방법 논문

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

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DOI:

10.3791/52408

⸱

2015년 2월 17일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

초록

여기서 우리는 2개의 서로 다른 뉴런 집단으로 구성된 공동 배양을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 에피솜 벡터를 사용하여 인간 섬유아세포에서 재프로그래밍됩니다. iPSC의 집락은 섬유아세포 재프로그래밍을 시작한 후 30일 후에 관찰할 수 있습니다. 만능 집락은 신경 전구 세포(NPC)로 분화할 수 있도록 신경 유도 배지에서 수동으로 선택하고 성장합니다. iPSC는 1주일 이내에 신경 상피 세포로 빠르게 전환되며 높은 배양 밀도로 유지될 때 자가 재생 능력을 유지합니다. 1차 마우스 NPC는 7일 동안 혈청 함유 배지에 노출되어 성상세포로 분화되고 배아 18일(E18) 쥐 피질 뉴런(채널로돕신-2(ChR2)로 형질주입됨)이 추가된 단층을 형성합니다. 형광 단백질인 탠덤 이량체 토마토(tdTomato)로 태그된 인간 NPC는 다음 날 성상세포/피질 뉴런 배양에 파종되고 28-35일 동안 분화됩니다. 우리는 이 시스템이 iPSC 유래 뉴런과 피질 뉴런 사이에 시냅스 연결을 형성한다는 것을 보여주며, 이는 피질 뉴런의 광자극에 따른 시냅스 전류의 빈도 증가에서 분명합니다. 이 공동 배양 시스템은 다른 신경 세포 집단과 시냅스 연결을 생성하는 iPSC 유래 뉴런의 능력을 평가하기 위한 새로운 플랫폼을 제공합니다.

서론

최근 몇 년 동안, 신경 세포와 신경 회로 기능에 대한 우리의 이해는 신경 세포의 흥분을 제어하는​​ 여러 optogenetic 도구에 의해 혁명되었습니다. 이러한 도구 중 하나가 빛 활성화 양이온 채널입니다, channelrhodopsin-2 (ChR2) : 가벼운 자극 1-3 응답 ChR2 화재의 활동 전위를 표현하는 뉴런. 신경 세포는 빛에 일반적으로 구분하지 않습니다 때문에,이 놀라운 능력은 뉴런 4의 유전자 정의 인구의 활동의 정확한 시간적 및 공간적 제어를위한 새로운 길을 열어 크게 뇌 기능의 연구를 가속화하고있다. ChR2 신경망 (6)의 활동을 조절에 신경 개발 5 모니터링에서, 서로 다른 목적을위한 줄기 세포 연구에 적용되고있다.

여기서 우리는 신경 세포 공동 배양 시스템의 유용성을 높이기 위해 ChR2을 사용했다. 공동 문화 시스템은 서로 다른 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 평가를 할 수 있습니다.신경원과 신경교의 공동 배양, 신경계의 주된 세포 유형은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 간의 시그널링을 조사 할뿐만 아니라 생리적 반응이 시그널링의 중요성을 평가하기 위해, 손상 및 전파를 조사하는 데 사용 잠재적으로 7 시그널링에 관여하는 분자 메커니즘. 이전 연구는 인간의 iPSCs 쥐 대뇌 피질의 차 문화를 포함하는 신경 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포 (8)의 존재에 신경 세포에 매우 빠르게 분화 것으로 나타났다.

이 프로토콜에서 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)에서 파생 된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 뉴런 사이의 시냅스 연결을 심문하기 위해 공동 배양 시스템에서 ChR2을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성상 세포로 해부하는 단계와 수확 뇌 조직 (9)뿐만 아니라 마우스 신경 전구 세포를 유지하고 차별화 (NPC들)을 설명하고 인간의 NPC 값 int오 신경 세포 공동 배양 시스템을 만들 수 있습니다. 본 공 배양 시스템을 구축하기 위해, 우리는 오키타 동부 등에 의해 설명 된 통합 무 리 프로그래밍 방법을 사용 하였다. 10 인간 iPSCs를 생성하기. 리 등에 의해 기술 된 바와 같이 선택된 iPSCs는 효율적 소분자 억제제를 사용하여 화학적으로 정의 된 조건에서의 NPC를 분화시켰다. 11

공동 문화에서 신경 세포의 다른 인구 토마토 (tdTomato) 이량 체 형광 단백질, 탠덤를 통해 IPSC 파생 된 신경 세포의 대뇌 피질의 뉴런에서 ChR2 표현의 감지 및 태그를 통해 확인할 수있다. 피질 뉴런의 optogenetic photostimulation와 IPSC 유래 뉴런으로부터 전기 생리 레코딩 결합 서로 회로를 형성하는 뉴런이 두 가지 유형의 능력을 평가할 수있다. 특히, 대뇌 피질의 뉴런 ChR2가 발현의 photostimulation는 시냅스 회로를 형성 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 반응을 불러 일으킨다광 여기 대뇌 피질의 신경 세포 네트워크와. 우리는 증가 된 시냅스 후 전류가 실제로 이러한 조건에서 IPSC 파생 된 신경 세포에서 발견되는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 병 환자로부터 유래의 섬유 아세포를 이용하여 iPSCs 다른 신경 학적 질병 모델의 재현부 포함한 실험 조건 하에서 다양한 시냅스 회로의 평가를 허용한다.

프로토콜

참고 : 모든 실험은 SingHealth에서 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행된다.

1. 수확 초기 출생 후의 마우스 두뇌

  1. 1 ml의 1 배 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS) (+ 1 % HEPES) 옥시 리보 뉴 클레아 제 I와 (의 DNase I) (250 U / ㎖) 및 스파 아제 (Dispase) II (1 U / 당 10 μL 파파인 : 해부하기 전에, 해마 조직 소화 용액을 제조 ㎖). 티슈 소화 용액을 약 2.5 mL로하고 0.20 μm의 필터 장치를 사용하여 필터링. 사용할 때까지 37 ° C에서 솔루션을 따뜻하게 유지.
  2. 5 분 동안 얼음을 넣어 출생 후 5 일 (P5) 마우스 새끼를 마취. 발가락 또는 꼬리 핀치를 통해 통증 반사 얼음 및 테스트에서 제거합니다. 70 % 에탄올로 새끼 스프레이. 새끼 목을 벨과 얼음을 페트리 접시에 머리를 배치합니다.
  3. 작은 scisso의 쌍, 코 두개골의 기지에서, 정중선을 따라 피부 절개를RS 또는 미세 해부 집게. 껍질은 피부를 열고 두개골을 통해 비슷한 절개를합니다. 두개골의 양쪽에 각각 2 개씩 추가 수평 절단, (브레 그마에서) 하나의 주동이와 (람다에서) 하나의 꼬리를 확인합니다.
  4. 껍질은 기본 뇌를 노출 절개 라인을 따라 두개골을 엽니 다. 후각 전구를 덮는 두개골, 그들 사이의 중간 선 뼈를 제거하는 포셉 한 쌍을 사용합니다. 비 해부 손에 집게의 쌍 안정의 머리를 들고있는 동안이 작업을 수행합니다.
  5. 뇌의 배쪽 부분 및 꼬리 단부에서 두개골의베이스 사이에 주걱의 평평한 부분을 편안. 뇌에서 두개골의베이스에 주걱 평행을 유지, 뇌와 두개골의 바닥 사이의 유착을 단절 두개골의 주동이의 끝으로 이동합니다.
    1. 주걱으로 뇌를 꺼내서 얼음처럼 차가운 1X EBSS (+ 1 % HEPES)를 포함하는 페트리 접시에 넣습니다. 항상 침수 조직을 유지합니다.
  6. 모든미세 절개 단계, 해부 현미경 작업 및 각 손에 미세 해부 포셉의 쌍을 사용하여, 조직을 절단 하나, 안정된 조직을 유지하기위한 다른.
  7. 컷 그냥 후뇌에서 분리하는 대뇌 피질 후부합니다. 두 개의 반구에 대뇌 피질을 분리하는 중간 선을 따라 잘라. 대뇌 반구에서 수막을 제거합니다.
  8. 반구 내측면이 위를 놓고 해마 아래 뇌실에 집게를 삽입합니다. 중뇌을 버려야.
    1. 해마의 우수한 열등한 끝에 상처를 확인하고 치아 / entorhinal 피질 접합 근처 피질에서 해마를 분리 할 수​​ 있습니다. 얼음처럼 차가운 1X EBSS (+ 1 % HEPES)를 포함하는 접시에 해마를 수집합니다.

2. 해마 조직 해리

  1. 예열 해마 조직 소화 용액을 함유하는 접시 해마 전송. 말하다 t그는 가능한 한 벌금 조직 해마, 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
  2. 조심스럽게 15 ㎖의 원심 분리 관에 기계적 피펫 및 전송 세포의 단일 세포로 조직을 떼어 놓다.
  3. 5 분 200 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
  4. 20㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛을 10 분 동안 200 XG에 수크로오스 (0.9 M) 및 원심 분리기를 포함하는 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)에 0.5X.
  5. NPC 유지 배지 (표 1) 2 ㎖로 상등액에 resuspend 세포 펠렛을 제거하고 5 분 동안 200 XG에서 1X EBSS 용액 및 원심 분리기에서 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 10 ㎖의 상부에 배치했다.
  6. 상층 액을 제거하고 세포 펠렛에 마우스 NPC 유지 보수 매체 (표 1)를 추가합니다. 부드럽게 피펫 5 ~ 10 배 아래로 세포 펠렛은 하나의 세포로 분해되어 있는지 확인 할 수 있습니다.
  7. 프레 코트 매트 리겔 플레이트에 배지를 함유하는 세포 이동 및 표피 성장 인자 (EGF) 및 추가 fibrobla헤파린 세인트 성장 인자 2 (FGF2) (모두 20 NG / ㎖) (5 ㎎ / ㎖). 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어.

자기편 마우스 해마의 NPC 3. 유지 보수

  1. 적어도 한 시간 전에 통과에 마우스 해마의 NPC에 코팅 된 플레이트 / 플라스크를 준비합니다. 각 접시 또는 플라스크의 표면 영역을 커버하고, 실온에서 1 시간 정도 배양 마트 리겔을 추가한다.
  2. 90 % 합류 마우스 NPC 문화에서 미디어를 제거하고 PBS를 대기음 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 한 번 씻는다.
  3. 모든 우물 / 플라스크를 커버하고 37 ℃에서 5 분 동안 배양 충분한 세포 분리 솔루션을 추가합니다.
  4. 모든 세포가 10 배 배율로 반전 밝은 필드 현미경으로 보면 분리했는지 확인하십시오. 여전히 부착 된 세포가있는 경우, 추가로 1 ~ 2 분 동안 배양 용기를 배양하고 다시 세포를 확인합니다. 둘 베코의 수정 이글 중간 / 햄의 F-12 영양소 혼합물의 두 배를 추가 (DMEM / F-12)우물에 세포 분리 솔루션의 AS / 플라스크 한 번 모든 세포를 분리했다.
  5. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 DMEM / F-12 포함하는 셀을 전송합니다.
  6. 마우스 NPC 유지 보수 매체 (표 1) 5ml에 뜨는에 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 부드럽게 단일 세포로 세포 펠렛을 깨고 아래로 피펫.
  7. EGF와 FGF2와 보충 새로운 문화 우물 / 플라스크 및 상단까지 충분한 문화 매체에 총 세포의 세 번째 플레이트. 37 ° C와 5 % CO 2에서 배양 용기를 품어. 3 모든 3-4일 : 중간마다 둘째 날 및 분할 세포 1을 보충. 통합과 분리를 방지하기 위해 마우스 NPC 문화의 전면에 자라 난을 피하십시오.

성상에 마우스의 NPC 4. 차별화

  1. 성상 세포로 마우스의 NPC의 분화를 시작하기 전에 사전에 폴리 -L- 라이신 (PLL) / 라미닌 코팅 12mm 커버 안경 적어도 하루를 준비합니다. COV 추가24 웰 플레이트 erslips 충분히 PLL (보레이트 완충액에 1 ㎎ / ㎖)와 함께 웰 전체 면적을 커버.
    1. 4 ℃에서 하룻밤 접시를 품어. 다음 날, PLL을 제거하고 1X PBS로 한번 씻어.
  2. 다음, 37 ℃에서 적어도 4 시간 동안 배양, 다시 각 웰의 표면 전체를 덮고, (차가운 얼음 DMEM / F-12 1 ㎎ / ㎖)을 추가 라미닌.
  3. 마우스 NPC 문화에서 미디어를 제거하고 PBS를 대기음 1X PBS로 한번 씻어.
  4. 모든 우물 / 플라스크를 커버하고 37 ℃에서 5 분 동안 배양 충분한 세포 분리 솔루션을 추가합니다.
  5. 모든 세포가 다음 분리 된 DMEM / F-12 우물 / 플라스크에 세포 분리 솔루션과의 두 배를 추가했는지 확인하십시오.
  6. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 DMEM / F-12 포함하는 셀을 전송합니다.
  7. 5 ml의 성상 세포 분화 배지 (표 1)에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 조심스럽게 피펫 세포 suspensioN 위아래로 하나의 세포로 세포 펠렛을 깰. 단일 혈구 세포의 수를 계산.
  8. 5 × 104 세포 / cm 24- 웰 플레이트의 각 웰에 대한 매체 (500)의 2 μL 접시에서 세포. 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어. 격일로 신선한 매체와 매체의 절반을 교체합니다. 마우스의 NPC 빠르게 이일 내에서 성상 세포로 분화 및 추가 실험을 시작하기 전에 일주일 동안 차별화된다.

5. 수확 배아 쥐의 뇌와 두피 조직 해리

  1. 성상 세포 배양에서 성상 세포 분화 배지 (표 1)를 제거하고 차 신경 세포 배지 (표 1) 배아 쥐의 뇌의 수확을 시작하기 전에 적어도 4 시간으로 대체합니다.
  2. 12.1 ㎎ / ㎖의 L 시스테인과 함께 1 ml의 1 배 EBSS (+ 1 % HEPES) 당 파파인 10 μL : 해부하기 전에, 대뇌 피질의 조직 소화 용액을 제조. 약 2를 확인0.5 조직 소화 용액 ml의 0.20 μm의 필터 장치를 사용하여 필터링. 사용할 때까지 37 ° C에서 솔루션을 따뜻하게 유지.
  3. 압축 가스를 사용하여 이산화탄소에 의한 질식 임신 댐 안락사. 발가락 또는 꼬리 핀치를 통해 통증 반사에 대한 테스트합니다.
  4. 흡수 패드에 동물의 복부 측면을 놓고 70 %의 에탄올과의 복부를 흡수. 복부를 노출 충분히 넓은, 포셉 한 쌍의 피부를 조이고 외과 위의 쌍을 가진 횡 절개를합니다. 집게로 복막을 잡고 복강을 열고 잘라.
  5. 집게와 자궁 뿔을 들어 올려 mesometrium을 따라가 무료 잘라. 얼음을 페트리 접시에 해부 자궁을 놓습니다. 그들 사이의 자궁 조직을 절단하여 각각의 배아를 분리합니다.
    1. 배아 주머니에 절개를합니다. 조심스럽게 구멍을 통해 태아를 밖으로 껍질. 태아 목을 벨과 얼음을 페트리 접시에 머리를 배치합니다.
  6. embryon 수확IC 쥐의 뇌는 단계 1.3-1.5에서 설명을 따르십시오.
    1. , 대뇌 피질의 조직을 해부 뇌 반구 측면을 위로 올려 놓습니다. 중간에서 옆으로 두 반구를 잘라. 뇌의베이스 절반 가까이 버린다. 중뇌를 제거 절제 조직을 낸다.
  7. 예열 피질 조직 소화 용액을 함유하는 접시 피질 조직을 전송. 가능한 한 벌금 대뇌 피질의 조직을 말하다 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
  8. 예열 차 뉴런 배지 (표 1) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 조직 소화 용액으로부터 대뇌 피질 조직을 전송. 어떤 조직 조각 균질 한 용액이 얻어 질 때까지, 혈청 학적 피펫에 반복적으로 그들을 피펫 팅에 의해 아래로 대뇌 피질의 조직을 떼어 놓다.
  9. 나머지 조직 덩어리를 걸러 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 솔루션을 전달합니다. 15 ml의 조직으로 나누어지는 용액각 튜브에서 약 3 ㎖를 추가 원심 분리기 튜브,.
  10. 하단의 상단과 BSA의 조직 솔루션 두 개의 층을 형성, 각 튜브의 바닥에 1X PBS 800 ㎕의 7.5 %의 BSA를 추가합니다.
  11. 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기. 두 층의 계면으로부터 흡입, 상청액을 제거한다. 상기 튜브의 하단에 세포 펠렛을 방해하지 않도록.
  12. 1 ml의 차 뉴런 배지 (표 1) 각각의 세포 펠렛을 재현 탁하고 15 ml의 원심 분리 튜브에 이들을 결합한다. 혈구를 이용하여 세포 밀도를 결정한다.

6. 일렉트로 및 도금 차의 두피 뉴런

주 : 유전자 전달은 일렉트로 인산 칼슘 형질 감염 및 바이러스 형질 도입을 포함한 여러 가지 방법을 사용하여 달성 될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 ChR2 차 대뇌 피질의 신경 세포로 구성 제공하는 전기에 대해 설명합니다.

  1. 원심 분리기 6 × 10 6 쥐의 대뇌 피질의 뉴런5 분 200 XG를 t 상층 액을 제거합니다. 적어도 6 × 106 피질 뉴런 뉴런 생존하여 신경 네트워크의 형성을 보장하기 위해 필요한 전기.
  2. 펠렛을 세포 부드럽게 재현 탁하는 전기의 용액 100 μl를 추가합니다. pLenti-Synapsin-hChR2 6 μg의 (H134R) -EYFP-WPRE 4 플라스미드에 세포 현탁액 100 μl를 결합하고 인증 베트로 전송합니다. 전송하는 동안 공기 방울을 생산하지 마십시오.
  3. 선택과 제조업체의 지침에 따라 전기에 적합한 프로그램을 적용합니다.
  4. 전기 후, 큐벳에 세포 / DNA 현탁액에 MEM 500 μl를 추가합니다. 11.5 ml의에 차 신경 세포 배지 (표 1) 샘플을 전송하고 부드럽게 재현 탁. 미디어의 총량은, 전체 24- 웰 플레이트에 충분하다. 나누어지는 24 웰 플레이트의 각 웰에 대한 매체의 500 μL. 37 ° C에서 플레이트와 5 % CO 2를 품어.

유도 만능 줄기 세포의 7 세대

참고 :.이 방법은 오키타 등 알에서 적응되었습니다 (10)

  1. DMEM에서 배양 인간 섬유 아세포는 6 웰 플레이트에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충.
  2. 마트 리겔와 섬유 아세포, 코트 6 우물의 재 프로그래밍을 시작하여 실온에서 한 시간 이상 부화하기 전에. 80 % 합류, 섬유 아세포 배양에서 미디어를 제거하고 1X PBS로 한번 씻어.
  3. 전체 플레이트를 커버하고 10 분 동안 37 ℃에서 배양 할 수있는 충분한 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가합니다.
  4. 세포를 웰로부터 탈락되면 트립신의 트립신 분해를 종결로서, 10 % FBS DMEM으로 두번의 양을 첨가하는 것이 바람직하다. 부드럽게 아래로 피펫 세포 현탁액을 위로하고 세포를 파괴합니다. 단일 혈구 세포의 수를 계산.
  5. 15 ml의 원심 분리 튜브에서 원심 분리 5 200 XG에 세포 현탁액에 전송 7 × 105 세포분.
  6. 상층 액을 제거하고 전기 용액에 세포 펠렛을 재현 탁. 제조업체의 지침에 따라 섬유 아세포를 Electroporate. 전기 버퍼 100 ㎕의 세포를 재현 탁하고 각 에피 솜 벡터의 1 μg의를 추가합니다. 1,650 V의 설정, 10 밀리 3 시간 펄스와 Electroporate 세포.
  7. DMEM으로 전송 세포 현탁액을 10 % FBS 및 플레이트 6- 웰 플레이트의 웰 당 5 × 104 세포로 보충. 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어.
  8. 48 시간 후, 형질 전환 된 섬유 아세포 배양에서 미디어를 제거하고 mTeSR 배지로 교체합니다. 유도 만능 줄기 세포 (IPSC) 콜로니를 분리 할 준비가 될 때까지 매일 문화 미디어를 교체합니다. IPSC 콜로니 28~35일 후에 관찰 할 수있다.
  9. 때 격리를위한 준비, 기계적 IPSC 식민지를 잘라 마트 리겔 코팅 6 웰 플레이트 (12)에 10 μM의 Rho 관련 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 (Y-27632)와 mTeSR 매체에 시드. 매일 배지를 교체합니다.

8. 신경 유도와 인간의 NPC의 유지 보수

참고 :.이 방법은 리 등에 의해 설명되었다 (11)

  1. IPSC 문화가 20 % 합류 주위에있는 경우, mTeSR 매체를 제거하고 신경 유도 매체 (표 1)로 교체합니다. 격일 매체 보충.
  2. 칠일 후에 신경 유도 매체를 제거하고 인간의 NPC 유지 보수 매체 (표 1)로 교체. 문화를 계대 7 일 전으로 매체마다 두 번째 날을 보충.
  3. 이전에 적어도 시간 동안 실온에서 마트 리젤과 문화, 코트 판 / 플라스크를 계대.
  4. 합류 인간 NPC 문화에서 미디어를 제거하고 PBS를 대기음 1X PBS로 한번 씻어.
  5. 모든 우물이 다음 37 ℃에서 5 분 동안 품어 커버하기에 충분한 세포 분리 솔루션을 추가합니다.
  6. 모든 세포가 분리했는지 확인하십시오. DMEM의 두 배를 추가 /F-12 웰 / 플라스크 세포 분리 용액과.
  7. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 DMEM / F-12 포함하는 셀을 전송합니다.
  8. 5 ml의 인간 NPC 유지 보수 매체 (표 1)에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 부드럽게 아래로 피펫 세포 현탁액을 위로하고 세포를 파괴합니다.
  9. 플레이트 마트 리겔 코팅 문화 우물 / 플라스크 및 최고 최대 10 μM Y-27632 보충 충분한 매체에 총 세포의 세 번째. 37 ° C와 5 % CO 2에서 배양 용기를 품어.
    1. 분할 문화 1 : 3을 모든 3-4일과 매일 매체 보충. 차별을 방지하기 위해 고밀도 인간 NPC 문화를 유지한다.

공동 문화에서 신경 세포로 인간의 NPC의 9 차별화

  1. 신경 세포로의 분화를 시작하기 전에 인간의 NPC 문화에 렌티 바이러스 벡터 Synapsin1-tdTomato를 추가합니다. 성상 세포 / 대뇌 피질의 신경 세포의 공동 문화를 준비인간의 NPC를 구별하기 전에 미리 일.
  2. 1X PBS로 한 번 인간의 NPC 문화를 세척하고 모든 우물을 커버하기에 충분한 세포 분리 솔루션을 추가 / 플라스크는 37 ℃에서 5 분 동안 품어.
  3. 모든 세포가 분리했는지 확인하십시오. 우물 / 플라스크에 세포 분리 솔루션의로 DMEM / F-12의 두 배를 추가합니다. 15 ML의 원심 분리기 튜브에 전송합니다. 5 분 동안 200 XG에 원심 분리기.
  4. 5 ml의 신경 세포 분화 배지 (표 1)에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 조심스럽게 피펫 세포 현탁액을 위 아래로 하나의 세포로 세포 펠렛을 깰. 단일 혈구 세포의 수를 계산.
  5. 조심스럽게 성상 세포 / 대뇌 피질의 신경 세포 문화 매체를 대기음. 5 × 103 세포 / cm 신경 분화 배지 (2) 500 μL의 24 웰 각각 10 μM Y-27632로 보충 (표 1) 및 인간의 NPC 접시. 조심스럽게 각 웰에 인간의 NPC를 포함하는 매체를 추가성상 세포와 대뇌 피질의 뉴런을 방해 방지 할 수 있습니다.
  6. 37 ° C와 5 % CO 2에서 번호판을 품어. 에서 최소 28 일 동안 새로운 배지로 모든 2~3일을 매체의 절반을 교체합니다.

IPSC 파생 된 뉴런의 (10) 전기 생리 녹음

  1. 인간의 iPSCs 성숙한 신경 세포처럼 작동 여부를 확인합니다.
    1. 60X (0.9 NA) 침수 렌즈가 장착 된 수직 공 초점 현미경을 사용하여 tdTomato의 시각화에 의해 인간의 iPSCs에서 분화 된 세포를 찾아보십시오.
    2. 외부 용액을 실온에서 4 내지 6 M. 관류 셀의 저항 피펫 기록 당겨 (표 1)은 95 %, O2 / 5 % CO 2로 끊임없이 불어. 내부 솔루션 (표 1)과 함께 기록 마이크로 피펫을 채 웁니다.
    3. 똥개의 전류 주입 (1 초 시간, 10 pA로 증가)에 응답하여 전체 셀 모드와 기록 활동 전위 소성 패치 tdTomato + 셀클램프를 임대.
  2. ChR2을 표현하는 대뇌 피질 세포의 활동 전위가 안정적으로 빛 자극에 의​​해 유발되는 경우 확인합니다.
    1. 공 초점 현미경으로 GFP의 시각화에 의해 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 세포를 찾아보십시오. 단계 10.1.3에 10.1.2에 따라 대뇌 피질의 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행합니다.
    2. 확인 활동 전위가 안정적으로 수은 아크 램프 (100 W) 빛 조명에 의해 유발된다. 여기 필터의 파장의 40분의 480 ㎚이다.
  3. optogenetic 자극을 수행합니다.
    1. 패치 tdTomato + 전체 세포 모드 셀 -70mV에서 설정된 전압 클램프. 2 kHz에서 전류 신호를 필터 및 10 kHz에서 디지털화. (10)에서 녹음하는 동안 일관성을 위해 20 M에 이르기까지 일련의 저항을 모니터링합니다.
    2. 30 초 동안 100 W 수은 램프와 40분의 480 nm의 여기 필터에 의해 전체 필드를 자극한다.
    3. 기록 시냅스 전류의 photostimulation에 의해 유도 된 패치 셀의 (PSC를) 시냅스 코르 ChR2는 발현tical 뉴런. 검색 및 PSC를 측정한다. 각각 5 PA와 (20)를 PC에서 진폭 및 전류 영역에 대한 임계 값. 수동이 아닌 PSC 흔적을 폐기 이러한 이벤트를 검사합니다.

결과

여기서, 성상 세포로 구성된 공존 배양 생성에 관련된 여러 단계를 설명하는 프로토콜, 및 인간 대뇌 피질 뉴런 뉴런 도시된다. 인간 iPSCs 고밀도 (그림 1A)에서 유지되었다 NPC들 (11)을, 작은 분자 억제제의 칵테일 신경 계통에 에피 솜을 사용하여 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하여 얻은 10 벡터 및 지정되었습니다. tdTomato (그림 1B) 태그 인간의 NPC의 성상 세포에 마우스의 NPC의 차별화, ChR2을 표현하는 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 도금 및 시드 : 몇 가지 단계가 공동 문화를 생성해야합니다. 분화 일 2시, 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) + 성상 세포는 쉽게 우리의 문화 (그림 1C)에서 관찰 할 수있다. 마우스의 NPC는 성상 세포 단일 층 (그림 1D)에 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포를 도금하기 전에 적어도 일주일 차별화시켰다. 3 후인간의 NPC 분화의 사주로, tdTomato + 뉴런은 문화 (그림 1E)에서 검출되었다.

이 공동 문화 시스템은 빛의 자극 (그림 2A)에 대응하여 개별 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 전류의 일관성을 검출 할 수있다. 빛에 의해 자극되면, 활동 전위는 ChR2 (그림 2B)를 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포에서 생성되었다. 전류 펄스를 탈분극의 진폭 증가 활동 전위 소성을 보여 뉴런도 (그림 2C) 고르기가 있습니다 IPSC 파생 (그림 2D)를 증가 하였다. 따라서, 이들 세포는 성숙한 신경 특성을 나타낸다. 광 부재에서 IPSC 유래 신경 자발 시냅스 입력 (도 2e)을 받았다. GABA 수용체를 통해 전류가 외부 것이기 때문에이 안쪽으로 시냅스 전류는 주로, AMPA 수용체에 의해 매개하고 NMDA 수용체는 전류를 운반하지 않습니다-70 MV의 유지 가능성을 t. 빛 자극이 크게 시냅스 후 전류 (그림 2E)의 주파수를 증가하기 때문에 적어도 이러한 입력의 일부는, ChR2 표현 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 있었다. 시냅스 입력의 증가의 시간 과정은 그림 2 층에 표시됩니다 : 대뇌 피질의 뉴런의 photostimulation은 30 초 긴 빛 플래시에 걸쳐 지속되었다. ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런 (그림 2G) 광 여기 때 PSC를의 주파수가 상승하는 동안, 자신의 진폭 (그림 2H)의 영향을받지이었다. 요약하면, 이러한 결과는 IPSC 파생 된 신경 세포가 성숙한 신경 세포의 특성을 나타내과 연접 대뇌 피질의 뉴런과 시냅스 연결을 형성 할 수 있음을 나타냅니다.

figure-results-1
그림 1 : 공동 문화의 생성을위한 개략도iPSCs 및 NPC들에 신경 유도로 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그래밍 시스템. (A) 타임 라인. 대뇌 피질의 신경 세포와 성상 세포 문화에 성숙한 신경 세포로 인간의 NPC의 터미널 차별화를위한 (B) 타임 라인. (C) 마우스의 NPC가 빠르게 GFAP로 분화 + 성상 세포 (2) 후 체외에서 일. (D) 일주 후, ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포가 GFAP + 성상 세포에 배양 하였다. (E) 4~5주에서 인간의 NPC의 분화 후, 전기 생리학 녹음은 tdTomato + 뉴런에서 수행되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.

figure-results-2
그림 2 : 기능 시냅스 연결의 Optogenetic 분석. tdTomato (빨간색) 태그 (A) IPSC 유래 세포는 대뇌 피질의 신경 세포가 발현와 공동 배양 한 빛 활성화채널 ChR2 (녹색). IPSC 파생 된 신경 세포에서 녹음은 대뇌 피질의 신경 세포 또는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 하나에서 올 수 시냅스 전류 (PSC) 응답을 밝혔다. (B) 조명 (파란색 막대)는 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포의 활동 전위의 시리즈를 유발. ( C) IPSC 유래 세포 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 신경 세포 (E) Photostimulation (파란색 막대). IPSC 파생 된 세포의 전류 곡선 대 D) 발사 (. 전류 주입에 의해 유발 IPSC 파생 된 신경 세포에서 PSC를의 주파수를 증가 . photostimulation 의해 제조 PSC 주파수의 증가 (F) 경시. 블루 바는 photostimulation의 시간을 나타냅니다. PSC 주파수 photostimulation (G) 증가 동안 (G, H), PSC 진폭은 영향을받지 않습니다 (H)이었다. * P <0.05는 학생의 t-test로 대조군에 비해 나타냅니다.

토론

Optogenetics 뉴런 (13)의 정의 인구의 활성화를위한 시간과 공간 정밀도를 제공합니다. 실험에서, 현미경의 대물 필드는 전체 ChR2 표현 광 자극에만 피질 뉴런에 30 초 동안 조사 하였다. 이 시냅스 연결이 공동 문화 내에서 뉴런의 서로 다른 집단 사이에 형성되었는지를 우리가 결정하는 것을 허용했다. 우리의 결과는 photostimulation이 뉴런 ChR2을 표현하는 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 시냅스 입력을받을 것을 증명하는 IPSC 파생 된 신경 세포 PSC 주파수를 증가시키는 것으로 나타났다. 이것은, 차례로, IPSC 유래 신경 성공적 피질 뉴런 회로에 통합하는 것이 확립.

본 공 배양 시스템의 생성을위한 몇몇 중요한 단계가있다. 그것은 도금을 진행하기 전에 마우스 NPC 파생 성상 세포 배양, 최소한의 세포 죽음으로 건강 있는지 확인하는 것이 중요하다다른 세포 유형. 대뇌 피질의 신경 세포와 인간의 NPC 건강 성상 세포에 잘 부착 및 전기 생리학 녹음 배양 조건에 크게 의존한다. 이 프로토콜의 다른 주요 단계는 성상 세포 배양 상에 전기와 대뇌 피질의 뉴런의 도금입니다. 다수의 셀이 전기 천공 후 다이로서, 적어도 6,000,000 피질 신경 세포를 24- 웰 플레이트에서 성상 세포 배양 물에 도금을위한 전기 천공되도록하는 것이 중요하다. 우리는보다 적은 세포 6,000,000 일렉트로 때, 뉴런의 생존 수를 전기 생리 학적 기록에 영향을 치밀 신경 네트워크를 형성하지 않은 것을 발견했다. 각 공동 배양 실험을 상이한 시험의 비교를 허용하기위한 전기 천공 피질 뉴런의 수는 일치한다. 소화 효소를 포함하는 모든 단계의 경우, 너무 오래는 세포 죽음으로 이어질 수 있으므로에 대한 소화 용액에서 세포를 남기지 않도록 필수적이다.

이방법은 다른 신경 세포와 시냅스 접촉을 형성하기 위해 환자 별 섬유 아세포 유래의 신경 세포의 기능을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 신경 발달 장애 레트 증후군 (RTT)을 앓고있는 환자에서 섬유 아세포 유래의 신경 세포가 시냅스 전달 결함을 나타낸다 : RTT 뉴런 아마도 인해 덜 시냅스 연결 14 건강한 신경 세포에 비해 PSC 주파수 및 진폭의 상당한 감소를 나타낸다. 우리의 공동 문화 시스템은 발달 결함을 표시하는 신경 세포에 약물 효과를 검사 할 수 있습니다. 이 병에 걸린 사람의 NPC 시드 동안뿐만 아니라 신경 세포의 분화의 시간에 걸쳐 연속 화합물 노광 중에 관심 화합물의 첨가를 통해 수행 될 수있다.

본 공 배양 시스템은 또한 약물 테스트에 대한 모델로서 사용될 수 있지만,이 방법의 한계는 각 후보 화합물의 효과를 조사하는 과정이 길고 지루 수 있다는 것이다그것은 높은 처리량 스크리닝 방법이 아닙니다. 후보 화합물과 치료 후, I​​PSC 파생 뉴런은 개별적으로 PSC를 각 화합물의 효과를 결정하기 위해 패치해야합니다. 또한, 현재 환자의하지 사용할 수있는 많은 섬유 아세포 및 iPSCs있다. 따라서, 환자의 세포를 더 갖고 있으며 높은 처리량 스크리닝이 프​​로토콜을 적응 가까운 미래에 관심이있을 것이다. 예를 들어, 이온 또는 막 전위의 유전자 인코딩 센서 등의 작동 표시와 IPSC 유래의 신경 세포를 라벨링함으로써, 사이드 스테핑 시간이 소요되는 전기 생리 학적 절차에 의해 실질적으로 처리 속도를 높일 수있다. 전기 생리 학적 기록을 수행 아세포 재 프로그래밍에서,이 공존 배양 시스템을 생성하는 전체 프로세스로서, 90 일 이상, 그것은 각각 리 프로그래밍 및 신경 유도 단계 후에, 인간 iPSCs 나 NPC의 하나가 확장 될 것을 권장 필요동결 보존 및 미래 실험에 필요한 시간을 감소시킨다.

우리의 실험에서, 우리는 synapsin1 프로모터에서 대뇌 피질의 신경 세포에 ChR2을 표현했다. 이 프로모터는 팬의 연결이기 때문에, 우리는 아마 모두 억제와 흥분 대뇌 피질의 신경 세포를 photostimulating했다. 미래의 실험의 목적은 구체적으로 흥분성 또는 억제 회로 중 심문하는 경우,보다 특이 적 프로모터가 사용될 수있다. 또한, 대뇌 피질의 신경 세포는 유전자 변형 (또는 바이러스가 주입 된 쥐) ChR2 표현 특별히 신경 세포의 유전자 정의 주민들을 대상으로 얻을 수 있었다. 예를 들어, Cre 호텔 재조합 효소가 마우스에서 수확 대뇌 피질의 조직 ChR2을 표현하는 유일한 대뇌 피질의 신경 세포가 태양 광 발전의 interneurons 15됩니다 상황을 얻을 것입니다 floxed ChR2와 마우스로 교차 parvalbumin 함유의 interneurons (태양 광 발전의 interneurons)로 표현. 이러한 ChR2 발현 우리에서의 interneurons을 공동 CU의 사용lture 시스템 패치 IPSC 유래 뉴런의 PV의 interneurons와 회로에 통합 할 수 있는지 여부의 판단을 가능하게 할 것이다.

이전 연구 (9)을 바탕으로, 대뇌 피질의 신경 세포는 체외 14 일 후에 수상 돌기 겹치는 성숙. photostimulation 패치 된 IPSC 유래 신경 세포 반응을 유발하지 않는 경우 즉, 그것은 뉴런 피질 뉴런과 시냅스 연결을 할 수있는 능력을 갖고 있지 않음을 표시한다. IPSC 파생 된 신경 세포는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 또는 대뇌 피질의 신경 세포에서 하나의 시냅스 입력을 수신 할 수있다. 전통적인 패치 클램프 기록을 사용한 경우, 시냅스 입력이 어디에서 오는 구별 할 수 없을 것이다. 우리의 시스템의 장점은 피질 시냅스 입력에서 시냅스 반응은 선택적으로 유발하고 식별 할 수있다. 여기에 설명 된 절차를 통합하는 IPSC 유래 신경 세포의 능력을 평가하는 간단한 방법을 제공한다정의 된 신경 네트워크에.

공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

우리는 IPSC 세대에 전문 지식과 프로토콜을 공유하기 위해, 각각 ChR2 및 Synapsin1-tdTomato 렌티 바이러스 구조에 대한 C. 차이를 K. Deisseroth 및 S. 이인제 감사, 와이오밍 레옹 기술 지원, 공유, 시약 및 전문 지식에 대한 총리 실험실의 구성원. 이 작품은 ELG에 경쟁력있는 연구 프로그램 (002-082 2008 NRF-CRP NRF)에 따라 연구 재단 싱가포르, 애보트 영양과 ELG에 우수 학술 센터 (ACE) 글락소 스미스 클라인 (GSK)에서 연구 수상에 의해 지원과 GJA, 교육, 과학, 한국의 기술 (교육 과학 기술부) 장관의 재원으로 한국 연구 재단의 세계 수준의 연구소 (WCI) 프로그램 (NRF)에 의해 (NRF 허가 번호 : 2009-003 WCI) GJA에

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Neurocult Proliferation Kit (Mouse)STEMCELL Technologies5702Contains NSC Basal medium and NSC Proliferation Supplement
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Neurobasal mediumInvitrogen
글루타민이 없는 21103049 MEMInvitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B27Invitrogen17504044
L-glutamineInvitrogen25030081
GlutaMAX 보충제Invitrogen35050061
PenStrepInvitrogen15140122
BSA시그마A7906
인간 LIFInvitrogenPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biotech130103926
SB431542시그마S4317
화합물 EMerck Millipore565790
EGFMerck Millipore324856
FGF2R& D Systems233FB025
연구 등급 FBSThermo ScientificSV30160.03성상세포 분화 매체용
정의된 FBSThermo ScientificSH30070.031차 뉴런 매체용
PBSThermo ScientificSH30028.02
GlucoseSigmaG82701차 뉴런 배지용
설탕시그마S0389
헤파린EMD 밀리포어375095
파파인워딩턴3126
HBSSInvitrogen14175095
DNase IRoche10104159001
Dispase IISTEMCELL Technologies7923
HEPESGibco15630080용 수확 뇌
EBSSInvitrogen14155063
L-CysteineSigmaC7352
Trypsin-EDTAInvitrogen25200056
70 µ m 세포 여과기BD Biosciences   352350
20 &마이크로; m 필터 유닛Sartorius Stedim16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D(+)-GlucoseSigmaG7520전기생리학적 연구용
K-글루코네이SigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375전기생리학적 연구용
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
붕규산 유리 모세관World Precision Instruments, Inc1604323
15 ml 원심분리기 튜브BD Biosciences 
50 ml 원심분리기 튜브BD Biosciences352070
24-웰 플레이트Corning9761146
6-웰 플레이트Corning720083
T25 플라스크Corning430641
12 mm 커버 안경Marienfeld-Superior111520
AMAXA 랫 뉴런 핵펙터 키트& 주의;LonzaVPG1003주요 피질 뉴런의 전기천공을 위해
Neon Transfection System InvitrogenMPK5000인간 섬유아세포의 전기천공을 위한
미니 분석 SynaptosoftMini Analysis v.6PSC 측정을 위해
Normal Dermal Human FibroblastsPromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPREAddgene20945
Mercury short-arc lampOSRAMHBO 103 W/2
트 352096

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