방법 논문

마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델

DOI:

10.3791/52375

⸱

2015년 1월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 갈비뼈에서 뼈의 일부를 성공적으로 절제하는 것입니다. 이 절차는 대규모의 긴 뼈 복원을 연구하기 위한 모델로 개발되었습니다.

초록

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이 프로토콜은 마우스 리브를 이용하여 대규모 뼈 수리에 대한 새로운 모델 연구원을 소개합니다. 주변 늑간근에서 원하는 리브 노출 흉추 원통 벽을 개방 기흉 유도없이 리브의 원하는 부분을 절개하고, 절개 폐쇄 수술에 대한 동물의 제조 : 절차는 다음과 같은 세부. 팔다리 뼈대의 뼈에 비해 매우 리브 접근 가능하다. 인접한 리브 자연 고정을 제공하기 때문에 또한, 더 내부 또는 외부 고정 장치는 필요하지 않습니다. 수술은 시판 공급 장치를 사용 배우기 간단하고, 동물에 의해 잘 용납입니다. 절차 또는 주변 골막을 제거하지 않고 수행 할 수 있기 때문에 보수 골막에의 기여가 평가 될 수있다. 2 개월 - 결과는 골막이 유지되는 경우, 강력한 수리 (1)에서 발생하는 것을 나타냅니다. 우리는 것이 프로토콜의 사용을 기대리브 수리에 대한 연구를 자극하고 결과는 몸 주위에 다른 위치에서 뼈 수리를 자극 할 수있는 새로운 방법의 개발을 촉진됩니다.

서론

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골격 손상, 만성 관절염을 쇠약하게하고, 재건 수술과 관련된 심각한 문제는 경제 생산성, 가족 복지, 삶의 질에 영향을. 작은 휴식과 병변이 상당히 잘 치유 할 수 있지만, 인간의 구조와 기능을 복원 재건 절차에 의존해야하므로 큰 결함을 수리하고 할 수 없습니다. 재건은 동종 또는 heterogeneic 이식, morcellized 뼈 이식 비계, 또는 사지 연장술을 포함 할 수있다. 불행하게도,뿐만 아니라 이러한 치료하지만 수리 뼈의 원래 강도가 거의 달성하지 않습니다와 관련된들이 지속적인 병적 요인이있다. 따라서, 새로운 임상 적 접근 방법이 필요하다.

분절 결함을 치료하는 혁신적인 방법을 개발 일방향 대규모 수리 자연스럽게 발생하는 상황을 연구하는 것이다. 포유 동물이 일에 제한 간주하는 동안 양서류는 유명 골격 요소를 재생성 할 수 있습니다능력이다. 그러나, 20 세기 초반 이후, 인간의 리브의 재생의보고는 적다 인간 그렇게 1-4 한정되지 않을 수 있음을 제안 발표되었다. 현재 이러한 현상은 제일 턱, 얼굴 및 귀 재건 리브 재료를 사용하여 성형 외과 의사에 의해 공지되어 있지만, 5보다 폭넓게 이해되지 않는다. 더 자세하게 수리를 연구하기 위해, 우리는 마우스를 사용하여 외과 적 모델을 개발 하였다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 연구자들은 관련된 선천적 요인을 파악하고 다른 위치에서 골격 치유를 촉진하기 위해이 정보를 사용할 수있다.

수리 골격을 연구 모델로서 리브를 사용하는 많은 장점이있다. (6,7 대퇴골의 절제에 비해) 우선, 주변 리브 천연 고정구를 제공한다. 이것은 내부 및 외고정의 이환율의 위험을 감소하고 수술을 단순화합니다. 가슴 워싱턴의 두 번째로, 얇은 근육 층쉽게 액세스 및 두개골 절제술 (8)의 편의에 대한 분석은 비교할 수 있도록 우수한 가시성을 제공 할 것이다. 셋째, intramembranous 골화, 연골 골화에 의한 리브 형태로 구성하고 중앙 골간의 양쪽 끝에있는 성장판의 확장을 통해 길이 성장 calvariae 대조적으로. 따라서, 리브의 수리는 사지 골격의 긴 뼈의 수리에 더 비교 될 수있다. 더욱이, 우리는 대퇴골에 비해, 리브의 골막가 두껍고보다 쉽게​​ 조작 할 수 있음을 발견 하였다. 따라서, 골막을 공부하거나 세포 치료, 약리 에이전트를 테스트 및 / 또는 조직 비계의 목적을 위해 뼈 수리를 분석하고자하는 연구자들은이 수술 모델이 유용 할 수 있습니다. 요약하면,이 리브 절제 모델은 일반적으로 사용하는 이러한 모델은 현재 존재하지 않기 때문에 포유 동물에서 자연 대규모 뼈 수리를 공부하는 내에서 컨텍스트를 제공합니다.

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프로토콜

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참고 : 모든 절차가 남부 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 동물 프로토콜에 따라 있습니다.

수술 1. 준비

  1. 필요한 수술 도구 및 소모품의 레이아웃 (1 항목 살균 - 재료 목록 18)과 해부 현미경 및 후드 또는 하강 기류 테이블에 광섬유 트랜스 조명을 정렬합니다.
  2. 마취를 유도하기 위해 4 % 이소 플루 란과 유도 챔버 (3 개월 - - 30 G, 1 ~ 20) 성적으로 성숙한 마우스를 놓습니다.
  3. 발 및 / 또는 꼬리 핀치 테스트 마취를 확인합니다.
  4. 수술 중 안구 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 연고를 적용합니다.
  5. 현미경 단계로 마우스를 이동합니다. 유지 보수 호스의 코 콘에 마우스를 놓고 옆에 위치. 체온을 유지하는 데 도움 동물에 인접한 온난화 파우치를 제공합니다.
    하지E :. 마우스의 위치는 개인 취향 및 / 또는 외과 의사의 손 방향에 따라 달라집니다, 왼쪽 또는 오른쪽 중 어느 쪽이 괜찮습니다.
  6. 유지 보수를 위해 3 %, 그리고 속도를 호흡 시계 - 2 이소 플루 란을 조정합니다.
  7. 25 G 바늘 수술 후 통증 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏) 피하 (다리의 측면 측면)를 주입한다. 다리는 정상 응답 인 트 수 있습니다.

2. 열기 절개

  1. 촉진하여 원하는 리브를 감지하고, 면도기로 머리의 영역을 취소합니다.
    참고 : 갈비뼈 1-7 폐에 근접하고 11-13 상당히 짧은 때문에 갈비 8-10 권장합니다. 갈비뼈를 계산하는 숫자 1과 가장 주동이의 리브와 함께 시작해야한다.
  2. (3 배는 종종 동물 사용 프로토콜에 의해 권장) 포비돈 - 요오드 및 이소프로판올 (70 %) 보라고 번갈아 영역을 준비합니다.
  3. 바로 위에, 피부를 통해 2cm 절개를 잘라 중간 크기의 미세 가위로 원하는 리브 평행. Incis기본 근육과 지방 레이어를 통해 전자.
  4. 절개의 크기를 최소화하면서 수술 영역을 노출 트랙터에 3 층 (피부, 근육, 지방)을 놓습니다.

3. 리브를 절개

  1. 5.0 mm 메스와 리브의 원하는 부분을 덮는 늑간 근육을 잘라. 리브와 같은 높은 곡선 아닌 경우이 같은 chondrocostal 관절 위치 5mm 근위 약이 절개입니다. 조심스럽게 좋은 팁 집게로 뼈에서 근육을 분리합니다.
  2. 동물의 골막을 유지하면서 절제를 만들려면 5.0 mm 메스와 리브의 길이를 따라, 골막을 통해 잘라. 조심스럽게 좋은 팁 집게 옆으로 기본 뼈에서 골막을 분리합니다. 골막은 매우 섬세하고 젤라틴 일관성을 가지고 있으므로주의를 진행합니다.
  3. 다음에 미세한 마이크로 가위 일단 뼈 통한 단면을 만든다. 필요한 경우와 절제를 측정현미경 또는 통치자 형 게이지 레티클. 그런 다음 조심스럽게 골막에서 뼈를 들어 올려 다른 쪽 끝을 잘라.
    참고 :주의를 진행합니다. 이 흉막 막을 찢고 기흉 발생합니다 아래 리브를 절개하지 않고 잡아 당겨 같은 가장 섬세한 작업이다. 흉막 막이 찢어진 경우 흉강의 내부가 보이는 될 것 같은이 쉽게 알 수있을 것입니다.
  4. 출혈을 멈추게하기 위해 5 초 - 출혈이 뼈를 절단의 결과로 발생하는 경우, 4 면봉을 잘라 끝에서 압력을 적용합니다.
    참고 : 드문 경우에 출혈이 계속, 그것은 중지하고 동물 회복이 손상 될 상당한 혈액 손실을 안락사 할 필요가있다 (유체 교체없이, 안전하게 손실 될 수있는 최대 혈액량은 전체 혈액량의 10 % 7.7 -.) 200 μL 9 - 8 μL / g는 25g 마우스의 경우, 이것은 180에 해당합니다.
  5. 즉시로 제거 리브를 배치향후 분석을 위해 4 % PFA.
    주 : 뼈와 골막 모두 절제 행하는 것이라면, 골막 절개 박리 (단계 3.2)을 생략합니다. 골막은 매우 밀접하게 흉막 막에 부착되어 있기 때문에 눈물을 방지하기 위해 집게와 떨어져 흉막 막에서 리브를 괴롭 히고, 조심스럽게 진행합니다.

4. 절개 닫기

  1. 9-0 봉합 (2 봉합은 일반적으로 충분하다)와 나머지 골막 슬리브의 맨 위에 늑간 근육을 봉합. 수술 위치에 대한 지표 역할을 직접 리브의 절단 끝 위의 봉합을 놓습니다.
  2. 견인기를 제거합니다. (- 4 봉합 충분하다 3) 9-0 봉합과 상부의 근육과 지방을 봉합. 근육 및 / 또는 지방 특히 두꺼운 층 쥐에서 별도로 각 레이어를 봉합 (예를 들어, 근육 층의 봉합의 1 층과 지방층을위한 봉합의 1 층).
  3. 닫기(- 5 봉합 충분하다 4) 7-0 봉합사로 피부.
  4. 큰 집게와 함께 가장자리를 곤란, 봉합 접착제 절개를 고정합니다.
  5. 천천히 처음 몇 분 동안 1 %로 조정하여 오프 이소 플루 란 마우스를 탈피하고 전원을 껐다 켜십시오.
  6. 가열 램프 아래에 마우스를 놓고 의식이, 5 회복 될 때까지 남겨 - 10 분. 의식이 회복 된 후 치유 기간 동안, 마우스를 이동하고 일반적으로 ambulate과 고통의 흔적을 보여주지해야한다.

5. 복구 및 분석

  1. 0.5 MG에서 경구 용 젤라틴 형태의 부 프레 노르 핀의 관리를 포함하여 수술 후 통증 관리를 제공 / 48 시간 동안 매 12 시간을 kg. 경구 투여는 흉부 지역에 통증이 발생할 수 있습니다 동물을 억제 할 필요가 없습니다.
  2. 치료 기간 동안 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 케이지에 마우스를 유지한다. 절개 부위가 건조 후, 여성 동물 남성 동안 공동 수용 할 수있다의 싸움을 방지하기 위해 절연되어 있어야합니다.
  3. 치유 기간이 지나면 안락사에 대한 승인 절차를 따르십시오. 고정 및 분석을 위해 갈비뼈를 제거합니다.

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결과

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동물은 일반적으로 절개가 잘 치유,이 과정에서 신속하게 복구하고, 동물은 정상적인 동작을 나타낸다. 절차는 시판 공급 장치를 사용하고 실시 후, 1 시간에 따라 완성 될 수있다. 실험 데이터를 생성하는 절차를 사용하기 전에, 어떤 큰 뼈 조각이 절제 영역 내에 남아있을 수 있는지 확인 일 0 시점 절제술을 분석하는 것이 중요하다. 이것은 전형적으로 특별한 방사선 안전 승인을 필요로하더라도 적절한 절차를 평가하는 한 가지 방법은, 수술 후 X 선 또는 microCT 촬상 의해 동물을 평가하는 것이다. 대신, 또 다른 간단한 평가는도 1a에 도시 된 바와 같이 골격 염색 준비 수행함으로써 완성 될 수있다. 이것은을 EtOH에 고정, 흉곽를 수집 포함하고, 알리자린 레드 염색 표준 프로토콜 11을 사용. 그것은 그쪽 때문에 (부드러운 조직을 멀리 소화하는 데 사용) 수산화 칼륨을 생략하는 것이 유용 할 수 있습니다원한다면 여전히 표본 t 조직학 분석을 위해 나중에 사용될 수있다. 샘...

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토론

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처음이 프로토콜을 학습 할 때, 어디에서 문제가 될 수있는 초기 절개를 찾을 수 결정. 그러나 안락사 마우스에 연습 외과 의사가 초기 절개를 배치하고 절제 할 원하는 리브 노출 위치를 배울 수 있습니다. 시체에서 작업도 또는 골막없이 리브 부분을 제거하는 데 필요한 미세 운동 능력을 향상시킨다. 또한,이 절차에 새로운 사람이 훌륭한 도구와 얇은 봉합을 조작하는 것은 어려운 할 수없는 경우도 있습니다. 오프 묶는 동안, 초과 봉합에 당기는 조직을 찢어 수 있습니다. 따라서, 시체에 일부 연습 봉합 도움이 될 수 있습니다. 외과 의사가 설치류와 수술에 새로운 마지막 경우, 그것은 다른 사람이 처음 몇 수술 중 감시 및 마취 조정을 지원하는 것이 유용 할 수있다.

이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 흉막 스파 (기흉을 유발하지 않고 공기의 이상 수집을 뼈를 절제한다흉막 막 수술 닫 너무 얇은 때문에 어려운 CE)는 마우스에 치료하는. 리브 열등 근육과 정수리 늑막의 층은 매우 얇고 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다

감사의 글

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원고를 비판적으로 읽어주신 Mariaani 연구실 구성원들에게 감사드립니다. 우리의 자금 출처는 다음과 같습니다: Baxter Medical Scholar Research Fellowship(M.K.S.로), USC 학부 펠로우십 및 Provost, Dean Joan M. Schaeffer 및 Rose Hills Fellowships(M.K.S.로). 우리는 또한 Pasadena City College(T.T.T로)를 통해 CIRM BRIDGES 펠로우십을 인정합니다. James H. Zumberge Research and Innovation Fund, USC 재생 의학 이니셔티브 및 NIAMS NIH는 Award Number R21AR064462(F.V.M에).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
중형 미세해부 가위(Vannas-Tü bingen 스프링 가위 5mm)Fine Science Tools15003-08
Fine Micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)Fine Science Tools15000-04곡선 팁이 유익합니다.
마이크로 메스 5.0mmFine Science Tools10315-12기타 미세 메스로 대체할 수 있습니다.
Dumont 55 forcepsFine Science Tools11295-51
견인기 Fine Science Tools17004-05조절성이 편리한
마이크로 니들 홀더Fine Science Tools12060-01
9.0 나일론 봉합사 (Ethilon), 테이퍼 포인트 베스트Ethicon2819G 또는 이와 유사한테이퍼 포인트 가장 좋지만 역 절단도 좋습니다
7.0 prolene 봉합사 (Prolene)Ethicon8700H 또는 이와 유사한6-0도 사용할 수 있으며 바늘 포인트는 다를
수 있습니다.큰 집게 (Adson 집게)Fine Science Tools11006-12다른 브랜드는 고급
윤활제 눈 연고 (Akwa Tears)Akorn17478-062-35
봉합 접착제 (GLUture 국소 조직 접착제)Abbot32046-01은 우수한 작업 시간을 가지고 있습니다
면도기Wahl9918-6171 또는 유사한
클램프 램프Zoo MedLF-5
적외선 전구, 75WZoo MedRS-75
RC2 설치류 마취 시스템VetEquip 922100
IsoFlo (Isoflurane)Abbot05260-05
부프레노르핀 (Buprenex)레킷 벤키저12496-0757-1
베타딘퍼듀 프레드릭67618015017
맛을 낸 젤라틴, 라즈베리젤로B000E1FYL0'지글러'의 일관성으로 단단하게 만들어졌습니다
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참고문헌

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