녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

요약

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

초록

망막은 시각 체계의 관문이다. 영상 신호 처리 메커니즘을 이해하기 위해 망막 신경 네트워크 기능을 조사. 네트워크의 망막 신경 세포는 다양한 아형 포함한다. 양극성 세포, 신경절 세포 및 무 축삭 세포의 10 개 이상의 아형은 형태 학적 연구에 의해 확인되었다. 망막 뉴런의 여러 아형 모션 및 컬러 같은 시각적 신호의 뚜렷한 기능을 인코딩 및 다중 신경 경로를 형성하는 것으로 생각된다. 그러나, 영상 신호 처리의 각 신경 세포의 기능적 역할은 완전히 이해되지 않습니다. 패치 클램프 방법이 근본적인 문제를 해결하는 데 유용합니다. 여기에, 프로토콜을 제공한다 어두운 적응 조건에서 패치 클램프 녹음을 사용하여 마우스 망막 신경 세포에서 빛 유발 시냅스 응답을 기록합니다. 마우스 눈 O / N 암순응이며, 망막 슬라이스 제제는 적외선 조명을 이용하여 시청자 암실에서 해부. 적외선하지 않습니다마우스의 광 수용체를 활성화하고, 따라서 그들의 빛 응답 성을 유지합니다. 패치 클램프 망막 뉴런의 광 유발 된 응답을 기록하는데 사용된다. 형광 염료는 신경 학적 아형의 특성을 기록하는 동안 분사된다. 이 절차는 마우스 망막에 각각의 신경 세포의 생리 학적 기능을 결정하기 위해 우리가 할 수 있습니다.

서론

망막은 신경계의 독특한 부분 중 하나입니다. 뇌의 접근 가능한 부분으로서, 시냅스 구조는 잘 특성화되어 있습니다. 또한 이 신경망의 기능은 생리학적 자극인 빛으로 검사할 수 있습니다. 망막 조직이 적절한 절차를 거쳐 어두운 방에서 격리되면 조직의 뉴런이 빛에 반응합니다. 이 제제는 시각 신호 처리를 연구하고 다양한 시냅스 메커니즘과 신경망 기능, 질병 메커니즘을 밝히는 데 사용되었습니다.

망막 뉴런의 광 반응은 수십 년 동안 기록되어 왔습니다. 초기 연구에서는 날카로운 전극을 사용하여 머드퍼피 망막 뉴런의 세포 내 기록을 만들었습니다¹. 1980년대에는 패치 클램프 기법이 발명되었고² 곧 시각 연구자들 사이에서 인기 있는 방법이 되었습니다^3,4. 머드퍼피(mudpuppy)와 물고기 망막 뉴런(fish retinal neuron)을 포함한 하등 척추동물의 단세포 기록은 시각 신호 처리 메커니즘의 해명에 기여한 인기 있는 방법이었다^5,6.

유전적 돌연변이 기술이 개발된 후, 쥐의 망막은 시력 연구자들에게 더 인기 있는 모델이 되었습니다^7-9. 포유류의 망막은 인간의 망막에 진화적으로 더 가깝기 때문에 하등 척추 동물보다 더 매력적이며, 질병 모델을 사용할 수 있는 기회가 있습니다. 그러나 쥐의 망막 세포는 작고 연약하기 때문에¹⁰ 어두운 방에서 망막 준비를 하고 패치 클램프 기록을 수행하는 것은 어려운 일입니다. 기술이 향상됨에 따라 영상 연구¹¹ 및 망막전위도(ERG)¹²와 같은 시각 신호 메커니즘을 연구하기 위한 다양한 접근 방식을 사용할 수 있게 되었습니다. 그럼에도 불구하고 패치 클램프 방법을 사용한 단일 세포 기록은 다른 방법에 비해 시간적으로나 공간적으로 매우 민감하기 때문에 여전히 중요합니다. 따라서 우리는 지속적으로 패치 클램프 기록을 수행하고 마우스 망막 절편 제제^13-15에서 시각적 신호 처리를 조사하는 방법을 개선했습니다.

이 비디오 자습서에서는 프로토콜에 중요한 팁이 제공됩니다. 좋은 녹음은 잘 준비해야만 얻을 수 있습니다. 동물 해부를 연습하고 견고한 패치 클램프 리그를 구축하면 대부분의 연구자가 성공적인 기록을 달성할 수 있습니다.

프로토콜

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

실험 솔루션 1. 준비

1. 실제 실험 전에 해부 솔루션을 일일 1 주를 준비합니다. 때문에 낮은 온도 ^(16)에서 강력한 완충 능력 망막 박리에 대한 HEPES 완충 용액을 사용합니다. (mm 단위)으로는 다음과 모든 화학 물질을 혼합 : 115의 NaCl, 2.5의 KCl, 2.5 _CaCl2를, 1.0의 MgCl _2, 10 HEPES, 28 포도당을. NaOH로 pH 7.4까지를 조정합니다. 일주에 냉장고까지의 솔루션을 유지합니다.
2. 기록 액 망막 ¹⁷ 제제 용으로 설계된 인공 뇌척수액 (ACSF)이다 에임스 '매체이다. 실험의 날에 의해, 튜브에 복귀 돌연변이 분말 (500 ml의 용액 4.4 g)을 달아. _또한,의 NaHCO3 (500 ml의 솔루션을위한 0.95 g)을 달아 및 혼합MES '분말.
3. 실험의 날에 의해 패치 클램프 레코딩을위한 세포 내 피펫 솔루션을 준비합니다. (mm 단위)으로는 다음과 모든 화학 물질을 혼합 : 111 K 글루코 네이트, 1.0 _CaCl2를, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10의 NaCl, 1.0의 MgCl _2, 5 ATP-㎎, 1.0 GTP - 나. KOH으로 pH를 7.2로 조정합니다. 기존의 주사​​기 필터 피펫 솔루션을 필터링합니다. ~ 500 μL 씩을 확인하고 냉장고 나 냉동고에 보관합니다.

실험의 날 2. 준비

1. O / N 어두운 적응 어두운 공간에서 - (남, 8 주 오래 된 4, C57BL / 6J 또는 유사한 배경) 밤은 실험 전에, 새장에 마우스를 놓습니다.
2. 해부를위한 준비 :
   1. 적어도 10 분 동안 산소, 유리 비커에 - (200 ml의 100) 얼음에 배치, 거품 솔루션을 해부 입력합니다.
   2. 망막 준비 저장 어둠 상자의 산소를 시작합니다.
   3. 재에 대한 그리스 레일 플라스틱 커버 슬립을 준비tinal 슬라이스 제제는 35mm 플라스틱 접시에 이들 각각을 놓고.
   4. 헬기 (조직 슬라이서)에 새로운 면도날을 연결합니다.
   5. 두 반으로 여과막을 잘라. 이것은 망막 슬라이스입니다.
   6. 해부 현미경 근처 해부 도구 및 전송 피펫을 맞 춥니 다. 각 도구를 쉽게 어두운 액세스 할 수 있도록 작업 영역은 잘 조직되어야한다.
3. 패치 클램프 레코딩을위한 준비 :
   1. 에임스 '가루와 _증류수의 NaHCO3 (에임스 4.4 g 및 _NaHCO3을 0.95g / 500㎖의 DDH ₂ O)를 용해. 혼합 산소 버블 에임스 중형 (95 % O ₂ 및 5 % CO ₂₎ 적어도 30 분 동안 기록 온도 레벨로 가열 (~ 35 ° C). 아직 버블 링 동안의 _NaHCO3와 7.4 pH를 조정합니다.
   2. 해부하는 동안 내부 피펫 솔루션을 녹여. 해동 후 세포 내 염색 0.01 %의 sulforhodamine의 B를 추가합니다.

3. 망막 해부

1. 어두운 방에서, 이산화탄소를 이용하여 양측 기흉 마우스를 안락사. 2 - 후 이산화탄소를 사용하여 3 분간, 마우스가 의식을 잃게 될 것이다.
2. 마우스가 더 이상 꼬리 핀치에 응답 할 때, 신속하게 눈을 명백히하다 없으며 플라스틱 접시에 차가운 해부 솔루션에 배치합니다. 동물의 죽음을 확인하기 위해 양측 기흉을 수행합니다. 빨리 어둠 상자에 접시에 눈을 저장합니다. 어둠의 절차를 수행하기 위해 적외선 뷰어를 사용합니다.
   참고 : 또는 이소 플루 란, 참수, 또는 자궁 경부 전위는 안락사에 사용할 수 있습니다. 안락사의 방법은 국립 보건 연구소 (NIH) 및 / 또는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따라야합니다.
3. 어두운 방에서, 해부 현미경 및 적외선 조명을 조정합니다. 현미경, 10cm 플라스틱 접시 w로 그 접시에서 눈을 전송냉각 해부 솔루션 i 번째. 지속적으로 튜브를 통해 거품 산소는 플라스틱 접시의 바닥에 배치. 너무 부족하지 않도록 유량을 조절하지만 절개를 방해 충분하지 있는지 확인합니다.
4. 각막과 렌즈 제거 :
   1. 마이크로 수술 칼 각막의 상단에 절개를합니다. 안구의 다른 쪽 끝에서 시신경을 잡고 이동하는 현상을 방지 할 수 있습니다. 수술 가위를 사용하여 절단을 확장합니다. 주위 몇 공막과 각막을 잘라.
   2. 미세 집게로 렌즈를 잡고 천천히 렌즈를 빼냅니다. 유리체가 렌즈를 분리하기에 너무 끈적 경우 가위로 절단 유리체.
   3. 눈 컵이 이루어지면, 부드럽게 작은 전송 피펫과 아이 컵에 차가운, 산소 해부 솔루션을 붓는다.
      참고 : 절개가 각막을 한 후 안구가 빠르게 움 추러 들게합니다. 그것은이 프로시 변형 눈으로 눈의 형상을 유지하는 것이 중요시저는 망막이 손상되어 망막 박리의 원인이됩니다.
5. 망막의 지느러미와 복부 측면을 확인 :
   참고 : 녹색 및 자외선 (UV)의 불균일 한 분포가 특정 망막 영역을 식별, ^{18 콘} 때문에 빛 응답 레코딩을위한 중요합니다.
   1. 시신경 유두 근처에 전달하는 망막 아이 컵을 가로 질러가는 라인을 확인합니다. 이 라인은 주로 시신경의 복부 측면을 가로 질러 통과; 다른 ¹⁹ 복부 동안 시신경 포함 측은 등쪽이다. 적외선 뷰어에서 명확 랜드 마크를 참조하십시오.
   2. 실험의 목적에 따라, 불필요한 측을 잘라. 이것은 아이 컵으로부터 망막을 분리 후 유용 할 것이다.
6. 유리체 제거 :
   1. 선택적으로, 15 분 동안 히알루로니다 제 (0.5 ㎎ / ㎖)와 눈 컵을 배양한다.
   2. 여분의 미세 집게로 유리체를 제거합니다. 유리체는 주로바닥과 눈 컵의 바깥 쪽 가장자리에 연결합니다. 조심스럽게 만지거나 망막을 파고하지 않고 제거합니다. 유리체가 단단히 아이 컵에 부착 할 수 있듯이, 눈 컵에서 망막 박리를 방지하기 위해 조심스럽게 제거합니다. 더 긴장 느낌되지 않을 때까지 당겨 계속합니다.
      주 :이 단계는 마우스를 해부 망막 특히 중요하다; 그러나, 이러한 쥐 또는 도마뱀 같은 다른 종의 망막에 대한 문제가 아니다.
7. 눈 컵에서 망막을 분리합니다. 공막을 잡고 부드럽게 집게의 뒷면을 사용하여 망막을 벗겨.
   참고 : 망막 준비를 전체 마운트는 분리 된 망막에서 할 수있다. 가장자리에서 3-4 컷을 확인하고 망막을 평평하게, 또는 여러 조각으로 망막을 잘라.
8. 망막 트림 및 망막의 불필요한 절반을 버리고 (단계 3.5). 같은 플라스틱 접시에 두 조각으로 남아있는 망막을 잘라. 망막의 각 부분의 경우, 수 있도록 가장자리를 잘라망막 슬래브 및 접는 자리를 떼어.
9. 큰 전송 피펫 (~ 2 ㎖)를 사용하여 유리 접시에 망막 슬래브를 전송합니다. 작은 피펫으로 용액을 과량 빨아 슬래브를 평탄화 여과지를 사용하고 빠르게 조직 위에 여과막의 조각을 배치.
   1. 작은 전송 피펫을 사용하여 필터 멤브레인 솔루션을 해부 한 방울을 배치합니다. 이 솔루션은 막 퍼져 때까지 ~ 15 초를 기다립니다. 이 시간 동안, 망막 조직 여과막 고집한다.
   2. 아래의 필터 주위에 더 차가운 해부 솔루션을 붓는다. 여과막과 망막 조직이 뜬다. 집게로 필터 멤브레인을 잡고 슬라이스 챔버에 배치합니다. 조직을 통해 솔루션을 해부 붓고, 어두운 상자에 준비를 저장합니다.
      참고 : 여기에 설명 된 절차는 매우 중요하다. 그것은 보장하기 위해 신속하게 다음 단계를 수행하는 것이 중요하다 필터 (MEM)에 망막 조직 스틱파괴 현상과 건조하지 않습니다.
10. 헬기를 사용하여 조각으로 망막 조직을 잘라. 약 200 μm의 두께는 패치 클램프 연구 가능하다.
11. 슬라이스 챔버 그리스 레일 플라스틱 커버 슬립을 놓습니다. 플라스틱 커버 슬립에 그리스 레일 위에 망막 슬라이스를 전송합니다. 횡단면 볼 수 있도록 슬라이스를 90 ° 회전합니다. 다음, 커버 슬립에 내려 여과막을 눌러 그리스 여과지의 측면을 커버.
    1. 슬라이스가 플라스틱 커버 슬립 상에 고정화 된 후, 커버 슬립을 잡아 35mm 플라스틱 접시에 옮긴다. 망막 준비 위에 차가운 해부 솔루션을 붓고 준비 잠수함. 지속적으로 산소해야 어두운 상자에 각각의 접시를 저장합니다.
       주 : 전체 절차는 여과막이 변형되지 않도록 조심스럽게 수행되어야한다. 그렇지 않으면, 슬라이스 망막 용이 여과막으로부터 분리한다.

4. 망막 슬라이스 준비에서 패치 클램프 녹음

1. 준비 기록 :
   1. 에임스 '매체와 총리는 관류 튜브. 튜브를 채울 때 모든 거품이 통과하도록 허용합니다.
   2. 풀러와 패치 클램프 녹음 피펫을 확인합니다. 피펫 팁이 채워 때까지 1 분 동안 피펫의 뒷면에있는 피펫 솔루션, 딥 피펫을 작성합니다. 다음에, 마이크로 피펫을 이용하여 필러의 피펫 ~ 1 / 3의 채우기. 촉촉한 피펫 상자에 각각의 펫을 저장합니다.
   3. 패치 클램프 녹음을위한 장비를 켜십시오; 컴퓨터, 앰프, CCD 카메라와 현미경을 포함.
2. 실내 조명을 차단합니다. 적외선 뷰어를 사용하여 현미경 스테이지 챔버 상 망막 슬라이스 준비를 놓습니다. 이 고정화 된 후, 연속 관류를 시작한다. 33-37 ° C에서 재관류 온도를 설정합니다.
3. CCD 카메라로 슬라이스 표면을 볼 수 있습니다. 대상 위치에 초점 위치를 목표 CELL 유형이 존재합니다. 패치 클램프 녹음을위한 건강한 보이는 셀 선택 (즉, 그것의 자연스러운 표면과 좋은 세포 모양이 있어야합니다).
4. 피펫 홀더에 기록 피펫을 놓습니다. 슬라이스 준비에 피펫을 사전. 그것이 슬라이스 제제 (~ 2mm 위)에 가까운 경우에는, 현미경 피펫 팁을 찾기. 피펫 팁은 현미경으로 볼되면, 타겟 셀을 향해 끝이 아래로 이동.
5. 앰프를 설정합니다. (제로) 0 MV / 0 펜실베니아 피펫을 조정하고 10 Hz에서 ~에 ~ 5 MV의 연속 전기 펄스를 시작합니다. 피펫 저항을 확인; 이상적인 저항은 대부분의 망막 신경 세포에 대한 5 ~ 10 MΩ입니다.
6. 끝에서 불고 시작합니다. 마우스 피스를 사용하거나 피펫은 목욕 솔루션으로 떨어지면 긍정적 인 압력을 적용, 주사기를 사용합니다. 끝이 표적 세포의 표면에있는 동안 연속으로 내부 솔루션을 날려.
   1. 양압 차에 작은 딤플을하면전자의 세포 표면, 약간의 팁을 발전 불고 중지합니다. 증가 할 전망 피펫 저항을 확인합니다. 그림 계속 증가하면두고 그것을> 1 GΩ (기가 시일)에 도달 할 때까지 저항을 모니터링한다. 저항이 자발적으로 증가하지 않는 경우가 될 때까지 기가 시일 부드럽게 부압을 적용한다.
7. 기가 시일이 달성 된 후, MV를 -70 잡고 잠재력을 변경합니다. 그런 다음, 간헐적으로 피펫 팁 내부의 막을 파열 부정적인 압력을 적용합니다. 전체 셀 구성이 이루어지면, 피펫 저항이 500 MΩ 1 GΩ 및 용량 성 전류가 볼 사이 일 수있다. 때로는 자발적인 시냅스 후 전류를 관찰 할 수있다.
8. -80에서 +40 MV에 IV 관계를 기록한다. 전압 게이트 된 채널의 종류는 세포 종류에 따라 활성화된다.
9. 기록 시냅스 전류 또는 전압을 빛-유발.

결과

대표적인 제제는 슬라이스 슬라이스 제제 평면에서 신경절 세포를 나타내는 감광체, 직선 위치에있다.도 1에 도시하지 않고, 여과지로부터 박리된다. 슬라이스가 기울어 진 경우, 제제의 일부만 어려운 패치 클램프 적절한 셀을 식별 할 수있는 초점이다. 레코딩을위한, 일반적으로 빛나는 표면을 갖는 좋은 소마, 심지어 둥근 형상 및 가시적 어두운 플라크를 선택하는 것이 중요하다. 전체 셀 구성이 이루어진 후, 슬라이스는 스텝 - 광 (도 2) 다음에 배경 광에 노출시켰다. 빛 유발 흥분성 시냅스 후 전위 (L-EPSPS)는 (타이밍이 노란색으로 표시된다) 단계 빛에 반응 유발했다. 피크 진폭과 세포 유형 및 하위 유형에 따라 변할 감쇠 시간. 신경절 세포는 밝은 자극 (그림 2 D & E)에 대한 응답으로 활동 전위를 생성합니다. CELL 형과 형태 학적 아형 생리 학적 기록 (오른쪽 그림 2) 후 sulfo...

토론

좋은 녹음은 좋은 망막 준비와 잘 설계된 패치 클램프 설정을 통해서만 달성할 수 있습니다. 위에서 설명한 모든 단계가 중요하지만 이 토론에서는 해부와 녹음 모두에 대한 몇 가지 중요한 단계를 강조합니다.

해부의 경우 냉각과 산소 공급이라는 두 가지가 특히 중요합니다. 눈을 적출한 후 산소 기포가 있고 냉각된 해부액이 있는 해부실에서 눈의 앞부분을 빠르게 제거하고 차가운 용액을 아이컵에 붓습니다. 망막 조직이 해부실에 있을 때 10분마다 차가운 용액을 조직에 부어야 합니다. 조직은 해부 중에 망막 조직을 당기거나 찌르지 않고 신속하게 절단해야 하므로 구조가 쉽게 손상될 수 있습니다. 좋은 해부 도구(날카로운 집게와 가위)를 사용하는 것도 중요합니다. 헬기는 빠른 조종이 가능하기 때문에 진동술만큼 효과적입니다. 조직을 절단할 때 잔여 유리체가 망막 구조를 손상시키기 때문에 가능한 한 효율적으로 유리체를 제거하려면 극세 겸자를 사용해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
생쥐 (28-60 일, 수컷)	잭슨 연구소	C57BL/6J 균주
에임스 '중간 분말	시그마	A1420	우수한
실체 현미경	니콘	SMZ745	우수한
해부 도구 : 겸자	Dumont	# 4, # 5, # 55	우수한
해부 도구 : 가위	Roboz	RS-5605
해부 도구 : 수술 칼	Surgistar	7514	우수한
면도날 (헬기 용)	EMS	71970	우수한
헬기	핸드메이드
적외선 뷰어	Night Owl Optics	NOBG1	밝은 시야를 보여줍니다. 작은 물체의 초점을 맞추는 것이 문제입니다.
Puller	Sutter	P-1000 (풀러 셔터 P-1000	은 우수하며 일관된 크기의 피펫을 만듭니다.
다크 박스	펠리칸	다크 박스	우수한
패치 클램프 시스템	Scientifica	슬라이스 스코프 2000	우수한 설정. 대부분의 주요 구성 요소가 하나의 패키지에 포함되어 있습니다. 미세 조작기는 훌륭합니다.
증폭기	분자 장치	multiclamp 700B	우수하고 쉬운 제어.
소프트웨어	Molecular Devices	pClamp 소프트웨어	우수하고 쉬운 제어.
광원 (LED)	쿨 LED	pE-2 4 채널 시스템	우수한
CCD 카메라	Q-이미징	Retiga 2000	우수한
패러데이 케이지	수제