세포 침전 매니폴드/슬라이드 장치를 사용하여 시험관 내에서 비부착 면역 세포의 방사상 이동성을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 이동은 종양 세포의 단층 또는 세포외 기질 단백질에서 추적됩니다. 광학 및 형광 현미경에 의한 검사를 통해 세포 이동성 및 세포 독성 기능을 관찰할 수 있습니다.
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방법 논문
레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
우리는 먼저 형광 표지 된, 비 - 부착 인간 또는 뮤린 효과기 면역 세포의 운동성을 측정하기 위해, 세포 외 기질 단백질에 부착 된 종양 세포의 반경 방향 이동을 측정하는 것으로보고, 방사형 단층 세포 이동 분석법 신규 적응을보고한다. 이 기술은 스테인리스 매니 폴드 10 웰 테플론 슬라이드 국소 적 융합 성 종양 세포 단층 또는 세포 외 기질 단백질로 제조 중 웰로 미부착 된 T 세포를 증착하기 위해 사용한다. 광 및 / 또는 다 채널 형광 현미경은 시간이 지남에 이펙터 세포의 이동 및 동작을 추적하는 데 사용된다. 형광 염료 및 / 또는 형광 유전자에 대한 코드가 차등 이미징 세포 유형에 라벨을 사용하는 바이러스 벡터. 이 방법은 슬라이드 챔버, 한천 또는 트랜스 웰 플레이트를 이용하여 수평 또는 수직 마이그레이션 / 침략을 추적 체외 분석에서 비슷한 유형 구별된다. 분석은 상세한 영상 데이터가 ㄱ 할 수 있습니다특정 형광 마커에 의해 구별 다른 종류의 세포로 수집 된 전자; 세포의 경우에도 특정 하위 집단 (즉, nontransduced / 형질)을 모니터링 할 수 있습니다. 표면 강도 형광 플롯 이주 셀 타입에 대응하는 특정 형광 채널을 이용하여 생성된다. 이것은 특정 시간에 비 부착 면역 세포 이동의 더 나은 시각화 할 수 있습니다. 그것은뿐만 아니라, 세포를 대상으로 같은 세포 독성 또는 이펙터에서 바이러스 벡터의 전송과 같은 다른 이펙터 세포 기능의 증거를 수집 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 연구자들이 다양한 유형의 미시적 부착 세포 차분 적 표지 된, 비 - 부착의 세포 간 상호 작용을 기록 할 수있다. 이러한 정보는 기능의 시각적 증거가 암 치료를위한 이들의 사용 전에 종양 표적 세포에 요구되는 생물학적 활성 또는 조작 면역 세포 유형의 평가에 특히 적합 할 수있다.
서론
방사형 단층 세포 이동 분석은 원래 세포 외 기질 (ECM) 단백질 5-7 또는 피브로넥틴 또는 라미닌 1,2- 개별 ECM 성분으로 코팅 된 슬라이드 부착 성 종양 세포의 1-4 침윤성 특성을 측정하기 위해 개발되었다. 기술은 스테인레스 스틸 셀 침강 매니 폴드 (CSM)을 사용하여 웰의 중심에 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 시딩 관여. 침전 후, 종양 세포는 수평 운동의 속도를 설정하는 데 사용 된 시간과 웰 위에 초기 세포 집단의 직경 변화의 하단에 부착된다. 방사형 단층 세포 이동 분석은 세포의 체외 철새 능력을 분석하는 트랜스 웰 플레이트를 채용 기존의 방법에 비해 시각적 인 장점을 제공; 이러한 분석은 촬상 8 비 이바지. 뿐만 아니라, 또한 평가시기를 선택하는 자유도 다량 구비마이그레이션, 평가된다 시점들의 수에 제한이없는 연구자가 침전 후 이미지를 선택할 수있을 때에요.
이동하는 능력이 특히 그들은 바이러스 벡터에 대한 전달 비히클로서 사용될 수있다 면역 또는 여기서의 영역에서, 비 - 부착 세포에 중요한 기능을하기 때문에, 우리는 미부착 된 세포의 이동을 평가하기 CSM의 사용을 채택 종양 세포 단층상의 종류, ECM 단백질 이....
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프로토콜
1. 슬라이드 준비
- 멸균 파우치에 휴대 침전 매니 폴드 슬라이드를 삽입하고 오토 클레이브 테이프로 밀봉. 봉지의 종이 측 플라스틱 웰에 침착을 방지하기 위해 슬라이드 테프론 코팅면에 직면한다.
- 121 ℃에서 15 분간 멸균 파우치.
- 멸균 150 X 15mm 멸균 페트리 접시에 바이오 안전성 캐비닛과 장소 내부 살균 주머니에서 슬라이드를 제거합니다. 네 개의 슬라이드까지 접시 당에 맞게 할 수 있습니다. 슬라이드 옆에 35 X 10mm 페트리 접시를 놓습니다. 가습을 제공하기 위해 멸균 H 2 O의 2-3 ML을 추가합니다.
- 물론 전체를 커버하기에 충분한 양을 사용하여 100 ㎍ / ㎖의에 폴리 D 리신으로 미리 코팅 슬라이드. RT 이상의 시간 후, 용액을 흡인하고, 웰의 표면 위에 1X PBS 피펫 팅하여 잘 배의 표면을 헹군다.
- 선택적으로, 더 강한 종양 세포 부착을 위해 피브로넥틴 또는 다른 ECM 성분을 추가한다. 충분한 볼륨 그쪽에서 5 ㎍ / ㎖의에서 피브로넥틴 추가웰 T RT에서 단시간 내에 건조하지 않습니다.
- 1 시간 후, 남아있는 솔루션을 대기음 1X PBS와 피펫 팅에 의해 아래로 두 번 씻는다.
- 종양이 도금을위....
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결과
형광 단백질 코딩하는 바이러스 벡터는, 또는 그 대신에 형광 염료의에 더하여 사용될 수있다. 바이러스 형질 도입은 운동성 분석에 앞서 수행되어야한다. 두 점착성 및 비 점착성 세포 유형 차등하게 표지 될 수있다. 전달을위한 프로토콜을 이용할 벡터의 종류에 따라 달라질 것이다. 여기서, 우리는 (12)을 설명하는 프로토콜을 사용하는 분석에 앞서도 RRV EMD-3, 5, 6, 적어도 이틀 alloCTL를 형질 도입. 또한 mStrawberry 적색 형광 단백질 (도 4)을 표현하는 종양 세포를 형질 도입하기 위해, 렌티 바이러스 벡터, CMV-IRES-딸기 FLUC2을 사용했다. 이 형질 도입 지점은, 신선한 배지를 첨가 한 48 시간 동안 세포를 플라스크에 벡터를 가산함으로써 달성 하였다. 제한 희석, 세포 이틀 동안 회복시킨 후 100 % 형질 도입 된 세포 집단을 생성하기 위해 수행 하였다.
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토론
단일 세포 현탁액 중의 종양 세포는 테프론 마스크 슬라이드의 웰에 피펫 팅 하였다. 세포가 접착 가능하고 가습 된 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기 (도 1a)에 단분자층을 형성 하였다. 단일 층에서 파생 설립 된 단일 층 또는 ECM 단백질은 이러한 분석 (그림 1B) 수확 할 수있다. EMD를 코딩하는 벡터로 중요한 형광 염료로 표지 또는 형질 이펙터 T 림프구 웰을 사용 CSM의 중심으로 시딩 하였다. 시간에 따른 단층 또는 ECM 단백질에 마이그레이션하는 미부착 된 효과기 T 림프구의 능력을 평가하고 그 다음 빛과 형광 현미경으로 정량 하였다. 여기서는 부분적으로 중요한 표적 U-87MG 교종 세포의 단층에 미부착 alloCTL 이펙터의 이동 및 세포 독성을 평가 하였다 (도 3 및도 5). 오직 인간 백혈구 항원의 일부를 표시하는이 표적 세포,원래 자극에서 볼 (HLA) 분자 (HLA-A2, B44)은, 관련.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI 허가 번호 UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, 그리고 조안 S. 홈즈 기념 연구 기금에 의해 부분적으로 지원됩니다. MJH와 GCO는 UCLA에서 조안 S. 홈즈 기념 박사후 원정대에서 지원 받았다. CSM 장치는 창조적 인 과학적인 방법에서 얻은 : www.creative-sci.com. 렌티 바이러스 벡터는 CURE / P30의 DK041301 지원하는 UCLA 벡터 코어에서 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 테프론 마스크 현미경 슬라이드 | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| 페트리 접시, 150mm | 코닝 | 430597 | |
| 페트리 접시, 35mm | 코닝 | 430588 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 &뮤; l Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μ l Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μ l 피펫 팁 | VWR | 89003-060 | |
| 증류수, 탈이온수(멸균) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| 종양 세포 배양 배지(예: DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V 무혈청 매체 | Invitrogen | 12055-083 | |
| 태아 혈청 | 오메가 사이언티픽 | FB-02 | |
| 도립 현미경 | |||
| SPOT 고급 | 진단 기기 | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 오토클레이브 파우치 | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| 세포 증식 eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
참고문헌
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, ....
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재인쇄 및 허가
