방법 논문

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에 사카로 미세스 세 레비 시아

DOI:

10.3791/52428

⸱

2015년 2월 16일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

규제 단백질 분해는 거의 모든 세포의 기능에 매우 중요합니다. 분자 메커니즘 및 진핵 세포 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항에 대해 알려진 대부분은 처음 사카로 미세스 세 레비 시아 년에 설립되었습니다. 단백질 분해의 고전 분석은 생화학 펄스 추적 및 사이클로 헥 - 추적 방법에 의존했다. 이들 기술은 단백질 분해에 대한 민감성을 관찰하는 수단을 제공하지만, 이들은 힘들고, 시간 소모, 및 낮은 처리량이다. 이러한 접근 방법은 단백질 분해를 방지 또는 돌연변이 신속한 대규모 스크리닝 의무가 없다. 여기에서, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건 용이 한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석법을 설명한다. 이 분석에서, 특정 조건 하에서 선택적 성장에 필요한 리포터 효소 불안정한 단백질에 융합된다. 내생 세포를 리포터 효소가 결여되지만 융합 단백질이 실리 하에서 성장할 수있는 발현융합 단백질 안정화 만 뽑은 상태 (즉, 단백질 분해가 노출되어있는 경우). 여기에 설명 된 성장 분석에서, 야생형 및 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 돌연변이 효모 세포의 연속 희석이 선택적 및 비 선택적 매체에 발견된다. 선택적 성장 조건 하에서 주어진 돌연변이 열화 손상과 일치한다. 증가 된 단백질 풍부 생화학 적으로 확인해야합니다. 전기 영동 및 웨스턴 블 랏팅을위한 적합한 형태로 효모 단백질의 신속한 추출 방법도 설명된다. 생화학 적 분석을위한 단백질 추출을위한 간단한 프로토콜과 결합 단백질 안정성 성장 기반 판독, 단백질 분해에 대한 유전 적 요건의 신속한 식별을 용이하게한다. 이러한 기술들은 단명 다양한 단백질의 열화를 모니터링하도록 구성 될 수있다. 제시된 예에서, 히스티딘 생합성에 필요한 효소는 HIS3, 융합시켰다이 비정상적으로 소포체의 translocon을 종사 한 후 Deg1에 -Sec62. Deg1 -Sec62은 분해의 대상이된다. Deg1 -Sec62-HIS3 은닉 세포 단백질을 안정화시킨 때 선택적 조건 하에서 성장할 수 있었다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

선택적 단백질 분해 진핵 생명에 필수적이며, 변화된 단백질 분해는 여러 종류의 암, 퇴행성 신경 질환, 심혈관 질환, 낭포 성 섬유증을 포함하는 의료 1-5 조건의 수에 기여한다. 선택적인 단백질 분해를 촉매하는 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)는, 이러한 조건에 대한 6-10 새로운 치료 표적이다. 유비퀴틴 리가 제는 공유 결합 단백질 11 (76) - 아미노산 유비퀴틴의 폴리머를 연결합니다. polyubiquitin 체인으로 표시 한 단백질은 인정 ~ 2.5 megadalton 26S에 의해 12 프로 테아 proteolyzed 있습니다. 모델 진핵 생물 사카로 미세스 세 레비 시아 (신진 효모)에 시작된 연구는 진핵 세포에서 단백질 분해 메커니즘의 해명에 기초가되고있다. UPS의 첫 번째 시연 생리 기판은 MATα2 13 효모 전사 억제 자했다, UPS의 (14), 및 고도로 보존 된 많은 구성 요소가 처음 확인 된 또는 (예 15-26) 효모 특징으로하는 방법. 이 다목적 유전자 다루기 쉬운 모델 생물에서 만든 발견은 유비퀴틴 중재 저하의 보존 메커니즘에 중요한 통찰력을 지속적으로 제공 할 가능성이 높다.

대부분의 UPS 기판의 인식과 저하는 여러 단백질의 공동 작업이 필요합니다. 따라서, 주어진 불안정한 단백질의 조절 된 분해를 특징 짓는 중요한 목적은 단백질 분해에 대한 유전 적 요건을 결정하는 것이다. 효모 또는 포유 동물 세포에서 단백질 분해를 모니터링하기위한 고전 접근법 (예를 들어 펄스 - 체이스 및 사이클로 헥시 - 체이스 실험 27) 힘들고 시간 소모적이다. 이러한 유형의 방법은 단백질 분해를 검출하는 고감도 방법을 제공하지만, 이들은 단백질 분해 또는 대규모 screeni의 신속한 분석에 적합하지 않다단백질 분해를 방지 ng를 돌연변이. 여기에, 불안정한 단백질의 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 신속한 식별을위한 효모의 성장 기반 분석은 제공됩니다.

단백질 분해,이자 (또는 저하 신호)의 불안정한 단백질을 분석하는 효모의 성장 기반 방법에서는 특정 상황에서 효모의 성장에 필요한 단백질, 프레임, 융합된다. 결과는 관심 불안정한 단백질의 단백질 분해의 유전 적 요구 사항을 결정하는 강력한 도구로서 작용할 수 인공 기판이다. 편리하게는, 가장 일반적으로 사용되는 실험실 효모 균주 특정 아미노산 또는 질소 함유 염기 (예 20,28-30)의 생합성에 관여하는 대사 효소를 코딩하는 유전자의 돌연변이 패널 항구. 이 효소는 합성 효소에 참여 외생 제공 대사의 부재하에 세포 증식에​​ 필수적이다. 이러한불안정한 단백질의 분해를위한 성장 기반 기자가 이들이 융합로서 대사 효소에 따라서 기능을 할 수있다. 단백질 분해를 방지 돌연변이가 저하 기자를 숨겨 세포가 선택적 조건에서 성장할 수 있도록하기 때문에 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항을 용이하게 설명 될 수있다.

성장 장점은 특정 돌연변이 관심 단백질 풍부 증가 간접 지표이다. 그러나 직접 생화학 적 분석은 돌연변이가 아니라 간접적 또는 인공적인 원인을 통해보다 증가 된 단백질 수준을 통해 성장을 허용하는지 확인해야합니다. 풍부한 단백질에 돌연변이의 효과는 않으며 특정 돌연변이를 정박하지 않는 세포에서의 정상 상태의 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 될 수있다. 적합한 형태 효모 단백질의 신속하고 효율적인 추출 (수산화 나트륨 및 샘플 완충액으로 효모 세포의 연속 배양) 미국 방법웨스턴 블롯 분석을 위해도 (31)를 제시한다. 함께, 이러한 실험은 단백질 분해의 후보 레귤레이터의 신속한 식별을 용이하게한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 분해에 결함이있는 후보 돌연변이를 확인하기 위해 1. 효모의 성장 분석

  1. 리포터 대사 효소로, 프레임에서 불안정한 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질.
  2. 플라스미드 분자를 보유하는 세포 합성을위한 선택적인 정의 (SD) 최소 배지 5ml에 형질 전환 체를 접종한다. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
  3. 각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD 600)에서 광학 밀도를 측정한다.
    참고 : 하룻밤 배양 한 다음은, 문화의 세포 중 하나 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한의 OD에게 0.2 (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다.
  4. 세포에 희석을 시작으로 멸균 96 웰 플레이트에서 형질 전환 된 효모 세포의 6 배 희석액을 준비N OD 0.2 600. 96 웰 플레이트에 다른 행에 분석 할 각 효모 형질 전환 체를 놓습니다.
    1. 각 형질 전환 체의 경우, 200 μL의 최종 부피는 0.2 OD (600)에 셀을 희석 할 필요 밤새 배양의 체적을 계산한다. 200 μL에 볼륨을 가지고 멸균의 적절한 금액을 추가 열 1에 잘 대응에 하룻밤 문화의이 볼륨을 추가합니다.
    2. 효모의 각 행에 대해, 열 2, 3 및 4에 웰 멸균 수 125 μL를 추가한다.
      참고 : 개별 포장 멸균 96 웰 플레이트 멸균 뚜껑 포장 할 수있다. 뚜껑은이 단계에 분포 멸균 용 탱크로서 사용될 수있다. 이 멀티 채널 피펫으로 주어진 열의 모든 우물에 멸균을 동시에 전송할 수 있습니다.
    3. 피펫 팅에 의해 멀티 채널 피펫과 아래 첫 번째 열 (OD 0.2 (600)로 희석 효모)의 내용을 섞는다.
    4. TRANSF멀티 채널 피펫을 사용하여 열 2 열 1에서 효모의 25 μL, 어. 로 pipetting 아래로 섞는다. 전송 열 3 열이 25 μL, 그리고 3 열부터 4 열 25 μL (각 단계에서 잘 혼합).
  5. 멀티 채널 피펫으로 각 샘플을 섞는다. 가장 묽은에서 진행하는 것은 적어도 적절한 선택 배지를 포함하는 두 접시에 효모, 피펫 각 샘플의 4 μl를 열 희석한다. 플라스미드 선택 (이 판은 효모 안보 및 성장 제어 역할을) 유지 매체와 한 판을 사용합니다. 기자 효소에 융합 불안정한 단백질의 플라스미드 유지 보수 및 표현 선택 매체와 제 2 플레이트를 사용합니다. 효모가 빠르게 정착 때문에, 정기적으로 피펫 팅에 의해 아래로 세포를 혼합한다.
    참고 : 건조기 판은 더 쉽게 새로 제조 한 판보다 액체 흡수하기 때문에 이러한 실험을 권장합니다. 댐프 플레이트 LO 실온에서 인큐베이션하여 건조 될 수있다층류 후드에 2 일 또는 짧은 배양 - 1 w 습도. 층류 공기 유동은 벤치에 평행 인 경우, 플레이트 불균일하게 건조 할 수있다. 템플릿을 사용하면 쉽게 일반 거리에서 효모 세포를 발견 할 수 있습니다. 두 샘플 템플릿은 그림 1에 나와 있습니다.이, 인쇄 잘라하고, 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착되어 있습니다.
  6. 플레이트가 벤치 위에 건조하도록 허용합니다.
  7. 2-6일 30 ° C에서 접시를 품어.
  8. 배양 후 각 판의 사진.

figure-protocol-1
100 mm 한천 플레이트에 효모 세포에 얼룩을지게 그림 1. 템플릿. 이러한 템플릿은 멀티 채널 피펫과 정기적으로 거리에서 효모를 파악하고 용이하게 사용할 수있다. 템플릿은, 인쇄 잘라 및 페트리 접시 뚜껑의 안쪽에 부착 될 수있다. 성장 페트리 접시를 배치템플릿 매체 내부 뚜껑에 부착. 템플릿은 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시됩니다. 그것은 성장 분석에 사용되는 판 마찬가지로 방향을 추적하기 위해 한 단계로 표시하는 것이 좋습니다. 네 (A) 또는 오 (B) 효모 세포의 연속 희석이 제공됩니다 안보를위한 템플릿. 100-mm 템플릿이 그림의 인쇄 가능한 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

효모의 성장 분석 2. 생화학 확인

  1. 효모 세포 및 사후 알칼리성 단백질 추출의 성장 (31 수정)
    1. 불안정한 단백질을 코딩하는 플라스미드와 야생형과 돌연변이 효모 세포를 형질.
    2. 플라스미드 분자를 보유하는 세포 선택성 SD 배지 5ml에 접종 형질. 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
    3. 각 하룻밤 CU의 OD 600을 측정lture.
      참고 : 하룻밤 배양 한 다음, 셀 중 로그 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만, 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지 (단계 2.1.4)의 OD 600 희석을 허용하는 OD (600)에 도달한다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 효모 균주는 세포의 더 많은 수의 배양 시간보다 긴 밤, 또는 접종이 필요할 수 있습니다.
    4. 0.2 ml의 10에 신선한 선택 배지의 OD 600 효모 세포를 희석.
    5. 문화가 (중간 로그 성장에 IE) 0.8과 1.2 사이의 OD 600에 도달 할 때까지, 회전 또는 떨고, 30 ° C에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다.
      참고 : 관심의 불안정한 단백질이 조절 가능한 프로모터의 통제하에있는 경우, 단백질 발현 및 세포 수확의 유도의 최적의 타이밍은 이전의 연구 또는 경험적 관찰에 따라 달라질 수 있습니다.
    6. 15 ml의 원뿔 곡선 (이차 곡선)에 문화의 2.5 OD 600 단위를 수집실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 원심 분리하여 알루미늄 관. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
      주 : 600 부 1.0의 OD 600에서 배양액 1mL 효모 본의 양으로 정의된다 한 OD. V = 2.5 OD 600 단위 / 600 OD 측정 : 2.5 OD 600 단위 (V)을 수확하는 데 필요한 (ML)에서의 배양 부피는 다음 식을 사용하여 결정될 수있다
    7. 한 용액에 재현 탁 된 세포를 증류수. 마이크로 원심 튜브에 정지 세포를 전송합니다.
    8. 실온에서 30 초 동안 6500 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
    9. 100 μL에 재현 탁 세포가 다운되거나 와동 피펫 팅에 의해 증류수, 100 ㎕의 0.2 M NaOH를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다. 실온에서 5 분간 샘플을 부화.
    10. 18,000 X에서 원심 분리하여 (아직 단백질을 발표 여전히 가능한 아르하지 않은 대부분의) 펠렛 세포5 분 g. 피펫 또는 흡인에 의해 뜨는을 제거합니다.
    11. 로 pipetting 아래로 또는 와동에 의해, 세포를 용해됩니다 100 μL 1X 램 믈리 샘플 버퍼, - 50에 재현 탁 펠렛.
      주 : 원심 램 믈리 시료 완충액 세포의 후속 재 부유 다음 알칼리 상등액 제거는 글리신 러닝 버퍼 시스템과 웨스턴 블롯을 사용하여 나트륨 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)와 호환 pH에서 단백질을 추출한다.
    12. 완전 단백질 변성, 5 분 동안 95 ° C에서 배양 한 해물.
      참고 : 95 ° C에서 배양 할 때 집계가 발생하기 쉬운 단백질 (여러 횡단 세그먼트 예를 들면 단백질) 불용성 될 수 있습니다. 따라서 해물 낮은 온도에서 배양한다 (예를 들면 37 ° C - 70 ° C) 10 - 30 분, 같은 단백질의 경험적 분석, 결정 하였다.
    13. 5 분 동안 얼음 상에 배치하여 냉각 용 해물.
    14. 실온에서 1 분 18,000 XG에 원심 분리기 해물을 불용성 물질을 펠렛. 이전 이후의 웨스턴 블롯 분석 (2.2 절)을​​ SDS-PAGE에 의해 상층 액 (용해 추출 된 단백질)를 분리합니다. 또한, -20 ° C에서 저장 용 해물.
  2. 대표 웨스턴 블로 팅 프로토콜
    1. SDS-PAGE 젤에 해물의 경험적으로 결정 볼륨을로드합니다.
    2. 염료 앞까지 200 V에서 젤을 실행 겔의 바닥에 도달했습니다.
    3. 4 ℃에서 90 분 - 60 20 V 젖은 송금 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 겔에서 단백질을 전송합니다.
    4. 4 ℃에서 하룻밤 동안 실온에서 1 시간 동안, 흔들거나, TBS 버퍼 (TBS)에서 5 % 탈지 우유에서 배양함으로써 차단 막.
    5. 차단 솔루션 가만히 따르다.
    6. 방 테에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (TBS / T)와 TBS에서 1 % 탈지 우유 (또는 에피토프 태그) 가장 큰 관심의 단백질에 특이적인 항체와 멤브레인을 품어mperature, 락.
    7. 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
    8. 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션.
      참고 : 형광 물질이 빛에 민감한 때문에, 형광 접합 된 항체의 희석이 어둠 속에서 준비를해야합니다. 또한, 형광 - 복합 항체의 존재 막 부화는 차광 용기에 발생한다. 이 알루미늄 포일 인큐베이션 트레이를 배치함으로써 달성 될 수있다.
    9. 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
    10. 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득.
    11. 멤브레인을 묘화 한 후, 부하에 특이 차 항체와 함께 막을 인큐베이션락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지 우유 단백질을 제어 보내고.
    12. 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
    13. 락, 실온에서 1 시간 동안 TBS / T 중 1 % 탈지유 적절한 형광 공역 이차 항체와 함께 막을 인큐베이션.
    14. 항체 솔루션을 가만히 따르다하고, 락, 실온에서 TBS / T로 막 3 × 5 분을 씻는다.
    15. 제조업체의 권장 사항에 따라, 리튬 고전 오디세이 (CLx)에서는을 사용하여 막과 이미지 스튜디오 소프트웨어 (또는 비교 영상 장비 및 소프트웨어)의 이미지를 획득.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법을 설명하기 위해, HIS3 효소가 모델 소포체 (ER) -associated 저하의 카르복시 말단에 융합 된 (ERAD) 기판, Deg1 -Sec62 (그림 2A) Deg1 -Sec62-HIS3를 만들 수 있습니다 (그림 3) . Deg1 -Sec62는 translocon와 지속, 비정상적인 관계를 다음 타겟으로 ERAD 기판의 새로운 클래스의 창립 멤버이고, ER 막 32-34에서 단백질을 이동 주로 담당하는 채널입니다. 이러한 불안정한 단백질은 잠정적으로 기판 (translocon 관련에 대한) ERAD-T라고되어있다. 이전의 연구는 비정상적인 translocon 참여시, Deg1 -Sec62가 Hrd1 유비퀴틴 리가 아제 (그림 2B-D) (32), (34), (35)에 의해 분해를 대상으로, 나타냅니다. 다른 Hrd1 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 제시된 방법론은 빠른 결정과 효모 세포에서 단백질 분해에 대한 유전 적 요구 사항의 생화학 적 확인을 할 수 있습니다. 이 실험은 () (예 : 41 ~ 44을, 처리, 저장 및 효모 세포 조작을위한 프로토콜의 효모 생물학의 여러 우수 리뷰 및 컴파일 유기체에 새로운 연구자에 사용할 수있는) 유틸리티 및 전원 효모의 모델 진핵 생물 유기체 등을 강조 표시합니다. 기술은 용이하게 단백질의 다양한 클래스의 열화 풍부 조사에 적용될 수있다. 예를 들어, 다른 불안정한 세포질, 핵 및 ER의 내강과 막 관통 단백질 45-49의 열화 메카니즘을 특성화이 전략을 이용했다.

몇 가지 요인이 불안정한 단백질에 융합 대사 효소의 선택에 고려되어야한다. 먼저, 유전자의 기능 버전이 효소를 코딩하지 것이 중요숙주 게놈에 존재. (불안정한 단백질이 실제로 성능이 저하 된 경우 선택적 조건 즉, 성장)을 거짓 긍정적 인 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는지지하고 열정적 인 연구 환경을 제공하기 위해 루벤스 타인 실험실의 현재와 전 회원을 감사드립니다. 우리는 프로토콜 최적화에 도움 라이언 T. 깁슨 감사합니다. 우리는 효모 균주 및 플라스미드에 대한 마크 Hochstrasser (예일 대학)과 디터 늑대 (Universität의 슈투트가르트) 감사합니다. 우리는이 원고의 선명도와 유틸리티 개선에 도움을 준 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 SGW에 시그마 사이의 볼 주립 대학의 장에서 연구 수상에 의해 지원되었다, 볼 주립 대학에서 국민 건강 보조금 연구소 (R15 GM111713) EMR에, EMR에 볼 주립 대학 바램이 연구 상, 자금 사무장의 사무실과 생물학과.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
원하는 효모 균주, 플라스미드, 표준 배지 및 완충액 성분원하는 돌연변이가 있는 효모 균주가 연구자의 실험실에서 생성될 수 있습니다. 야생형 효모 및 다양한 돌연변이도 상업적으로 이용 가능합니다(GE 헬스케어에서 제공하는 예: ). 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드는 연구자의 실험실에서 생성될 수 있습니다.
3-아미노-1H-1,2,4-triazoleFisher ScientificAC264571000His3 효소의 경쟁적 억제제. His3 리포터 구조체를 사용하여 성장 분석의 엄격성을 높이기 위해 배지에 포함될 수 있습니다.
Endoglycosidase H (Streptomyces plicatus)Roche11088726001는 단백질의 N-글리코실화를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 1x Laemmli 샘플 버퍼에서 발견되는 SDS 및 베타-메르캅토에탄올 농도와 호환됩니다.
일회용 붕규산 유리관Fisher Scientific14-961-32다양한 제조업체에서 사용 가능
온도 조절 인큐베이터(예: Heratherm 인큐베이터 모델 IMH180)Dot Scientific51028068다양한 제조업체에서 사용 가능
New Brunswick 18mm 튜브(튜브 롤러)용 교체 가능 드럼NewBrunswickM1053-0450튜브 롤러는 현탁액 효모 세포의 야간 효모 스타터 배양을 유지하는 데 권장됩니다. 플랫폼 셰이커 또는 튜브 롤러는 서스펜션에서 더 큰 배양을 유지하는 데 사용할 수 있습니다.
New Brunswick TC-7 롤러 드럼 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004와 함께 사용하기 위해
제조사에서 사용 가능
멸균 96-웰 플랫 바텀 마이크로테스트 플레이트와 뚜껑이 개별적으로 포장된Sarstedt82.1581.001다양한 제조사에서 사용 가능
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & 뮤; lGilsonF14401다양한 제조사에서 사용 가능
 
 
 

 
[헤더]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403단일 채널 및 다중 채널 피펫터는 프로토콜의 다양한 단계에서 사용됩니다. 멀티채널 파이펫터는 여러 단계에서 파이펫팅 부담을 줄여주지만, 단일 채널 파이펫터는 전체 프로토콜에 걸쳐 사용될 수 있습니다. 다양한 제조업체에서 사용할 수 있습니다.
Centrifuge 5430Eppendorf5427 000.216로터는 1.5 및 2.0 ml 마이크로 원심분리기 튜브를 장착할 수 있습니다. 로터는 15ml 및 50ml 원추형 튜브를 수용하는 로터로 교체할 수 있습니다.
플레이트 이미징 시스템(예: Gel Doc XR+ 시스템)Bio-Rad170-8195정교한 이미징 시스템, 컴퓨터 스캐너 및 카메라 폰을 포함한 다양한 시스템을 사용하여 플레이트를 이미징할 수 있습니다.
고정각 로터 F-35-6-30, 뚜껑 및 어댑터, 원심분리기 모델 5430/R, 15/50 ml 코니컬 튜브, 6-PlaceEppendorfF-35-6-30
15 ml 스크린 인쇄 스크류 캡 튜브 17 x 20 mm 원추형, 폴리프로필렌Sarstedt62.554.205다양한 제조업체 제공
1.5 ml flex-tube, PCR clean, 천연 마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf22364120다양한 제품 제공 제조 업체
아날로그 드라이 배스 히터피셔 사이언티픽1172011AQ핫 플레이트가있는 끓는 물 배스는 단백질
SDS-PAGE 실행 및 전송 장치, 전원 공급 장치 및 이미징 장비 또는 SDS-PAGE 및 멤브레인으로의 전송을위한 암실을실험실 및 응용
따라 다릅니다.웨스턴 블롯 이미징 시스템(예: Li-Cor Odyssey CLx 스캐너 및 Image Studio 소프트웨어)Li-Cor9140-01실험실 및 응용 프로그램에 따라 다름
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer MembranesFisher ScientificIPFL00010실험실 및 응용 프로그램에 따라 다름
1차 항체(예: 포스포글리세레이트 키나아제(Pgk1) 단클론 항체, mouse (clone 22C5D8))Life Technologies459250실험실 및 어플리케이션에 따라 다름
2차 항체 (예: Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))LifeTechnologiesA-21065실험실 및 어플리케이션에 따라 다름
의 재조합 형태 튜브 롤러 SmartSpec Plus 분광광도계 Bio-Rad 170-2525 다양한 변성시키는 데 사용할 수도 있습니다 프로그램에

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

관련 논문