방법 논문

개인 오물 파리에서 인성 세균 병원균의 검출

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DOI:

10.3791/52372

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2015년 2월 13일

 ,  ,  , 
1Center for Food Safety and Applied Nutrition, U.S. Food and Drug Administration

이 논문에서

요약

PCR 기반 프로토콜은 개별 야생포파리의 신체 표면과 소화관에서 Cronobacter spp., Salmonella enterica 및 Listeria monocytogenes를 검출하기 위해 조정되었습니다. 이 프로토콜의 목표는 식품 매개 발병 조사 중 환경 샘플링 프로그램의 일환으로 수집된 개별 곤충에서 박테리아 병원체를 검출하고 분리하는 것입니다.

초록

곤충이 식품 매개 병원체의 중요한 매개체라는 데 만장일치로 합의가 있습니다. 그러나 곤충을 특정 식품 매개 질병 발병을 일으키는 병원체의 매개체로 연결하는 것은 어려운 일이었습니다. 이는 식품 매개 발병 조사 중 환경 샘플링 프로그램의 일환으로 곤충을 무균 채취하지 않고 개별 곤충에서 식품 매개 박테리아를 검출하는 표준화된 방법이 없기 때문입니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 걸음을 내딛기 위해 우리는 식품 및 환경 샘플에서 식품 매개 병원체를 검출하는 상용 PCR 기반 시스템의 프로토콜을 조정하여 개별 파리에서 식품 매개 병원체를 검출했습니다. 이 표준화된 프로토콜을 사용하여 100마리의 자연포획 파리를 대상으로 Cronobacter spp., Salmonella enterica 및 Listeria monocytogenes의 존재 여부를 조사하고 파리 한 마리의 신체 표면과 소화관에서 이러한 병원체를 검출하고 추가로 분리할 수 있음을 입증했습니다. 채취된 야생 파리의 소화관의 22%와 신체 표면의 8%에서 세 가지 식인성 병원체 중 하나 이상에 대해 양성 반응이 나왔습니다. 파리의 신체 어느 한 부분에서 Cronobacter spp.의 유병률은 S. enterica(7%) 및 L.monocytogenes(4%)의 유병률보다 통계 적으로 더 높았습니다. 이 PCR 기반 시스템을 사용하여 S. enterica 및 L. monocytogenes를 검출할 때 모든 PCR 양성 결과에서 순수한 박테리아 배양액을 얻었기 때문에 위양성이 관찰되지 않았습니다. 그러나 PCR 양성 샘플의 약 50%에서 순수한 크로노박터 콜로니는 얻어지지 않았으며, 이는 이 병원체에 대한 PCR 기반 검출 시스템이 야생 파리가 운반하는 매우 복잡한 미생물군 중 존재하는 다른 장내세균과 교차 반응함을 시사합니다. 여기에 제시된 표준화된 프로토콜을 통해 실험실은 무균 채취 곤충에서 박테리아 식품 매개 병원체를 검출할 수 있으므로 공중 보건 공무원은 식품 매개 발병 조사를 수행할 때 식품이 어떻게 오염되었는지 알아낼 수 있는 또 다른 증거를 얻을 수 있습니다.

서론

이들은 식품 또는 식품 접촉 표면 및 식기 한 병원균 확산 할 수 있기 때문에 곤충 식품 관련 질환의 전송에서 중요한 역할을한다. 곤충 중에서, 파리 바퀴벌레, 개미는 식품 매개 병원균의 확산을 선호 행동을 나타낸다. 이러한 행동은 거부 대변, endophily (입력 건물) 및 synanthropy (인간과 동거), 부패 문제와 연관을 포함 2. .. 살모넬라 종으로서 인성 병원균, 리스테리아 균, 캄 필로 박터 아종은 대장균 O157 : H7, 및 Cronobacter 속 (구 엔테로 sakazakii의)의 멤버는 곤충 3-5에 의해 송신되는 것으로보고되었다. Synanthropic 오물 기계적으로 자신의 오염 된 신체 표면으로부터 병원균을 전송하여 식중독 세균을 확산 파리. 그러나, 파리의 소화관에서의 인성 병원균의 존재는 최대 3 회까지 가능자신의 신체 표면 (몸, 머리, 다리, 날개) 5에 관찰 된 것보다 더 큰. 인성 병원체는 또한 신체 표면 -6,7-보다 어떤 경우 시간에 더 큰 길이 플라이 소화관에 남아있을 수 있으며, 이들은 플라이 소화관 4,8,9 식민지화, 승산 할 수있다. 그들은 더 깨끗하게하고 역류 (10, 11)을 통해 인성 병원균을 전파 할 수 있기 때문 파리의 벡터 가능성을 증가시킨다.

요즘, 더 빠르게 식중독의 발생을 감지 할 수있는 감시 시스템이 개선된다. 식중독 발생 조사를 수행하는 동안, 공중 보건 당국은 감염의 원인 (들) 또는 차량 (들) 일 수있다 음식을 찾습니다. 연구자들은 또한 음식이 오염 된 방법을 찾아 관련 시설 (또는 시설)의 환경 영향 평가를 수행 할 수 있으며, 조사 (12)의 일부로서 샘플을 수집 할 수 있습니다. Desp과학 문헌, 인성 병원균의 캐리어와 같은 곤충에 관한 특정 식중독 발생이 도전하고있다 일으키는 병원체의 벡터로 곤충을 연결의 광대 한 양을 ITE. 곤충 무균 인성 발병 조사 환경 중에 샘플링 프로그램의 일부로서 수집되고 있지 않기 때문이다 주로. 곤충, 환경 샘플링 절차, 단일 곤충 제자리에 있어야에서 인성 병원체를 검출하는 표준화 빠르고 민감하고 신뢰성있는 프로토콜의 일부로서, 인성 병원균의 확산을 선호 행동을 나타낼 것이 특히 것들을 포함한다.

곤충에서 인성 병원균의 검출을위한 기존의 도금 기술은 번잡하고, 곤충의 선천성 공생 미생물의 빠른 성장을 극복하기 위해 다양한 배지에서 표적 균의 성장 경쟁력 의존한다. BA와 곤충을 연결 한 대부분의 연구cterial 병원균 여러 함께 풀링 곤충보다는 개별적으로 당에 병원균의 존재를 식별함으로써 상기 방법의 민감도를 증가했다. 따라서, 이들 연구는 병원균 13-18 발견 곤충의 본문 부분을 구별하지 않았다. 이것은 역학적 의미를 가질 수 있으며, 상이한 완화 전략 등의 원인이 인성 병원균 체 표면 또는 개별 곤충의 소화관에 위치인지를 식별하는 능력은 중요하다. 기계 벡터로, 만 감염의 가능성이 더 높은 수준의 전송 병원균의 가능성을 증가 역류 그 파리 반면, 자신의 신체 표면에서 박테리아의 낮은 수준을 전송하고 음식에 똥 수있는 짧은 시간 동안 음식에 그 땅을 날아. 결과적으로, 개별 곤충 당 인성 병원체의 빈도를 추정하고, 곤충, 박테리아 (P)의 신체 부위를 구별하는 것이 중요 athogen가 있습니다.

인성 병원체를 검출하는 독립 배양 방법의 사용이 점차 구현되고 있더라도, 이들은 상업적 단일 곤충에서 인성 병원체를 검출하는데 사용되지 않았다. 현재 상업적으로 산업 및 규제 기관에서 사용중인 식품에서 식품 매개 병원균의 신속한 검출에 사용할 수있는 분자 프로토콜이 확인됩니다. 이들 방법은 음식 샘플의 다양한 병원체 검출을위한 DNA 기반 시스템을 포함한다. 분자 프로토콜 전통적인 도금법보다 빠르게하지만, 시료의 농축 여전히 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 필요한 세균성 병원체의 10 2 콜로니 형성 단위 (CFU) 기반의 방법 (19)의 감도 수준을 얻기 위해 필요하다. 또한, PCR에서 양성 샘플 순수한 박테리아 콜로니를 단리는 적절한 방법을 이용하여 병원체를 확인하는데 필요하다.

콘텐츠 ">이 프로토콜의 목적은 신체 표면에서 인성 박테리아의 검출 및 단일 플라이의 소화관에서 음식과 환경 시료에서 병원균을 검출하고, 추가로 이들을 분리하는 데 시판 PCR 기반 시스템을 표준화하는 여기에 설명 된 프로토콜의 samples.The 감도 병원균 먼저 실험적으로 각각의 세균 병원체의 연속 희석이 공급 된 실험실 사육 성인 하우스 파리 (파리 자리의 domestica에)으로 교정되었다. 표준화 된 프로토콜은 이후 조사하는 데 사용 된 100 야생 적발 신체 표면 및 / 또는 영양 운하에서 인성 병원균의 존재를 파리. 표준화 된 프로토콜은 공중 보건 실험실 인성을 수행 할 때 환경 샘플링 프로그램의 일부로서 수집의 가능성을 허용하는, 해충으로 인한 건강 위협을 검출하도록 허용 할 것이다 발생 조사.

프로토콜

파리의 1. 컬렉션

  1. 멸균 곤충학 스윕 그물을 사용하여 개별 파리를 수집합니다. 쿨러에 그물을 넣어 실험실로 전송.

파리의 2 해부

  1. 7 분 - 5 -20 ° C에서 그들을 배치하여 무균 수집 파리를 고정.
  2. 예열 된 (37 ° C) 완충 펩톤 수 (BPW) 1 ㎖를 함유하는 2 ml의 멸균 튜브에 무균 핀셋을 도시 한 플라이 사용. 2 분 동안 반전에 의해 부드럽게 튜브를 섞는다. 이는 비행의 신체 표면 (S) 상에 존재하는 미생물은 BPW (BPW-S)로 전송 될 수 있도록 비행 전신 매체와 접촉하는 것이 필수적이다. 파리의 수와 신체 부분 (즉, 1S)와 튜브 레이블.
    참고 :이 프로토콜에 언급 된 재료 및 시약에 대한 자세한 설명은 특정 시약 / 장비의 표를 참조하십시오.
  3. 멸균 집게를 사용하면 BPW-S 미디어 및 전송에서 즉시 제거빈 깨끗한 2 ML 튜브에는 즉시 소독 표면에. 소독 및 절개 프로토콜을 수행하는 동안 37 ° C에서 BPW-S를 함유하는 매체를 튜브 인큐베이션.
    1. 갓 준비한 0.05 % (v / v)의 표백 액 1ml에 침지 전에 멸균 증류수로 린스 1 분간 70 % 에탄올 1 ㎖, 그것을 침지 플라이 표면 - 소독. 멸균 증류수로 3 회 씻어. 멸균이 ML 튜브에 마지막 헹굼 물을 전송합니다.
      참고 : 1,000 μL 마이크로 피펫을 사용하거나, 튜브를 반전 비행 튜브 내부에 남아 있는지 확인하여 액체마다 폐기하십시오. 표면 소독 공정의 각 단계에서 반전하여 부드럽게 섞는다.
    2. 상기 살균 공정의 효율성을 평가 트립 토스 대두 한천 (TSA) 플레이트에서 마지막 헹굼 물 100 μl를 전송하고 멸균 L 자형 일회용 균태 확산. 24 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 의 후cubation, 어떤 세균 식민지의 존재를 등록합니다.
      주 : TSA 플레이트에 박테리아 식민지의 존재는 비효율적 인 표면 소독 과정을 나타냅니다. 이 경우 신체 표면 및 소화관 간의 교차 오염을 배제 할 수 없기 때문에, 인성 병원균의 존재는 파리의 신체 표면에보고되어야한다.
  4. 비행 표면이-소독 한 후 멸균 60mm 일회용 페트리 접시에 과량의 물을 제거하기 위해 멸균 된 종이 타월의 조각에 전송합니다.
  5. 해부 범위에 페트리 접시를 놓고 시류 가족 (20, 21)에 대한 이분법 키를 사용하여 종 수준으로 비행을 식별합니다.
  6. 부드럽게 무균 플라이 아웃 항문 전체 소화관 (A)를 당겨 멸균 미세 팁 집게를 사용하여 0.5 mm 지르코니아 / 실리카와 예열 된 (37 ° C) BPW 1 ㎖를 함유하는 다른 살균이 ML 튜브로 전송할 구슬 (BPW-A). 라벨 번째개별 플라이 플라이 (즉 1A)의 몸통 부 선정과 같은 번호 E 튜브.
  7. 세포 파쇄 장치를 사용하여 10 분 - 5 철저히 BPW-A를 함유하는 튜브를 섞는다. 프로토콜의 나머지 부분을 수행하는 동안 36 ± 1 ° C에서 품어.
  8. 바우처 및 / 또는 장기의 표본을 저장, 깨끗한 2 ML 튜브에 파리의 나머지를 놓고 1 추가 - 95 % 에탄올 2 ㎖를.

3. 기본 및 보조 심화

  1. 샘플 수와 파리의 신체 부위에 따라 매체를 포함하는 모든 기본 및 보조 농축 튜브 레이블.
  2. 멸균 후드에서 다음 미디어를 포함하는 2 ml의 튜브를 멸균하기 위해 BPW-S (표면)의 300 μl를 전송 :
    1. 살모넬라를 들어, 예열 (42 ° C) BPW 1 ㎖를 사용합니다. 24 시간 - 22 42.5 ° C로 재순환 수조에서 인큐베이션. 차 농축를 들어, 400 & #에 풍부한 BPW 100 ㎕를 전송181; 이전에 무균 클러스터 튜브에 넣고 예열 (37 ° C) 뇌 심장 주입 (BHI) 국물의 리터. 3 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    2. Cronobacter를 들어, novobiocin와 예열 (37 ° C) BPW 1 ㎖ (, 월러스, M., 개인 통신 (10) ㎎ / L)를 사용합니다. 또한, 차 농축 등의 보충 (반코마이신과 cefsulodin)와 R & F 엔테로 박터 sakazakii의 농축 국물 1 ㎖를 사용합니다. 26 시간 - 22 37 ° C에서 품어. 차 농축를 들어, 이전에 멸균 클러스터 튜브에 넣고 예열 (37 ° C) BHI 국물 400 μL에 novobiocin 풍부 BPW의 100 μl를 전송합니다. 3 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    3. L. 들어 모노 사이토, 선택적 보충 갓 준비 RT 24 리스테리아 농축 국물 (24 LEB) 1 ㎖를 사용합니다. 44 ± 5​​ 시간 동안 37 ° C에서 품어. 어떤 차 농축은 L.의 검출이 필요하지 않습니다 모노 사이토.
    4. BPW-A로 표시 튜브를 사용하여 상기 3.2.3 - 반복 3.2.1 단계를 반복합니다.

대상 식품 매개 병원체의 증폭과 검출을위한 PCR 기반 시스템 4. 준비

4-8 살모넬라 균 (살모넬라 균 2 표준 분석 키트), Cronobacter 종 (E. sakazakii의 표준 분석 키트) 및 리스테리아 균을 선별하기 위해 상용 PCR 자전거 타는 사람 / 검출기 시스템, 컴퓨터 워크 스테이션 및 즉시 사용 가능한 키트를 사용 단계 (L. 24E는 분석 키트 모노 사이토 겐). 표준 분석은 PCR 종점 검출을 사용한다. 각 키트는 이중 가닥 DNA에 결합 할 때 형광 신호를 방출하는 인터 염료와 PCR-준비 정제가 포함되어 있습니다. 신호는 포지티브 또는 네거티브로서 소프트웨어에 의해 해석되는 융해 곡선을 생성 PCR 시스템 프로그램의 검출 단계에서 포착된다.

  1. manufactu의에 의해 지정된 시약 및 장비를 준비합니다각 대상 인성 병원균 당 총통의 프로토콜입니다.
    주 : 살모넬라 Cronobacter를 검출하기위한 프로토콜 L.를 검출 프로토콜 반면 원스텝 용해 과정이 필요 모노 사이토 겐은 두 단계의 분해 과정을 (각각 제 5,6 참조)를 요구한다.
  2. 대상 병원체의 특정 프로그램을 선택 자동화 가열 블록을 켭니다. (- 6.2 단계를 참조 L.가 용해의 2 부 모노 사이토 겐)와 가열 블록 수동 경우 또는, (. 살모넬라, Cronobacter 종 및 리스테리아 모노 사이토 겐) 37 ° C 또는 55 ± 2 ° C의 온도를 설정 95 ± 3 ° C의.
  3. 적어도 2 시간 동안 8 °의 C - 그렇지 않으면 2에 그들을 진정, 냉각 블록 O / N 냉장되어 있는지 확인합니다.
  4. PCR 기반 탐지 시스템의 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 제조사의 지침에 따라 랙 파일을 생성한다.
  5. 레이블 및 클러스터를 배치튜브 랙 파일에 따라, 랙의 용해 시약을 함유.
  6. PCR 기반 탐지 시스템 기기를 초기화합니다.

5. 살모넬라와 Cronobacter의 탐지를 위해 용해를 수행

  1. 용해 완충액의 한 12 ㎖의 병 프로테아제의 150 μl를 첨가하여 용해 시약을 준비한다.
  2. 이전에 표시된 클러스터 각 튜브 용균 시약 200 μL를 전송합니다.
    참고 : - 최대 2 주 동안 8 ° C에서 용해 시약을 포함하는 클러스터 관 2에 저장할 수 있습니다.
  3. 이차 농축 샘플 20 μL가 긴 피펫 팁을 전송하여 용균 시약 200 μl를 함유 클러스터 튜브 대응하는 (단계 3.2.1 및 3.2.2 참조). 각 샘플에 대한 새로운 피펫 팁을 사용합니다.
    참고 : PCR-양 / 음 샘플의 추가 확인 분석을 위해 RT (Cronobacter) 냉장고 (살모넬라) 또는에서 기본 및 보조 농축에서 튜브를 유지합니다.
  4. 용균 시약 200 μl를 함유 클러스터로 멸균 튜브 BHI 매체의 20 μl를 첨가하여 음성 대조군을 준비한다.
  5. 용해 시약 200 μl를 포함하는 클러스터 튜브에 알려진 살모넬라 또는 Cronobacter 균주 (BHI에서 재배) O / N 세균 배양의 20 μl를 추가하여 양성 대조군을 준비합니다.
  6. 캡 클러스터 튜브 단단히 상한 도구를 사용하여 고정합니다.
  7. 대상 병원체의 특정 프로그램을 선택 후 자동화 가열 블록의 클러스터 튜브 랙을 배치합니다. 또한, 10 분 동안 95 ± 3 ° C에서 배양 한 다음 20 분 동안 37 ± 2 ° C의에서 클러스터 튜브를 품어. 5 분 - (8 ° C의 2) 마지막으로, 블록을 냉각 클러스터 튜브를 전송합니다.
    주 : 클러스터 분해물을 함유하는 관은 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

6. L.의 탐지를 위해 용해를 수행 모노 사이토

  1. 의 일부를 수행다음과 같이 용해 :
    1. 완전히 해동 용해하는 제 1의 병에 무균 탈 이온수의 1.8 ML을 추가합니다.
      참고 : 스토어 2에서 제 1 용균 - 사용할 준비가 될 때까지 8 ° C에서. 최대 6 개월 - (30 ° C 20) 실온에서 개방 및 희석, 저장 후.
    2. 1 비율 (희석 용해하는 제 1의 40 μL 각 샘플 당 제 2 용균의 10 μl를) : 4 제 1과 2를 용해하는 결합합니다. 결합 용해제의 양도 50 μl의 튜브를 클러스터에. 4 시간 이내에 혼합물을 사용합니다.
    3. 농축 된 시료의 일차 500 μl를 추가 결합 용해제의 50 μl를 포함하는 클러스터 튜브 (단계 3.2.3 참조).
    4. 결합 용해제 50㎕의 멸균 LEB (24) 500 μL를 첨가하여 음성 대조군을 준비한다.
    5. / N L. O의 500 μl를 첨가하여 양성 대조군을 준비 모노 사이토 문화가 결합 된 용해제의 50 μL 24 LEB 성장.
    6. 클러스터 관을 씌우고 부드럽게 장소 혼합30 분 동안 37 ± 1 ℃에서 가열 블록.
      참고 : PCR-양 / 음 샘플의 추가 확인 분석을위한 냉장고에 차 농축에서 튜브를 유지합니다.
  2. 다음과 같이 용해의 파트 2를 수행합니다 :
    1. 단계 5.1 및 5.2의 지침에 따라 용해 시약을 준비합니다.
    2. 사용하여 긴 피펫 팁 용해 시약 200 μl를 포함하는 클러스터 튜브 부분 하나 해물 20 μl를 전송합니다. 각 샘플에 대한 새로운 피펫 팁을 사용합니다.
    3. 캡 클러스터 튜브 단단히 상한 도구를 사용하여 고정합니다.
    4. L.에 대한 특정 프로그램을 선택 자동화 가열 블록에있는 장소 클러스터 관 모노 사이토. 또한, 10 분 동안 95 ± 3 ° C에서 배양 한 다음 30 분 동안 55 ± 2 ° C의에서 클러스터 튜브를 품어. 5 분 - (8 ° C의 2) 마지막으로, 블록을 냉각 클러스터 튜브를 전송합니다.
      주 : 클러스터 분해물을 함유하는 관은 최대 2 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

7. 수화물 PCR-준비 정제

  1. 냉장 (4 ℃로) PCR 냉각 블록을 선택하고 삽입을 통해 PCR 튜브 랙을 배치합니다.
  2. 랙 파일에 따라, 홀더의 대상 인성 병원균에 대한 (각 키트에 포함 된) PCR-준비 정제를 포함하는 PCR 튜브를 해당 놓습니다.
  3. decapping 도구를 사용하여 조심스럽게 PCR 튜브의 캡을 제거합니다. 캡을 버리고 각각의 튜브는 정제가 포함되어 있는지 확인합니다.
  4. 전송 (살모넬라 및 Cronobacter)에 50 μL 또는 특정 PCR 튜브에 해물 (L. monocytogenes에 대한) 30 μL. 새로운 광학 캡을 사용하고 상한 도구를 사용하여 PCR 튜브에 단단히 고정합니다.
    참고 : - PCR 기반 탐지 시스템에로드 할 때까지 8 ° C의 PCR-준비 정제에 해물을 추가 한 후, 샘플 2의 냉각 상태를 유지해야합니다. PCR 튜브는 전체 볼륨이 바닥​​ t 있는지를 확인하기 위해 몇 초 동안 2,500 XG에서 원심 분리 될 수있다그는 튜브.
  5. 악기 서랍을 열어 PCR 자전거 타는 사람 / 탐지 시스템 악기에 PCR 튜브를 넣습니다.
  6. 서랍에있는 우물에 PCR 튜브 랙을 배치하고 튜브가 올바르게 장착되었는지 확인합니다.
  7. 서랍을 닫고 제조업체의 프로토콜에 의해 설명 된대로 프로그램을 시작합니다.
    참고 : PCR 기반 장비가 각 식품 매개 병원체에 대한 순환 매개 변수를 설정되어 있습니다.
  8. PCR 순환 상태 표시 줄은 프로그램의 증폭 부분이 실행되고 있는지를 나타내는 파란색 막대가 표시되는지 확인합니다.
    참고 : - 전체 3.5 시간 표준 PCR 분석법, 전체 프로그램 (증폭 및 검출)의 처리 시간이 약 3 걸린다.

8. 검토 결과

  1. 처리가 완료된 후, 화면이 샘플 및 평가 결과를 제거 PCR 기반 시스템 기기로부터의 지시에 따라 약.
  2. 표적 병원체는 인성 (하나의 샘플에 존재한다면표면 또는 비행의 소화관은) 잘가 '플러스'기호 (긍정적)으로 빨간색입니다. 병원체가 없으면, 잘은 마이너스 기호 (음수)과 녹색입니다.
  3. 웰이 중심 걸쳐 빨간색 막대 노란색 인 경우, 오류 신호를 나타낸다.

PCR 양성 결과에서 세균 병원체 9. 분리

  1. (L. monocytogenes에 대한) 기본 또는 보조에서 PCR 양성이었다 그 샘플의 농축 (살모넬라 및 Cronobacter에 대한) 선택 튜브. 다음과 같이 PCR 음성이었다 샘플의 5 % 진행 - 또한, 무작위로 3을 선택
  2. 살모넬라의 경우 :
    1. 10 라파 포트 - Vassiliadis (RV) 매체 ㎖의 테트라 티오 네이트를 1 ㎖에 (TT) 국물에 보조 농축 매체의 100 μl를 추가합니다. 24 시간 - 22 재순환 수조에서 42.5 ° C에서 튜브를 품어.
    2. 각 RV의 배양, 연속 3mm의 백금이 (10 μL) 후비스무트 파이트 (BS) 한천, 자일 로스 (xylose)의 라이신 데스 옥시 콜레이트 (XLD) 한천에 개발 TT 미디어 및 Hektoen의 장 (HE) 한천. 24 시간 - 22 35 ± 1 ° C에서 접시를 품어.
    3. 배양 후, 각 미디어에 전형적인 살모넬라 식민지의 존재에 대 한 번호판을 확인합니다. 고립 한 콜로니 여러 계대 단계 후에 수득 할 수없는 경우, 네거티브로서 샘플을 고려 PCR 기반 시스템 위양성으로보고한다.
      참고 : 일반적인 살모넬라 식민지를 들어 특정 미디어 (22)를 참조하십시오. 다섯 추정 전형적인 살모넬라 식민지를 선택하고 BS, XLD에 그들을 배양, 또는 HE 격리 / 단일 콜로니의 순수한 문화를 얻을 때까지.
    4. 하나의 순수한 식민지를 선택하고, 같은 VITEK 2 식별 카드 또는 API 생화학 식별 시스템 등의 생화학 상용 테스트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 추정 살모넬라를 식별합니다.
  3. Cronobacter의 경우 :
    1. 행진 등 R & F 엔테로 박터 sakazakii에 (Cronobacter) 발색 도금 매체 및 / 또는 ChromID sakazakii의 한천로 발색 문화 미디어의 두 접시에 보조 농축 미디어의 3mm의 백금이 (10 μL). 24 시간 - 22 ~ 35 ° C에서 접시를 품어.
    2. 배양 후, (파란색 회색에 블루 블랙) 전형적인 Cronobacter 식민지의 존재에 대 한 번호판을 확인합니다. 5 추정 Cronobacter 식민지를 선택하고 절연 / 단일 콜로니의 순수한 문화를 얻을 때까지 R & F 엔테로 박터 sakazakii에 (Cronobacter) 발색 도금 매체, ChromID sakazakii의 한천, 또는 TSA에 그들을 배양.
      주 : 고립 한 콜로니 여러 계대 단계 후에 수득 할 수없는 경우, 네거티브로서 샘플을 고려-PCR 기초 검출 시스템 위양성으로보고한다.
    3. 하나의 순수한 식민지를 선택하고 생화학 commer를 사용하여 추정 Cronobacter를 식별제조업체의 지침에 따라 같은 VITEK 2 식별 카드 또는 API의 20E 생화학 식별 시스템 등 인공 테스트.
  4. L. 들어 모노 사이토 :
    1. 킬 광택 리스테리아 한천의 두 접시 (BLA)의 기본 농축 미디어의 3mm의 백금이 (10 μL). 26 시간 - 22 36 ± 1 ° C에서 접시를 품어.
    2. 배양 후, 추정 L.의 존재에 대 한 번호판을 검사 모노 사이토 (파란색 녹색) 식민지. 선택 5 추정 L. 모노 사이토 식민지와 격리 / 단일 콜로니의 순수한 문화를 얻기까지 BLA에 그들을 배양. 26 시간 - 추가 (22) 36 ± 1 ° C에서 음극판을-품어 다시.
    3. 하나의 순수한 식민지를 선택하고 추정 L.를 식별 제조업체의 난 다음, 이러한 VITEK 2 식별 카드 또는 API 리스테리아 생화학 식별 시스템 같은 상용 생화학 검사를 이용하여 모노 사이토 겐nstructions.
  5. 곤충에서 분리 추정 식 인성 병원균 더 확인과 기준 실험실에서 혈청 중화되어야한다.

결과

C.의 -이 프로토콜은 처음 실험적으로 액체 플라이 음식 (2 % 분말 우유)를 포함 희석액 (10 8 CFU / ㎖ (10) 2) 24 시간 동안 공급 된 실험실 양육 집 파리의 집합에 교정되었다 sakazakii에, S. 엔테, L. 모노 사이토, 또는 C. jejuni와 (N = 21 각 세균성 병원체에 대한). PCR 기반 시스템은 신체 표면과 실험적으로 공급되는 단일의 소화관에서 박테리아의 낮은 레벨 (× 102 CFU / ㎖)를 검출 할 때까지 보충 미디어뿐만 아니라, 배양 시간 및 온도는 각각의 인성 병원체 조정 하였다 비행. 프로토콜 절에 설명 농축 매체 및 조건을 이용하여, PCR 기반의 시스템은 검출 된 C. sakazakii에, S. 엔테 및 L. 박테리아 접종원> 103 CFU / ㎖ (도 1a)로 공급되는 파리의 100 %의 본체 표면으로부터 모노 사이토 겐. 파리 10 먹였다 때2 CFU / ㎖, C.의 검출 백분율 sakazakii에, S. 엔테 및 L. 신체 표면으로부터 모노 사이토 겐은 100 %, 66 % 및 33 %, 각각 (도 1a)을 하였다. PCR 기반 시스템은 비율 ≥33 % (그림 1B)에서 모든 세균 농도가 공급 파리의 소화관에서이 세 가지 인성 병원균을 발견했습니다. 그러나, C.의 검출 실험실에서 사육 파리가 실험적으로 액체 음식이 가장 높은 세균 접종 (10 8 CFU / ㎖)를 함유가 공급 될 때 jejuni와는 달성되었다. 따라서, C. 이 PCR jejuni에 기반 탐지 시스템을 사용하여 개별 synanthropic 오물 파리에서 시험 될 수 인성 병원균 군에서 제외 하였다.

이 표준화 된 프로토콜로, 우리는 Cronobacter 종의 유병률을 확인 할 수 있었다., S. 엔테 및 L. 신체 표면 및 / 또는 모노 사이토 겐에서 번째개별적으로 무균했다 M.를 포함하여 최소 6 종의 대표이었다 5 수집 된 오물 파리 워싱턴 DC의 수도권 지역에 위치한 열 도시의 레스토랑의 쓰레기 수거통 지역에서 잡힌 100 야생 파리의 전자 소화관 domestica에 (47 %)의 Lucilia cuprina (33 %), L. sericata (14 %)의 Cochliomyia macellaria (2 %), Sarcophaga haemorrhoidalis (2 %), 및 Ophyra의 leucostoma (1 %). 하나의 플라이는 단지 가족의 레벨로 확인되었다 (Anthomyiidae; 1 %). 표면 소독 프로토콜은 어떠한 박테리아 성장이 각 플라이의 최종 살균 세정 물로부터 TSA 플레이트상에서 관찰되지 않았기 때문에 파리의 신체 부위 사이의 교차 오염을 방지하는데 효과적이었다. 따라서, 구분은 각 비행의 신체 부위에 존재하는 인성 박테리아 사이에 할 수있다.

어떤 잘못된 반응은 신체 표면의 샘플의 소화관에서 검출되지 않았다개별 S. 파리의 검출이 상용 PCR 기반의 시스템을 사용할 때 엔테와 L. 모노 사이토, 한천 접시에 가능한 병원체의 확인은 PCR-긍정적 인 결과와 일치했다. 그러나 Cronobacter 종의 순수한 배양 물을 분리 할 수 없었다. 모든 PCR 양성 샘플에서. 따라서, 기준이 병원균의 검출은 PCR 기반 (; 9/18 50 %) 및 ​​소화관 (48 %; 33분의 16) 단일 자연산 파리의 시스템은 신체 표면에서 잘못된 반응을 보였다. 특정 미디어에 도말 임의로 선택된 PCR 음성 샘플은 인성 병원균의 유무를 확인했다. Cronobacter 종을 검출하기 위해 상용 PCR 기반의 시스템을 사용하는 경우에 따라서, 위음성은 어떤 샘플에서 검출되지 않았다., S. 엔테, 또는 L. 모노 사이토.

만 병원체가 분리 확인되었다 그 PCR 양성 샘플을 양성으로 하였다그리고 통계 분석을 위해 포함. 자연산 오물 파리의 소화관에서 식품 매개 병원균의 전체 존재 (DF = 1, P = 0.0087 χ 2 = 6.8772) 신체 표면에보다 유의하게 높았다. 영양 운하 22 % 수집 야생 파리의 신체 표면의 8 %가 세 인성 병원균 중 적어도 하나에 대해 (도 2) 양성이었다. 전반적으로, Cronobacter 종의 유병률. S.의 유병률보다, 몸 표면 또는 수집 된 파리의 영양 운하 중 하나에 (피셔의 정확한 테스트 p = 0.0165 19 %) 통계적으로 높았다 엔테 (7 %) 및 리스테리아 모노 사이토 겐 (4 %). 각각의 세균 병원체 (그림 3 파리의 신체 부위 사이의 쌍으로 비교를 수행 할 때, 통계적으로 유의 한 차이는 관찰되지 않았다; Cronobacter에 대한 피셔의 정확한 테스트 P = 0.1464, P = 0.1184, 및 P = 0.6212SPP., S. 엔테 및 리스테리아 모노 사이토 겐, 각각). 파리 중에 평가 세 가지 병원균에 대한 긍정적 인 없었다. 그러나, 파리 (두 L.의 cuprina 한 L.의 sericata) 실시 살모넬라 종의 세. 및 L. 표면 또는 소화관에서 모노 사이토 겐.

figure-results-1
(A) 신체 표면과 (B) 다른 세균 접종을 포함하는 액체 음식을 공급 개별 실험실 양육 집 파리의 소화관에서 Cronobacter의 sakazakii에, 살모넬라 엔테, 리스테리아 및 캄 필로 박터 jejuni에 그림 1. 검출 수준 (N = 각각의 세균 병원체에 대한 (21), n​​은 각각의 세균 농도 당 = 3).

figure-results-2
몸 표면과 개별 파리의 영양 운하의 그림 2. 비율은 대상 인성 병원균의 긍정적 발견했다.

figure-results-3
Cronobacter 종의 그림 3. 보급., 살모넬라 엔테 및 신체 표면에서 리스테리아 및 synanthropic 자연산 파리의 소화관. 보고 된 P 값이 신체 표면 및 세균성 병원체에 대한 각 소화관 페어 사이에서 비교되어 (피셔의 정확한 시험, P 값 <0.05는 통계적 유의성을 나타낸다). 저작권 © 미국 미생물 학회, 응용의 저널 및 환경 미생물학 (78) (22) 7891-902, 2012 년 도이 : 10.1128 / AEM.02195-12.

토론

정확하게 식품 또는 식품 관련 환경 (13, 15)의 단일 플라이의 존재의 식품 관련 위험을 평가하는 데 필요한 정보를 포함하지 않을 수 있습니다 프로토콜의 큰 다양성을 사용한 야생 곤충에서 인성 병원균을 검출 한 이전의 연구, (23, 24). 여기서, 우리는 표준 프로토콜을 사용하여,이를 감지하고 Cronobacter 종을 분리하는 것이 가능하다는 것을 보여 주었다., S. 엔테 및 L. 신체 표면과 야생에서 잡은 단일 파리의 소화관에서 모노 사이토 겐. 곤충 대상 인성 병원체의 낮은 숫자 및 다른 토착 미생물 25,26 높은 번호를 운반 할 수 있기 때문에,이 프로토콜은 표적 인성 병원체의 검출 감도를 높이기 위해 특정 배지에서 샘플의 주 (때때로 보조) 농축을 필요 . PCR 기반 탐지 시스템의 결과는 dete 위해 (약 30 시간 내에서 얻어졌다Cronobacter 종의 ction의. 그리고 S. 엔테) 및 초기 샘플을 처리 한 후 L. 모노 사이토 겐)의 검출을 위해 48 시간 (. 따라서,이 프로토콜은 신뢰성뿐만 아니라 신속하고 인성 병원균의 존재에 대해 하나의 비행을 화면에 충분히 민감하다.

가능한 박테리아의 PCR 양성 결과의 확인 및 분리는 많은 실험실 표준 운영 절차의 일부입니다. 또한, 역학을 위해 PCR 양성 샘플에서 세균 배양 물을 순수한 추가의 확인 및 생화학 적, 면역 학적, 또는 유전 적 방법을 이용하여 인성 병원체 혈청 요구된다. 더 잘못된 반응이 관찰되지 않았다하더라도 S.을 검출 할 때 엔테와 L. 단일 자연산 파리의 신체 부위에서 모노 사이토는,이 프로토콜을 사용하여, 우리는 Cronobacter 종에 대한 오탐 (false positive)의 50 % 속도까지 발견했다. 이 제안 그 속 Cronobact에 대한 PCR 기반 탐지 시스템어 파리에 의해 실시하는 매우 복잡한 미생물 사이에 존재하는 다른 장내 세균과 교차 반응 할 수있다. 따라서, 분리 및 PCR 양성 샘플에서 속 Cronobacter의 순수한 식민지의 정화는 평가 다른 병원균보다 더 선택적 도금을 필요로한다.

이 프로토콜은 주로 Cronobacter 종의 존재에 대한 개별 자연산 파리 화면 표준화되었습니다., S. 엔테 및 L. 상용 PCR 기반 탐지 시스템을 사용하는 모노 사이토. H7 (어느 대장균 O157 사용 : H7 MP 표준 분석 키트 또는 대장균 그러나이 프로토콜은 또한 쉽게 ​​출혈성 대장균 O157 다른 인성 병원균의 존재를 단일 파리의 신체 부위를 선별 적응시켰다 O157 : 실시간 분석 키트 H7)과 시가 독소 E. 게시 취소 대장균 (STEC) 그룹 (실시간 STEC 제품군을 사용), 취득 감도> 80 % (에드 데이터). 또한,이 프로토콜은 잠재적 질환 (바퀴벌레, 개미)의 공지 된 다른 벡터를 곤충에서 인성 병원균을 검출하도록 적응 될 수 있지만,이 영역에서 더 많은 연구가 필요하다.

인성 질병 발병 조사는 매우 동적이며 특정 상황 인 로컬 환경 12,27 조사에 따라 달라질 수있다 다단계 과정을 포함한다. 그들은 미래의 질병을 방지하여 즉시 공중 보건 보호 기능을 제공하기 때문에 이러한 조사는 중요하다. 또한 이러한 조사는 인성 미생물이 분산되어있는 새로운 메커니즘을 규명, 연구 (28)에 대한 새로운 영역으로 이어질 중요한 질문을 제기 할 수 있습니다. 조사 기술뿐만 아니라, 표준화 된 신속하고 민감한 프로토콜은 각각의 곤충에서 인성 병원균을 검출하기위한 필요하다. 이 표준화 된 프로토콜은 와트, 무균 파리 같은 곤충을 수집 할 수있는 기회를 엽니 다HICH는 환경 샘플링 프로그램의 일환으로, 식중독 세균 병원체를 벡터로 할 수 있습니다. 이에서 얻을 수있다 역학적 정보는 곤충에 의해 인성 병원균의 전송 메커니즘의 정확한 사진을 작성하는데 사용 될 것이다 (즉, 노출 시간의 길이, 방문 파리 대 방문 대변을 봤 거든 및 역류에 의한 비행).

어떤 유일한 적절한 시스템을 의미하여 마지막으로, 여기에 설명 된 상용 PCR 기반 탐지 시스템을 사용하는 것이 실용적이며, PCR 증폭과 속 레벨 앰플 리콘의 시각화를 간단하게하더라도, 그것은 없다. 농축 된 시료에서 해물 대안 공개적 가능한 종 특이 프라이머 쌍을 사용하여 인성 병원균의 존재를 스크리닝하는데 사용될 수있다. 그러나, 검출 감도는 사용하기 전에 입증해야한다.

공개 사항

특정 기기의 사용은 미국 식품의약국(FDA)의 보증이 아닙니다. 저자는 이 기사에서 논의된 자료와 관련하여 금융 기관과 이해 상충이 없음을 인증합니다.

감사의 글

원고를 비판적으로 검토해 준 미국 식품의약국(FDA), 식품안전 및 응용영양센터(CFSAN)의 Ben D. Tall, Yi Chen, Thomas Hammak에게 감사드립니다. 저자는 또한 실험실 지원을 해준 Hannah Lee(연구 인턴십 프로그램, 메릴랜드 대학교 JIFSAN(Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition))와 비디오에 표시된 개략도의 그림을 준비한 David Weingaertner(FDA, CFSAN)에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
비스무트 아황산염(BS) 한천Fisher ScientificR452402*여러 공급업체.
뇌 심장 주입(BHI) 국물Becton, Dickson and Company299070*37°C로 예열. 여러 공급업체.
Brilliance Listeria 한천 (BLA)Fisher ScientificCM1080B*여러 공급업체.
완충 펩톤 물 (BPW)Becton, Dickson and Company212367* 37°C로 예열; C 또는 42°C. 다수 공급자.
Brilliance Cronobacter 한천(Druggan-Forsythe-Iversen 제형/DFI)Fisher ScientificCM1055B*여러 공급업체.
chromID Sakazakii 한천bioMé rieux43741*문의 전화: 800.682.2666
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) 발색 도금 매체R & F Laboratories다양한*정보 문의: +1.630.969.530
R & F Enterobacter sakazakiii 농축 육수 및 보충제R & F Laboratories다양한*정보 전화: +1.630.969.530
Hektoen enteric (HE) 한천Fisher ScientificOXCM0419B*여러 공급업체.
24 리스테리아 농축 육수 (24LEB)OxoidCM1107*실온에서 갓 준비. 여러 공급업체.
리스테리아 선택적 농축 보충제OxoidSR0243*여러 공급업체.
NovobiocinFisher ScientificOXSR0181E*여러 공급업체. 2-8 °에 저장; C
Vancomycin 염산염 수화물Sigma Aldrich8619872-8 °에 저장; C
Cefsulodin 나트륨 염 수화물시그마 AldrichC81452-8 °에 저장; C
Rappaport-Vassiliadis(RV) 매체Fisher ScientificCM0669B*여러 공급업체.
테트라티오네이트(TT) 육수Becton, Dickson and Company249120*여러 공급업체.
Trypticase soy agar (TSA)Becton, Dickson and Company236930*여러 공급업체.
크실로스 라이신 데옥시콜레이트(XLD) 한천Becton, Dickson and Company221284*여러 공급업체.
API 생화학 식별 시스템bioMé rieux다양한*정보 문의: +1.800.682.2666
VITEK 2: 제품 안전성bioMé rieux다양한*정보 전화: +1.800.682.2667
BAX System Q7DuPont
BAX E. sakazakii 표준 분석 키트DuPontD11801836
BAX L. monocytogenes 24E 분석 키트DuPontD13608125
BAX Salmonella 2 표준 분석 키트DuPontD14368501
캡핑 도구DuPont
디캡핑 도구DuPontD11134095
PCR 튜브 랙/홀더DuPontD12701663
깃털급 집게, 와이드 팁BioQuip4750사용 전 멸균하십시오. 여러 공급업체.
미세한 점, 곧은 팁 집게BioQuip4731사용 전에 멸균하십시오. 여러 공급업체.
지르코니아/실리카 비드, 0.5mmBio Spec Products, Inc.11079105z여러 공급업체.
페트리 접시 - 60X15mmFisher Scientific08-772B여러 공급업체.
일회용 접종 루프, 10µ LFisher Scientific22-363-606여러 공급업체.
L자형 세포 스프레더Fisher Scientific14-665-230여러 공급업체.
마이크로 원심분리기 튜브, 2mlFisher Scientific다양한필요할 때 사용하기 전에 살균하십시오. 안전한 뚜껑을 사용하는 것이 좋습니다. 여러 공급업체.
클러스터 튜브Fisher Scientific05-500-13
클러스터 튜브 캡Fisher Scientific05-500-23
차아염소산나트륨(액체 염소 표백제)*물로 0.05%로 희석합니다. 여러 공급업체.
멸균 탈 이온수여러 공급 업체.
멸균 증류수여러 공급업체.
에틸 알코올 190 proof*필요할 때 물로 70%까지 희석합니다. 여러 공급업체.
지니 세포 교란기, 120V - 1.5ml 및 2.0ml 마이크로튜브용Scientific Industries, Inc.SI-D238여러 공급업체.
난방 블록여러 공급 업체.
냉각 블록여러 공급업체.
재순환 수조여러 공급업체.
스테레오 현미경여러 공급업체.
원심분리기여러 공급업체.
인큐베이터:여러 공급업체.
D11677028:

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