프를 부착 윈도우 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 테이프로 유리 슬라이드에 부착. 페트리 접시 다물고 테이프입니다.
    참고 : 이전에이 시점에, 다음 단계는 어떤 일반적인 실험실에서 수행 될 수있다. 다음 단계는 가장 싱크로트론 빔라인에서 수행 될 것이다.
  3. 핀셋으로 조심스럽게 창에서 테이프를 제거합니다. 싱크로트론에서 빔라인 협력자가 제공 알루미늄 홀더에 창을 고정, 창 가장자리의 얇은 코팅조차, 매니큐어를 사용한다.
  4. 에 알루미늄 홀더를 삽입운동 마운트 한 다음 X 선 현미경의 위치에 놓습니다. 빔라인에서 샘플 챔버 내부 동력 단계에 연결 브래킷의 샘플을 탑재합니다.
  5. 샘플 X 선 현미경 악기 영역 (납 채워진 벽을 만든 허치), 설치 검사를 종료 한 후. 비디오 십자선과 장착 카메라를 사용하여 샘​​플을 X 선 빔의 위치를​​ 확인하면서, 스캔 샘플의 해당 영역을 선택, 빔라인 특정 소프트웨어를 사용하여 사전 정렬 하류 신틸 카메라.
  6. 관심있는 피쳐의 가장 작은 크기의 추정치에 기초하여 시료에 적합한 해상도를 선택한다. 하나의 포유 동물 세포를 이미징 (~ 크기가 20 ~ 40 μm의)는 0.25-0.5 ㎛의 해상도를 사용합니다. 조직의 촬상 영역, 및 서로로부터 셀을 구분하기위한 층, 2-20 ㎛의 해상도를 사용한다.
  7. met의 양의 추정치에 기초하여 상기 샘플의 적절한 체류 시간을 선택관심 존재의 알. 금속의 높은 양이있는 경우에는 간략하게 검사를 위해 또는 픽셀 당 30 ~ 300 밀리의 체류 시간과 비행 검사를 사용합니다. 작은 물질이 존재하는 경우, 또는, 상대적으로 낮은 풍요의 금속을 측정 픽셀 당 1 ~ 2 초의 체류 시간과 단계 검사를 사용합니다.
  8. 빔라인 특정 소프트웨어로 스캔을 프로그래밍합니다. 래스터 스캔 이미지를 획득. 각 요소에 대해 특징적인 피크 에너지를 식별하는 소프트웨어와 데이터를 분석하는 빔라인 협력자 함께 작업.

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결과

생물학적 시료에 대한 정보를 제공하는 X 선 형광 영상의 능력은 이들 샘플들은 실험의 시간 규모에서 방사선 손상에 견고 이러한 방식으로 제조되는 달려 있으며, 아직 그들의 화학적 및 구조적 특징은 잘 아르 보존. 정착은 셀의 이러한 측면을 (도 1)를 보존 나타내는 - 전술 한 바와 같이 제조 및 묘화 된 시료의 결과를보고에서는, 본 소자의 변동이 있음을 볼 수있다.

반대로, 시료를 살펴봄 것이이 프로세스가 잘되지 않으며, 버퍼가 건조 중에 여전히 존재하는 경우, 본 분자로부터 광범위한 결정 형성은 세포에 구조적 손상을 생성하며 (X 선 형광 스펙트럼의 수집을 방해 그림 2).

이러한 이미지는 픽셀 별 맞춤으로써 생성된다 이미지의 각 지점에서 X 선 형광 스펙트럼. 이는 각 픽셀에서 수집 된 각 스펙트럼은, 개별적으로 분석 한 것을 의미한다. 피팅 된 데...

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토론

X 선 형광 이미징은 지구과학, 재료 과학, 화학 생물학 26-34 등 많은 분야에서 유용하다. 싱크로트론 X- 레이의 발전, 그리고 그들의 초점은 매우 강도 높은 빔을 생산. 집중 X 선은 현재 이용 가능한 실리콘 드리프트 검출기 기술로 측정 할 수있다 신호를 생성하는 현재 존재하는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분한 광선. 그리고 셀 내에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 분야에서 최근 많은 발전을 이용한다 특히 하나의 애플리케이션이다.

그들이 수화 때문에 그러나 X 선 형광 현미경을 사용하여 생체 재료의 연구는 또한, 다른 재료에 대해 특별한 과제를 제시한다. 방사선 손상을 방지하기 위해, 이상적으로 시료 측정시 유리체 얼음 동결 될 것이다. 그러나, 화학 고정 및 공기 건조는 초보자에게 훨씬 더 접근하고, 만약 적절한 금속 일 수있다관심 불활성으로 고칠 거대 분자에 결합하고, 샘플을 이미지화 된 해상도는 건조시 발생할 수있는 초 미세 구조...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 Stefan Vogt가 이 논문에 나타난 대표 데이터를 피팅하는 데 도움을 주고 유용한 논의를 제공한 것에 대해 감사를 표합니다. 저자는 또한 Q. J.에 대한 크리스 제이콥슨의 지지에 감사를 표한다.

아르곤 국립 연구소의 고급 광자 소스, 빔라인 2-ID-E 및 8-BM-B의 사용은 계약 번호에 따라 미국 에너지부, 과학실, 기초 에너지 과학국의 지원을 받았습니다. DE-AC02-06CH11357입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
질화규소 WindowsSilson Ltd/JBJ Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, 영국SiRN-5.0-200-2.0-200. 크기별로 정렬합니다. 멤브레인 크기: 1.5 mm x 1.5 mm. 두께: 200  nm입니다. 프레임 크기: 5  mm x 5mm입니다. 프레임 두께: 200 &m.대체 출처: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
리버스 핀셋Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, 전화: 215-412-8400, 수신자 부담 전화: 800-523-5874, 팩스: 215-412-845078520-5XEMS 5X, NC – 울트라 파인 핀셋
고무 그리드 매트전자 현미경 과학, PO Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, 전화 : 215-412-8400, 수신자 부담 전화 : 800-523-5874, 팩스 : 215-412-845071170원형 그리드 매트
아세트산Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, 전화 : 800-325-3010, 팩스 : 800-325-5052338826미량 금속 등급 농축 아세트산
PIPES 버퍼Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, 전화: 800-325-3010, 팩스: 800-325-5052P6757고체 파이프 버퍼
포름알데히드 원액전자 현미경 과학, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, 전화: 215-412-8400, 수신자 부담 전화: 800-523-5874, 팩스: 215-412-8450RT 1711310 x 10ml 앰플 20% 수성 파라포름알데히드

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