방법 논문

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

DOI:

10.3791/52385

⸱

2015년 2월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

이 논문에서

요약

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말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

초록

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과 아노 펠 레스 gambiae 종 단지는 아프리카에서 모기를 전송하는 주요 말라리아가 포함되어 있습니다. 이들 종은 의료 중요하기 때문에, 여러 가지 특성은 전형적 역학 연구에 도움 분자 분석법을 이용하여 특성화된다. 이러한 특성은 종 식별, 살충제 저항, 기생충 감염 상태, 호스트 환경 설정을 포함한다. 과 아노 펠 레스 gambiae 복합체의 형태 학적 집단 구별하기 때문에, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 전통적 종을 식별하는 데 사용된다. 종이 알려지면, 여러 하위 분석은 정기적으로 추가 특성을 규명하기 위해 수행된다. 예를 들어, 파라 유전자 KDR이라고도 돌연변이는 DDT 및 피레스 로이드 계 살충제에 대해 내성을 부여. 또한, 효소 면역 분석법 (ELISA를) 또는 변형체 기생충 DNA 검출 PCR 분석법 모기 조직 기생충 존재를 검출하기 위해 사용된다. 마지막으로, combinatioPCR과 제한 효소 다이제스트의 N은 호스트 별 DNA의 모기 bloodmeal을 선별하여 호스트 환경 설정 (예를 들어, 동물의 혈액 대 인간) 규명하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 96 시간에 384 샘플에 대해 단일 ​​멀티 플렉스 반응 유전자형 33SNPs으로 상기 분석을 모두 겸비한 다중 검출법 (MDA)을 개발 하였다. MDA 종, 말라리아 검출 및 호스트 혈액 식별을위한 여러 마커를 포함하기 때문에, 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 생성하는 가능성은 크게 특성 당 하나의 마커를 포함 이전 분석에서 감소한다. 이 강력하고 간단한 분석은 비용 효율적으로 기존 분석의 시간의 틈새에서 이러한 주요 모기의 특성을 감지 할 수 있습니다.

서론

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학질 모기의 arabiensis, 학질 모기의 coluzzii 아노 펠 레스 gambiae 아프리카 1 말라리아 전송을 담당하는 주요 벡터입니다. 이 세 종은 형태 학적으로 2 구별 만 분자 분석 3-9으로 구별 할 수있다. 또한, 정기적으로 역학 및 인구 유전학 연구를 지원하기 위해 실시 많은 다운 스트림 분석이있다. 이들은 분화 섬 10-12 (1) 유전자형 분석, (2) 아미노산 코돈 파라 유전자의 위치 번째 1014 비 동의어 SNP를 인식 유전자형 분석 (녹다운 저항 또는 KDR, SNP) (13)를 포함 -18, (3) 기생충 검출 PCR 19-23, 모기 midguts 24, 25에서 호스트 별 DNA (4) 검사.

우리의 목표와 하나의 멀티 플렉스 반응으로 모든 분석을 결합한 다중 탐지 분석 (MDA)을 개발아프리카에서 말라리아 벡터의 역학적으로 중요한 특성을 alyzing. MDA 분석 여러 (1) 종을 검출하기위한 마커 (A.의 arabiensis, A.의 gambiae, A.의 coluzzii, 또는 3 개)의 기타 (없음) KDR의 SNP로 표현, (2) 살충제 저항을 포함 (L1014F 및 L1014S 모두) 두 가지 주요 말라리아 기생충, (3)의 존재, 말라리아 원충 및 P. 삼일 열, 하나의 조류와 여섯 포유류 호스트에서 (4) 혈액 소스.

전통적으로, 이러한 분석은 분리 된 중합 효소 연쇄 반응을 수행 하였다. 이러한 모든 분석은 종래의 PCR 플랫폼을 사용을 완료하면, 그것은 8-10 PCR 반응 분석을 수행하고 전기 영동 단계를 수반하는 요구한다. 여기에 제시된 MDA 방식은 전체에서 약 5 시간 소요하면서 문서화 결과에 준비에서 각 PCR 반응은, 4 ~ 5 시간이 걸립니다. 이 단독으로 노동 비용을 90 % 절감하는 것과 같습니다. MDA는 여기에 제시된 5 달러 비용샘플 당 모두 33 개의 SNP 유전자형합니다. 이것은 상당히 저렴 샘플 당 약 $ 1.50의 요금으로 하나의 아가 로스 젤 기반 분석,보다. MDA 의해 덮여 모든 특성을 검출 분석은 샘플 당 $ 12-15의 비용 8-10 별도 아가 로스 겔 - 기재 분석법의 최소 필요하다. 또한, MDA 크게 각 기생충 또는 호스트 소스 검출에 대해 적어도 3 개의 마커를 이용하여, 거짓 포지티브 또는 네거티브의 발생 가능성을 감소시킨다.

우리가 활용 플랫폼은 말라리아 벡터에 한정되지 않고, 의약, 수의학, 및 기초 생물학 26-28 같은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 심층 많은 샘플 (100 단위의 순서) 번호를 포함하는 관련 연구 또는 집단 유전학 연구는 동시에 여러 마커에 대한 비용 효과 분석 검사를 필요로한다. 둘 이상의 별개 PCR 분석법을 이용하는 대부분의 연구는 더 낮은 비용으로 더 빠른 결과를 위해 MDA를 구현할 수있다.

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프로토콜

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1. PCR 증폭

  1. 1.5 ㎖ 마이크로 튜브의 모든 PCR 프라이머를 (보충 테이블 S1 참조) 섞는다. 각각의 SNP는 두 개의 프라이머 (순방향 및 역방향)가 있습니다. 각 PCR 프라이머의 주식 농도를 100 μM로 유지되어 있는지 확인합니다. (보충 표 S2 참조) 벤치에서 오류와 시간을 피펫 팅 줄이기 위해 500 ~ 1,000 반응에 대한 충분한 프라이머 믹스를 확인합니다. 원하는 경우, -20 ° C에서 튜브 및 상점 당 100 ~ 200 반응의 분량을 준비합니다.
  2. 제조 업체의 프로토콜 (표 1)에 설명 된대로 PCR 칵테일을 준비합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다. 소용돌이 2,000 x g에서 30 초간 가볍게 PCR의 칵테일을 함유하는 원심 분리기 튜브.
  3. 각각의 우물에 PCR 칵테일 3 μl를 96 웰 플레이트에 분주 비 스커트. 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다.
  4. 각 웰에 모기의 적절한 게놈 DNA의 2 μl를 추가합니다.
    주 : m으로부터 게놈 DNA를 얻는 공정 osquito 조직 (머리 / 흉부, 복부 또는 전신)는 다른 문헌 29 ~ 32에 설명되어 있습니다. (머리 / 흉부에 말라리아를) 감염 모기의 혈액 (복부)에서 말라리아와 사람들을 구별하기 위해 적절한 DNA 추출 프로토콜을 선택합니다. 우리는 일반적으로 모기의 신체 부위 (머리 / 흉부 또는 복부)에서 추출 된 DNA를 사용하므로 DNA 농도는 0.05-2ng / μL에 따라 다릅니다. 총 DNA 입력이 제조업체의 권장 사항 (5-10ng / RXN)보다 낮지 만, 우리는 일반적으로 강력한 SNP가 전체 게놈 증폭없이 DNA 샘플의 98 %에서 호출 얻을.
  5. 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다.
  6. PCR 증폭을 수행하기 위해 다음과 같은 열 순환기 프로토콜을 사용한다 : (1) 94 ° C 2 분 동안, (2) 94 ° C 30 초, (3) 1 분 30 초 동안 56 ° C, (4) 72 ° C (5) 단계를 반복합니다 (2) - (4) 45 사이클, (6) 1 분, 4 ℃로 유지 72 ° C.
_title "> 2. SAP 치료

  1. 96 웰 플레이트에서 SAP 효소 용액을 제조 하였다 (표 2 참조). 접시에 96 샘플을 처리합니다. 96 반응의 부피는 20 %의 돌출부를 포함한다.
  2. 소용돌이 2,000 × g으로 30 초 동안 SAP 효소 가볍게 솔루션과 원심 분리기 튜브. 각 웰에 SAP 효소 용액 2 μl를 분주한다. 다시 말하지만, 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다.
  3. 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. 40 분 (1) 37 ° C, (2) 85 ° C를 5 분 동안 효소를 불 활성화 (3) 4 ° C를 유지, 다음과 같이 판을 품어. 이 단계의 완료시 계속하기 전에 -20 ° C에서 접시를 저장합니다. 이주 내에 저장 판을 처리합니다.

3. SNP 확장

  1. 샘플 플레이트 SAP 처리 후에 고정되는 경우, 진행하기 전에 실온으로 해동 할 수있다.
  2. 확장 프라이머 믹스 (보충 표 S2)를 준비합니다. 각각의 SNP는 하나의 엑스 테가nsion 프라이머. 500 μM에서 각 확장 프라이머의 주식 농도를 유지합니다. 선택적으로, -20 ° C에서 튜브 및 매장 당 100 ~ 200 반응에 나누어지는.
  3. 96 반응 부피가 20 %의 돌출부를 포함 표 3에 기술 된 바와 같이 확장 믹스를 준비한다.
  4. 소용돌이 2,000 × g으로 30 초 동안 연장 가볍게 칵테일과 원심 분리기 튜브. 각 웰에 확장 칵테일 2 μl를 분배. 다시 말하지만, 리피터 피펫은이 프로세스에 대해 시간을 절약 할 수 있습니다.
  5. 370 x g에서 1 분간 혼합 또는 소용돌이, 원심 분리기 부드럽게, 플레이트를 밀봉합니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 열 순환 플레이트. 이때, 질량 분석을 진행 또는 이주에 -20 ° C에서 최대 플레이트를 저장한다.

4. 컨디셔닝 SNP 확장 제품 질량 분석기 분석을 최적화하는

  1. 샘플 플레이트 SNP 확장 후에 특히 동결이 진행하기 전에 실온으로 해동 할 수있다.
  2. 그 접점에서 수지의 15 mg을 이동연장 된 스푼을 사용하여 딤플 접시에 INER. 딤플 판의 우물에 수지를 확산 스크레이퍼를 사용합니다. 수지를 확산 딤플 접시에 걸쳐 좌우로 스크레이퍼 스윕. 수지는 각 웰에가 있는지 확인합니다.
  3. 스크레이퍼를 사용하여 딤플의 접시를 초과하는 수지를 쳤어요. 수지가 적어도 20 분 동안 플레이트 딤플 스탠드하자. 수지, 딤플 플레이트에 서 샘플 플레이트의 각 웰에 HPLC 등급의 물을 41 μL를 추가시키는있다.
  4. 조심스럽게 딤플 판에 샘플 판 거꾸로 놓으십시오. 딤플 판의 우물 시료 판의 우물을 정렬 딤플 판의 작은 둥근 게시물에 대한 샘플 판 재설정해야합니다.
  5. 수지는 샘플 플레이트의 우물에 딤플 판에서 쓰러 함께 샘플 플레이트와 딤플 판을 잡고 천천히을 뒤집어. 수지는 샘플 플레이트에 빠지고 있도록 딤플 판을 누릅니다. 디에 있는지 모든 수지 확인mple 플레이트는 샘플 판 우물에 빠지고. 30 초 동안 3,200 XG에서 접시를 원심 분리기.
  6. RT에서 5 분 동안 회전에서 샘플 판을 돌립니다. 로테이터는 샘플 판을 장축을 약 360도 회전한다.
  7. 5 분 동안 3,200 XG에서 샘플 판을 원심 분리기. 이 단계 후에, 다음 단계로 진행하기 전에 이주 -20 ° C에서 샘플 플레이트를 저장한다.

5. MALDI-TOF 질량 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 같은 SpectroCHIP로 bioarray에 조절 된 SNP 확장 제품을 전송합니다. 우리는이 단계 MassArray Nanodispenser를 사용합니다.
  2. 전송이 완료되면, 분석 및 플레이트가 분석 데이터베이스에 설정되는 방법을 정의한다. 각각의 판은, 특정 분석 설계 (보충 표 S3)에 링크 고유 식별자를 갖도록 분석과 판의 이름을 지정합니다.
  3. 분석 접시가 정의 된 후, 질량 분석계를 사용하여 스펙트럼을 획득.

6. 데이터 분석

  1. 이러한 타이 퍼 분석기 나 TyperViewer (Sequenom)로서 실시간 PCR 분석 데이터 해석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행한다. 각 웰에 대한 샘플 레이아웃, 질량 스펙트로 포함 .XML 형식으로 데이터를 구하는, 이름을 포함 마커 정보, 대응하는 SNP의 각 변이체에 대한 예상 질량, 및 오류 또는 각각의 반응과 관련된 경고 메시지. 결과 질량 스펙트로 그램 그림 2를 참조하십시오.
  2. . 각 유전자형 허용 공차 / 차이 (잡음비 크기 또는 신호) 검출 임계 값을 설정하여 SNP 유전자형 클러스터링 분석을 수행 3 04707-KDR # 2 SNP 유전자형 클러스터의 예를 보여준다.
  3. 스프레드 시트 프로그램에 결과 SNP 유전자형 호출을 보냅니다.

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결과

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종 식별 :

샘플이 세 종 중 하나가 아닌 경우 다음과 같은 5 개의 SNP 함께. 세 가지의 SNP (01073-213, 04679-157과 10,313 세 종 (A.의 arabiensis, A.의 coluzzii와 A.의 gambiae) (표 4)를 식별 -052)는 증폭 실패합니다.

살충제 저항을 추론하기위한 KDR 유전자형 :

파라 전압 관문 나트륨 채널의 1014 번째 코돈 KDR에 대응한다. 1014 번째 코돈의 2 차 및 3 차베이스에 두 개의 SNP는 세 가지 아미노산을 결정합니다. . 유전자형의 가능한 조합은 표 5에 나와있는...

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토론

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- 비행 (MALDI-TOF) 질량 분석 33-37 시간 PCR 증폭, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP) 반응, SNP 확장, 확장 제품 에어컨, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 : MDA는 5 개의 주요 단계로 구성되어있다. 첫 번째 PCR 증폭 단계는 충분한 주형 DNA가 SNP 확장 단계에서 사용할 수 있도록 각각의 SNP를 측면에서는 DNA를 증폭한다. SAP 반응은 다음과 SNP 확장 단계를 방해 할 수있는 사용하지 않은 dNTPs를 중화. SNP 확장은 SNP의 궤적과 대량 수정 터미네이터 뉴클레오티드 당 하나의 확장 프라이머를 포함한다. 3'- 말단이 변형 된 뉴클레오티드 프라이머 확장에 혼입되는 것을 방지 후속 뉴클레오티드. 따라서, 단일 염기의 질량은 해당 SNP의 유전자형을 나타낸다.

이 접근법의 성공을 보장하는 가장 중요한 단계는 대상 생물체의 존재 다형성 좋은 데이터 세트를 구비한다의. 우리는 종 식별 (N> 9...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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우리는 박사 감사합니다. 탄자니아에서 모기 표본을 제공 글래스고 대학의 UC 데이비스 박사 카타리나 Kreppel에서 앤서니 코르 넬과 로라 노리스. 우리는 잠비아에서 모기 샘플을 공유하기 위해 공중 보건의 존스 홉킨스 대학원에서 양 Smita 다스 박사 더글러스 노리스 감사합니다. 우리는 또한 분석 디자인 교육에 대한 동물 유전학 연구소 이씨 V. 밀론 감사합니다. 이 작품은 R01AI 078183과 R21AI062929을 부여 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MassARRAY 분석기 CompactSequenomMT9MALDI-TOF 핵산 분석을 위한 게놈 응용 분야용 질량 분석법.
MassARRAY 나노 디스펜서SequenomRS1000으로 완성된 iPLEX 반응 생성물을 전송합니다
.
은 SAP 키트를 포함한 iPLEX 분석에 사용되는 SpectroCHIP iPLEX Gold Genotyping 시약 세트 Sequenom 10158 시약

참고문헌

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