이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

19.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52392

⸱

2014년 12월 6일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 세포(림프구/백혈구)의 정성적 및 정량적 평가를 위해 신선한 인체 조직 조각의 신속한 비효소적 해리를 설명합니다. 또한, 일차 조직 균질액으로부터 얻어진 상등액은 추가 분석 또는 실험을 위해 수집 및 저장될 수 있습니다.

초록

선천성 및 후천성 면역 반응 모두에서 종양 탈출 특징으로 면역 시스템을 무력화하는 악성 세포의 능력은 지금 암의 중요한 특징으로 받아 들여진다. 유방암에 대한 우리의 연구는 종양 침윤 림프구가 종양의 진행과 환자 결과에서 재생하는 적극적인 역할에 초점을 맞추고있다. 이 목표를 향해, ​​우리는 그들의 원래 상태로 그들을 근접 평가하기위한 노력의 일환으로 정상 및 비정상 조직에서 그대로 림프 세포의 신속한 분리를위한 방법론을 개발했다. 표면 수용체 발현 비교하는 효소 - 소화 된 조직을 유지하면서 기계적 dissociator 쇼 모두 증가 된 생존율 및 세포를 회수하여 제조 균질. 또한, 나머지 불용성 물질의 소화 효소는 기본 균질의 양적, 질적 측정 가능성이 진정으로 조직 fragm에 침투 부분 집단을 반영하는 것을 나타내는 추가 CD45 + 세포를 복구하지 않았다천만에. 이러한 균질 림프 세포는 쉽게 면역 (표현형, 확산 등) 또는 분자 (DNA, RNA 및 / 또는 단백질)을 이용하여 특성화 할 수 접근한다. CD45 + 세포는 모집단 정화 시험 관내 팽창 또는 냉동 보관을 위해 사용할 수있다. 이 접근법의 또 다른 장점은 균질 물에서 뜨는 기본 조직과 정상 조직에서 악성 사이토 카인, 케모카인, 면역 글로불린 및 본 항원을 특성화하고 비교하기 위해 사용될 수 있다는 점이다. 이 프로토콜 기능을 매우 잘 인간 유방 조직 및 정상 및 비정상 다양한 조직에 적용 할 수 있어야한다.

서론

종양 미세환경은 다양한 세포 유형으로 구성되어 있으며, 수많은 연구에서 각 세포가 종양 형성에 뚜렷하고 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다1,2. 여기에는 면역세포, 기질세포, 내피세포, 종양세포 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다3. 종양 침윤 림프구(TIL; 신선한 인체 조직 샘플에서 주로 유방 종양의 림프구인 CD45+ 세포 또는 백혈구는 낮은 빈도, 연구에 자주 사용할 수 있는 작은 샘플 크기 및 추출 중 생존력 손실 가능성으로 인해 어렵습니다. 종양에 침투하는 면역 세포는 일반적으로 영주권자가 아닌 승객으로 존재하기 때문에 일반적으로 조직 기질에서 방출하기가 더 쉽습니다.

세포 무결성을 유지하면서 종양 조직을 해리하는 것은 기술적으로 까다로우며 전통적으로 단일 세포 현탁액을 준비하기 위해 기계적 및 효소 단계를 조합하여 수행되었습니다4-8. 이 접근법은 긴 배양 기간을 포함하며 세포 생존력의 현저한 감소뿐만 아니라 효소 절단에 의한 세포 표면 수용체의 손실과 관련이 있습니다. 종양 미세환경에서 TIL을 특성화하는 고품질 유세포 분석 연구와 유세포 분석 또는 항체 코팅된 비드에 의한 CD45+ 하위 집단의 깨끗한 정제는 효소로 분해된 종양 조직에서 달성하기가 더 어렵습니다. 또한, 생성된 종양 균질산염의 상등액(SN)은 효소 분해물에서 단백질이 분해될 가능성이 있기 때문에 분비된 단백질(사이토카인, 케모카인, 면역글로불린 또는 종양 항원)의 정량화 또는 정상 세포의 실험적 처리를 포함한 추가 분석이 불가능합니다.

효소 분해 없이 유방 조직[종양, 비인접 비종양(NANT) 및 정상(유방 축소) 유방 조직 포함]에서 단일 세포 균질화를 준비하는 방법을 찾기 위해 다양한 기계적 균질화 기술을 테스트했습니다. 기계적 해리기를 사용하여 준비된 균질액은 표면 수용체 발현을 보존하면서 세포 생존율(2배)과 총 세포 회수율(2배)을 증가시켰습니다. 나머지 불용성 물질의 효소 분해는 추가적인 CD45+ 세포를 회수하지 못했으며, 이는 이들 세포가 모두 초기 균질화에서 방출되었음을 시사합니다. 따라서 이 빠르고 간단한 접근 방식은 다양한 정상 및 악성 인간 조직에 존재하는 CD45+ 하위 집단에 대한 정성적 및 정량적 평가를 모두 가능하게 합니다. 이 접근법의 또 다른 장점은 초기 균질화(일차 조직 SN)의 SN을 수집하여 추가 분석 또는 실험에 저장할 수 있다는 것입니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

참고 : 모든 표본은 각 환자에서 얻은 정보를 담은 서면 동의 연구소 쥘 보르 데의 의료 윤​​리위원회의 승인을 프로토콜을 사용하여 획득 하였다.

조직 파쇄 1. 준비

  1. 절제된 조직 (수술실에서 절제 악성 및 정상 조직)를 해부 즉시 픽업 훈련받은 사람이 병리 실험실에 있습니다. 종양, NANT는 (가능한 한 종양에서 가장 먼 거리를 촬영) 및 정상 조직의 조각은 정기적으로 (1) 내에 처리 - 인체 조직에 대한 표준 바이오 안전성 절차를 사용하여 BSL2 실험실에서 수술 절제의 3 시간. 프로토콜의 흐름도는도 1에 도시되어있다.
  2. 모든 조직편 (정상 및 종양 NANT)을 달아 길이, 폭, 높이 (길이 x 폭 x 높이)를 측정한다. 이는 세포의 개체군에 대한 후속 정규화 중요한 단계, 추출 된 RNA 등이며
    NOTE : 샘플 크기의 범위는 더 지방이 가능하다면 100 10,000 mm의 3입니다.
  3. 조직이 실제로 종양의 일부임을 확인하기 위해 H & E 염색 용 유리 슬라이드에 종양 조각을 각인.
    1. 종양 조각에 유리 현미경 슬라이드를 누르면 몇 초 동안 손가락으로 부드럽게 압력을 적용하여이 작업을 수행합니다.
    2. 물에 세척 과정에서 다음 2 분 동안 이소프로판올과 슬라이드를 수정합니다. 마이어의 헤 마톡 실린 30 초 동안 조직을 Counterstain과.
    3. 물 여섯 화장실에서 슬라이드를 씻으십시오. 15 초 동안 Phloxine B 2 % 얼룩.
    4. 물 한 욕조와 이소프로판올 및 마무리의 네 화장실 의해 물 한 욕조에 씻으십시오.
    5. 1 분 드레인에 대한 이소프로판올에 품어. 자일 렌의 두 화장실에 걸린.
    6. 자일 렌을 기반으로 장착 매체를 마운트합니다. 종양 세포 수 (그림 2)에 대한 검사.
      참고 : - 기질, 림프 또는 광고 주로 종양 세포가 각인 된 슬라이드에 충실ipose 세포는 거의 종양 세포 사이에 공간을두고, (그림 2) 남아.
  4. 멸균 사용 - 화학적으로, 무 혈청 조혈 세포 배지 1 ㎖를 함유하는 작은 배양 접시에서 조직 단편을 배치 작은 조각 (2 ㎜ × 2 ~ 1)로 그것을 실온에서 (이하 매체 라 함)와 주사위 메스.
  5. 기계 dissociator의 C 관 (조직 조각 + 매체) 모두를 전송합니다.
  6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체의 2 ㎖로 배양 접시와 메스를 씻어 C 관 (해리에 대한 매체의 볼륨 = 3 ㎖)이 추가.
  7. 단일 세포 현탁액에 조직 조각을 균질화 C 튜브의 기계적 dissociator 프로그램 A.01 (가장 부드러운 프로그램)를 사용합니다. (한 사이클 = 25 초) 장치에서 C 튜브를 놓고 두 번 연속으로 프로그램을 실행합니다.
    참고 :이 균질화 절차는 설립과 인간의 유방 조직, 다른 다치 대한 검증되었습니다또는 또는 조직 유형이 다른 프로그램을 사용해야 할 수도 있습니다 먼저 테스트해야합니다.
  8. 장치에서 C 튜브를 제거하고 50 ML 튜브에 앉아 40 μm의 셀 스트레이너에 직접 균질을 가만히 따르다. 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여, 셀 스트레이너로 C 튜브에 남아있는 액체를 옮긴다.
  9. 1 ㎖의 마이크로 피펫 팁을 사용하여 15 ML 튜브에 여과 된 액체를 전송합니다. 일시적으로 셀 스트레이너 및 50 ml의 튜브를 유지.
  10. 배지 3 ㎖로 추가로 C 튜브를 헹구고 여전히 다시 50 ㎖ 튜브에 장착 셀 스트레이너로, 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여,이 전송. 부드럽게 연속적으로 용출액 오염을 막기 위해 폐기 된 깨끗한 파스퇴르 피펫 또는 1 ml의 팁을 사용하여 여과기 주위를 이동하여 50 ㎖ 튜브에 unhom​​ogenized 조직에 갇혀 잔류 액의 최대 양을 짜내.
  11. 거꾸로 t의 셀 스트레이너를 배치그는 원래 C 튜브와 unhom​​ogenized 조직은 다시 C 튜브에 떨어질 수 있도록 매체의 3 ㎖ 씻어.
  12. A.01 프로그램의 두 사이클 단계 1.7로 다시 균질화.
  13. 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너를 통해이 두 번째 균질을 붓고, (단계 1.10에서와 같이) 3 ㎖ 매체를 다시 C 튜브를 씻어 다시 최대 압박 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너에 파스퇴르 피펫으로 전송 셀 스트레이너에 갇혀 잔류 결합 조직으로부터 액체의 양.
  14. 이 시점에서, ~ 2.5 ml의 부피는 15ml의 튜브이고 ~ 50 ㎖ 튜브에서 9 ㎖의.

조직의 상층 액과 세포의 2. 분리

  1. 실온에서 600 XG에서 15 분 동안 15 ㎖ 중의 균질 물 및 50 ㎖ 튜브를 원심 분리기.
  2. 깨끗한 튜브에 15 ML 튜브에서 SN을 가만히 따르다 일시적으로 4 ℃에서 저장한다. 이 뜨는 = 차 종양, NANT 또는 정상 TIssue SN (최종 부피 2.5 ml)을 연속적으로 정화와 미래 분석 (아래 참조) -80 ° C에서 저장 이전에 분주합니다.
  3. 50 ML 튜브에서 상층 액을 제거한다.
  4. 부드럽게 1ml의 배지의 최종 부피 모두 세포 펠렛을 재현 탁. 요약하면, 첫째 부드럽게 (딱딱한 표면에 튜브를 눌러) 모두 튜브에 세포 펠렛을 휴식. 배지 500 μL와 50 ml의 느슨한 세포 펠렛을 재현 탁하고 제 펠렛을 재현 탁하는 15ml의 튜브에이 세포 현탁액을 전송. 세포의 최대 복구를위한 매체의 두 번째 500 μL 한 번이 단계를 반복합니다.
  5. 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 계산하고 : 작은 튜브로 전송 세포 현탁액 10 μL은 트리 판 블루 10 μL (희석 한 1)과 혼합한다.
    주 :이 시점에서 세포 현탁액의 분획은 또한 셀 크기, 입도를 평가하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수 있고 더 PREC 모집단에 대한 마커의 수가 제한 원한다면이전에 광범위한 분석이나 실험에 균질의 상대적인 세포 분포의 이세 평가. 흐름에 의해 모든 분석은 세포 계측법 개체군의 정상화 CD45 라벨을 통합합니다.
  6. 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 종양, NANT, 또는 정상 조직에서 셀은 추가의 정제 또는 분석을위한 준비가되어 있습니다. 수술과 같은 날에 수행 할 때 이러한 추가 단계가 최상이다.
    주 : 유세포 분석뿐만 즉시 1 초 동안 볼 텍싱, 세포 펠렛을 적혈구 세포 용해 완충액 0.4㎖를 첨가하고 방에서 10 분의 최소 배양하여 항체 라벨링 후 용해되어야 잔류 적혈구 세포 분류되지 분석하기 전에 온도 (빛으로부터 보호).

조직 뜨는 3. 명확화

  1. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에서 조직 SN와 1.5 ml의 튜브를 원심 분리기.
  2. 조심스럽게 t 제거그는 만지거나 펠렛을 방해하지 않고 뜨는. 수와 원하는 분량의 볼륨에 따라 깨끗한 튜브 (또는 튜브)에 전송합니다.
  3. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 뜨는을 저장합니다.

4. 환자의 혈액

  1. 헤파린 튜브에 정맥 천자에 의한 제어 수술 전에 일 각 환자의 혈액 샘플을 수집합니다. 혈장과 버피 코트를 얻기 위해 브레이크 오프 20 ºC에서 10 분 동안 400 XG에 혈액을 원심 분리기.
  2. 혈장을 분리하고 20 ºC에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여이를 명확히. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 플라즈마. 매체에서 버피 코트를 희석
  3. 즉시 분석 모집단 분리, DNA / RNA / 단백질 추출 또는 동결에 앞서 표준을 Ficoll-hypaque 구배 원심 분리를 이용하여 단핵 세포를 분리.

5. 유동 세포 계측법

  1. 제조에 따라 라벨 세포빛으로부터 보호 4 ° C에서 R의 지침. 세포 펠렛을 세포 용해 완충액 0.4 mL를 넣은 후 표지 항체 조직편으로부터 세포 현탁액를 Lyse 적혈구.
  2. 소용돌이는 즉시 1 초간 및 빛으로부터 보호 실온에서 10 분의 최소, 부화. 세척하지 않고 데이터 수집을위한 유동 세포 계수기에 표시된 세포를 전달합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

시판 티슈 해리 용액 또는 콜라게나 제의 다양한 실험 혼합물의 DNase 및 / 또는 히알루로니다 제 억제제 중 하나와 조직 절편의 소화 효소는 세포 표면 수용체의 다양한 절단. 최초 유방 종양 침윤 CD4 + T 세포에 대한 우리의 연구가 집중, 신속 인해 소화 효소 표준 프로토콜을 사용하여 4-8 표면 CD4 수용체의 절단에 중요한 기술적 문제를 제시 하였다. 우리는 높은 생존 성 림프구 (도 3a)에도 불구하고, I 및 II 완전히 세포 표면 CD4로부터 제거하는 콜라게나 제를 구하고, 또는 DNase의 저해제 및 히알루없이 콜라게나 제 효소의 다양한 테스트. 동일한 환자의 소화 혈액 및 골수 (비교 소화 림프절 및 종양 조직에서 검출 낮은 CD4 항체 라벨링 - (2- HR 1) CD4에 적당한 효과는 짧은 배양 시간에서 콜라게나 제 IV으로 관찰그림 (b); 우리는 우리가 소화 및 소화되지 않은 림프...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 연구는 이후의 세포 분류, 추출, 동결 보존 및 / 또는 CD45 + 개체군의 표현형 분석을위한 소화 효소없이 정상 및 악성 유방 조직 균질의 빠른 준비를위한 최적화 된 방법을 설명합니다. 이 실험적인 접근의 목표는 밀접하게 자신의 생체 상태를 반영하고 수술실에서 신선한 조직의 최소한의 조작으로 정상 조직에 비교 TIL의 이미지를 생성하는 것입니다. 지금까지, 우리의 실험실> 250 신선한 BC 조직 (종양 및 NANT)> 유방 감소에서 35 정상 유방 조직을 분석하기 위해이 프로토콜을 사용하고있다. 원칙적으로, 이러한 프로토콜들은 다른 유형의 종양 또는 조직에 직접 적용한다; 그러나, 몇몇 최적화가 필요할 수있다 (즉, 기계적 해리 프로그램 사이클의 수, 매체 볼륨 등). necess 될 수있는 더 큰 조직 조각을 사용하여 낮은 림프구 침윤 조직에 대한우리는 림프구 수가 낮은 정상 조직을 위해 할 것입니다 진. 대안 적으로, 밀도 구배 원심 분...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 이해 상충이 존재하지 않는다고 선언합니다.

감사의 글

보조금 지원이 작품은 과학 연구 (FNRS), 레 미스 드 난 연구소 보르, FNRS 조작 Télévie, 벨기에의 계획 암, 퐁 Lambeau-Marteaux, 퐁 JC Heuson과 퐁 Barsy에 대한 벨기에 기금 폴더 만.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GentleMacs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine은
Centrifuge 5810 REppendorf또는 기타 표준 탁상용 원심분리기
Centrifuge 5417 REppendorf또는 기타 표준 마이크로 원심분리기
Esco Class II A2 Biosafety CabinetESCO 글로벌또는 기타 표준 BSL2 후드
와 다소 동일합니다.도립 현미경Nikon eclipse TS100또는 혈구계
Bü과 호환되는 다른 현미경; rker 챔버Marienfield 640210또는 기타 표준 혈구계
Navios 유세포 분석기Beckman Coulter또는 기타 유세포 분석기 (8-10 색상 권장)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine은 Filcon
Cell Culture DishSarstedt72,710또는 기타 비 발열 성 플라스틱 용기
일회용 메스Swann-Morton0510을 사용합니다.또는 표준 일회용 멸균 메스
BD Cell Strainer 40 µ mBecton Dickinson734-0002또는 기타 비발열성 플라스틱 식기
BD Falcon Tube 50mlBecton Dickinson352070또는 기타 비발열성 플라스틱 식기
BD Falcon Tube 15mlBecton Dickinson352097또는 기타 비발열성 플라스틱 식기
BD FACS 튜브 5mlBecton Dickinson352008또는 기타 비발열성 플라스틱 식기
, 멸균 파스퇴르 피펫 5 mlVWR612-1685또는 기타 비발열성 플라스틱 용기
마이크로퓨지 튜브 1.5 mlEppendorf7805-00또는 기타 비발열성 플라스틱 용기
X-Vivo 20LonzaBE04-448Q무혈청 배지 권장
인산염 완충 식염수LonzaBE17-516F표준 생리학적 PBS
Trypan blueVWR17942E또는 기타 중요한 얼룩
VersaLyseBeckman CoulterA09777유세포 분석 실험용
생존도 Dye eFluor 780eBioscience65-0865-14유세포 분석 실험용
Anti-CD3 FITCBD Biosciences345763유세포 분석 실험용
Anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363세포 분석 실험용
anti-CD4 PEBD Biosciences유세포 분석 실험을 위한 345769,
anti-CD4 APC,Miltenyi, Biotec130-091-232, 유세포 분석 실험을 위한
anti-CD8 ECDBeckman Coulter737659유세포 분석 실험을 위한
anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774, 유세포 분석 실험을 위한 ,
anti-CD19, APC-Vio770유세포 분석 실험을 위한130-096-643
CD45 방지 VioGreen세포 분석 실험을 위한Miltenyi Biotec130-096-906
, , , , , , 고정 유, , Miltenyi Biotec 유

참고문헌

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229(2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131(2011).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

CD45
침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.